Введение к работе
Актуальность проблемы.
«Ковалентный катализ» является одним из основополагающих механизмов, обеспечивающих уникальные свойства ферментов как наиболее эффективных биокатализаторов. Разработка путей создания искусственных ферментов, способных осуществлять ковалентный катализ, является актуальной задачей энзимологии, биохимии и молекулярной биологии. Решение такой задачи может помочь понять пути эволюции биокаталитических функций. Создание искусственных биокатализаторов может найти так же практическое применение в фармацевтике и биотехнологии. Стратегии их получения в последнее время расширились до функциональной селекции комбинаторных библиотек диверсифицированных белковых доменов. Лиганды, способные взаимодействовать с активным центром ферментов, в том числе аналоги переходных состояний реакции, конформационные ингибиторы и суицидальные субстраты/ингибиторы, были использованы для аффинного и ковалентного отбора функциональных молекул ферментов. Способность ферментов образовывать ковалентные комплексы с механизм-зависимыми ингибиторами позволяет проводить их отбор посредством нуклеофильных остатков, принимающих непосредственное участие в «ковалентном катализе». Эффективная дискриминация на основании такой функциональной реакционной способности имеет широкое применение для идентификации и селекции потенциальных биокатализаторов.
Каталитические антитела (абзимы) - новый тип неферментативных биокатализаторов -представляют интерес как с точки зрения исследования структурно-функциональных закономерностей, обуславливающих их каталитическую функцию, так и с позиций исследования механизма биокатализа, в частности изучения кинетических закономерностей исследуемых превращений. Эта перспективная область науки развивается чрезвычайно бурно и сочетает в себе элементы иммунологии, энзимологии, молекулярной биологии, органической химии и генетической инженерии. Структурно-функциональный анализ искусственных биокатализаторов на основе антител может обеспечить пути познания «эволюционно совершенного» биокатализатора. Направленный дизайн каталитических антител поможет создать методологию получения биокатализаторов заданной специфичности. В настоящей работе сделана попытка получить антитела, с каталитической функцией используя механизм-зависимые ингибиторы сериновых гидролаз в качестве специфических «ловушек» способных взаимодействовать с активными белковыми молекулами. В качестве источника каталитических
антител были использованы три лини мышей MRL, NZB/NZW и SJL/J, являющихся моделями различных аутоиммунных заболеваний, а так же полусинтетическая библиотека генов иммуноглобулинов человека.
Цель и задачи исследования:
Целью настоящей работы являлось получение каталитических антител, способных осуществлять "ковалентный катализ" и гидролизовать амидную связь, а так же структурно-функциональный анализ полученных антител. Для выполнения работы были сформулированы следующие задачи: 1) Провести реакционную иммунизацию аутоиммунных мышей линий MRL, SJL и NZB/NZW гаптеном LAEEEV-Phos, конъюгированным с белком KLH. Изучить специфичность и каталитическую активность полученных в результате иммунизации антител. 2)Осуществить химическую селекцию полу синтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека на биотинилированный п-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонат (Bt-X). 3) Исследовать каталитическую активность рекомбинантных одноцепочечных антител и провести их структурно-функциональный анализ.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В настоящей работе проведена реакционная иммунизация пептидил дифенил фосфонатом (LAEEE-VPhos). Впервые показано, что полученные поликлональные антитела обладают специфичностью по отношению к пептидному фрагменту «реакционного» гаптена и способны ковалентно взаимодействовать с фосфонатной составляющей, являющейся суицидальным ингибитором сериновых протеаз. Разработан метод получения специфичных искусственных биокатализаторов, основанный на иммунизации аутоиммунных модельных животных реакционно-способными гаптенами и получены их кинетические характеристики.
Проведена селекция полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека на способность ковалентно взаимодействовать с суицидальным ингибитором сериновых гидролаз (п-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонат). Получены рекомбинантные одноцепочечные фрагменты антител ковалентно взаимодействующие с необратимыми ингибиторами сериновых гидролаз. Определены аминокислотные остатки, участвующие в «ковалентном катализе». Показано, что отобранные рекомбинантные антитела могут осуществлять катализ гидролиза амидной связи.
Биокатализаторы иммуноглобулиновой природы могут быть применены для терапии различных заболеваний. Среди потенциальных мишеней каталитических антител можно назвать
поверхностные белки вирионов, цитокины, различные патогены белковой природы. Терапевтические средства на основе каталитических антител могут обладать рядом важных преимуществ, среди которых высокая специфичность связывания мишени и возможность длительного существования в кровотоке.
Кроме того, антитела, способные ковалентно взаимодействовать с токсичными фосфорорганическими соединениями, могут выступать в качестве специфических «каталитических акцепторов» или «ловушек» для фосфорорганических соединений -отравляющих веществ (ОВ), и их аналогов. В течение многих лет предпринимаются попытки получить эффективные антидоты к этим отравляющим веществам. В их качестве может выступать ацетилхолинэстераза, однако гораздо эффективнее представляется использование антител, имитирующих способность фермента являться специфическими акцепторами этих соединений. Свойства антител делают их идеальным инструментом для дизайна диагностических агентов нового поколения, основанных на технологии рекомбинантной ДНК.
Публикация и апробация работы. По теме диссертации опубликованы 4 статьи. Результаты диссертации были представлены на 20-ом IUMBM Международном Конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Киото, 2006), ХУШ зимней молодежной научной школе "Перспективные Направления Физико-химической Биологии и Биотехнологии" (Москва, 2006), Международной Конференции Биокатализ 2005 (С.-Петербург - Кижи - Валаам, 2005).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,
обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы.
Диссертация изложена на страницах и содержит рисунков и таблицы.
