Содержание к диссертации
Введение
1. Основные компоненты, входящие в состав растительной биомассы 13
1.1. Строение и свойства целлюлозы как главного компонента растительной биомассы 14
1.2. Другие полисахариды растений и лигнин 19
1.2.1. Гемицеллюлозы 19
1.2.2. Пектины и Р-глюканы 27
1.2.3. Лигнин 30
2. Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты 33
2.1. Распространение и классификация р-1,4-глюканаз (целлюлаз и ксилоглюканаз) 33
2.2. Особенности молекулярного строения и механизм действия целлюлаз 38
2.2.1. Бифункциональная организация молекул грибных целлюлаз 38
2.2.2. Механизм действия целлюлазного комплекса 53
2.3. Микроскопические грибы как продуценты целлюлолитических ферментов 58
2.4. Свойства грибных целлюлаз 65
3. Основные направления применения целлюлаз 73
3.1. Осахаривапие лигноцеллюлозного сырья 74
3.1.1. Источники целлюлозосодержащего сырья и его предобработка 74
3.1.2. Аппаратурное оформление процессов ферментативного гидролиза целлюлозы 80
3.2. Ферментная обработка текстильных материалов 83
3.3. Применение целлюлаз и сопутствующих им ферментов в сельском хозяйстве и пищевой промышленности 88
4. Объекты исследования и методы экспериментов 92
4.1. Использованные ферменты 92
4.2. Субстраты и реактивы 94
4.3. Методы определения Сахаров и концентрации белка 96
4.4. Методы определения активности ферментов 97
4.5. Использование окрашенной целлюлозы для исследования ингибирования целлюлаз продуктами реакции 99
4.6. Методы выделения и очистки ферментов 99
4.7. Определение адсорбционных характеристик ферментов 101
4.8. Исследование термостабильности ферментов., 101
4.9. Исследование трансгликозилирования ЦБГІ 102
4.10. Масс-спектрометрический анализ пептидов и белков 102
4.11. Анализ молекулярно-массовото распределения продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов 103
4.12. Исследование кинетики ферментативного гидролиза целлюлозы в ячейках с перемешиванием и в реакторах различного типа 104
4.13. Численные методы решения дифференциальных уравнений и определения кинетических параметров 105
4.14. Методы иммобилизации р-глюкозидазы и использование иммобилизованного фермента 107
4.15. Оценка способности целлюлаз к биодепигментации джинсовой ткани 109
4.16. Определение индекса ресорбции индиго 112
4.17. Исследование взаимодействия индиго с аминокислотами и белками 114
4.18. Оценка способности ферментов к биоотварке («биоскорингу») суровой хлопчатобумажной ткани 115
5. Целлюлазный комплекс гриба chrysosporium lucknowense 117
5.1. Общая характеристика ферментного комплекса С. lucknowense 118
5.2. Субстратная специфичность, классификация и свойства эндоглюканаз и целлобиогидролаз ,.127
5.3. Целлобиогидролазы 1а и lb (Се17А и Се17В) из 7-й семьи гликозид-гидролаз , 135
5.3.1. ЦБГ 1а(Се17А): аминокислотная последовательность, молекулярные характеристики, кинетика действия и свойства разных форм фермента 135
5.3.2. ЦБГ lb (CeI7B): пептидный «фингерпринт» фермента и гомология с другими целлюлазами 154
5.4. Целлобиогидролазы Па и ПЬ (СеІбА и Се16В) из 6-й семьи гликозид-гидролаз 157
5.4.1. Аминокислотная последовательность и особенности молекулярного строения ЦБГ На (СеІбА) 157
5.4.2. Пептидный (масс-спектрометрический) анализ ЦБГ ИЬ (СеІбВ) и гомология с другими целлюлазами 162
5.5. Низкомолекулярные эндоглюканазы ЭГIII (Се112А) и ЭГ V (Се145А): аминокислотные последовательности, гомология и моделирование трехмерных структур 165
5.6. Масс-спектрометрический и пептидный анализ высокомолекулярных эндоглюканаз (Се15А, Се16С, Се17С) 172
5.7. Специфичные ксилоглюканазы С. lucknowense, Т. reesei и A. japonicus как представители нового класса гликозид-гидролаз 177
5.7.1. Пептидный (масс-спектрометрический) анализ ксилоглкжаназ 179
5.7.2. Субстратная специфичность и основные свойства ксилоглюканаз 187
5.7.3. Тип действия ксилоглюканаз на полимерные субстраты 189
5.7.4. Кинетика гидролиза ксилоглюкана и состав конечных продуктов 193
6. Ингибирование продуктами реакции и транс- гликозилирование при катализе целлюлолитическими ферментами 200
6.1. Теоретический анализ ингибирования целлюлаз продуктами реакции: оценка влияния различных факторов 200
6.2. Использование окрашенной целлюлозы для изучения ингибирования целлюлаз продуктами гидролиза 215
6.3. Реакции трансгликозилирования, катализируемые целлобиогидролазой I из Т. longibrachiatum 221
7. Применение целлюлаз для осахаривания целлюлозосодержащих материалов 227
7.1. Сравнение осахаривающей способности различных препаратов целлюлаз...228
7.2. Математическое моделирование ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы и оценка влияния различных факторов на кинетику процесса 242
7.3. Ферментативный гидролиз целлюлозы в реакторе с интенсивным массообменом на базе плоского двухстороннего электромагнитного индуктора 252
7.4. Ферментативный гидролиз целлюлозы в реакторах с виброперемешиванием 266
7.5. Применение иммобилизованной р-глюкозидазы для обработки
гидролизатов целлюлозы с высоким содержанием целлобиозы 275
8. Применение «тополитических» ферментов для обработки текстильных материалов 289
8.1. Сравнение осахаривающей и тополитической активности различных ферментных препаратов и очищенных индивидуальных целлюлаз 290
8.2. Адсорбционная способность ферментов как основной фактор, влияющий на ресорбцию индиго в процессе биодепигментации джинсовой ткани 300
8.3. Особенности молекулярного строения целлюлаз, определяющие эффективность их действия при ферментативной депигментации джинсовой ткани 307
8.4. Эффективные ферментные препараты на основе ЭГ III P. verruculosum и ЭГ V С. lucknowense для депигментации джинсовых изделий 322
8.4.1. Штаммы и ферментные препараты на основе ЭГ III P. verruculosum 322
8.4.2. Белковая инженерия ЭГШР. verruculosum 329
8.4.3. Штаммы и ферментные препараты на основе ЭГ V С. lucknowense 334
8.5. Биоотварка («биоскоринг») суровой хлопчатобумажной ткани с использованием препаратов целлюлаз 338
Выводы 355
- Другие полисахариды растений и лигнин
- Механизм действия целлюлазного комплекса
- Аппаратурное оформление процессов ферментативного гидролиза целлюлозы
- Исследование трансгликозилирования ЦБГІ
Введение к работе
Современный этап развития физико-химической энзимологии имеет две характерные особенности. С одной стороны, происходит накопление и развитие фундаментальных знаний, осуществляется углубленное изучение механизма действия ферментов и ферментных систем, выявление характерных особенностей их функционирования. С другой стороны, активизируются усилия, направленные на поиск возможности использования биокатализаторов в различных областях технологии. Принципы биокатализа, биотрансформации веществ все более широко применяются для реализации новых биотехнологических процессов, решения насущных задач, связанных с переходом на новые источники сырья и энергии, для разработки прогрессивных методов утилизации отходов, а также для замены традиционных химических процессов на биокаталитические, которые протекают в более мягких условиях и гораздо более безопасны с точки зрения экологии.
Целлюлолитические ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы -самого распространенного биополимера на Земле, по праву занимают центральное место в круговороте органического углерода. Основными микроорганизмами, продуцирующими целлюлазы, являются грибы - возбудители мягкой, белой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий. Поэтому не случайно, начиная с середины прошлого века, во многих странах мира стали проводиться исследования целлюлаз.
Резкое увеличение интенсивности подобных исследований произошло в 1970-е годы в США и странах Западной Европы из-за разразившегося энергетического кризиса, связанного с резким повышением цен на нефть и другие энергоносители [1]. Целлюлоза растительной биомассы представляет собой практически неисчерпаемый источник возобновляемого сырья, которое может быть конвертировано ферментативным путем в глюкозу. В свою очередь, глюкоза является незаменимым сырьем для микробиологических процессов получения жидких и газообразных видов топлива (этанола, бутанола, этилена и др.), органических и аминокислот, кормового белка и многих других полезных продуктов микробиологического синтеза. Общие запасы на Земном шаре возобновляемого сырья, представляющего собой растительную биомассу, оцениваются в 800-1000 млрд. т, причем ежегодно в результате фиксации 10 кал солнечной энергии образуется примерно 50 млрд. т биомассы, а также накапливается 4-5 млрд. т
отходов или вторичных продуктов промышленной и сельскохозяйственной переработки растений и древесины [1,2]. Таким образом, в будущем растительная биомасса может играть ту роль, которая в настоящее время принадлежит нефти.
Прогрессирующий дефицит певозобновляемых источников энергии и материалов наблюдается и в настоящее время. В последние годы интерес к биоэтанолу и другим видам топлива из лигноцеллюлозного сырья вновь резко повысился из-за дальнейшего роста цен на нефть, а также в связи с Киотским соглашением 1997 г., направленным на снижение выброса в атмосферу газов, вызывающих парниковый эффект. В отличие от ископаемых видов топлива, биоэтанол и другие виды топлива из возобновляемого растительного сырья не приводят к накоплению углекислого газа в атмосфере, т.к. он вновь превращается в кислород в процессе фотосинтеза, осуществляемого растениями (т.е. происходит круговорот СО2/О2 при параллельном возобновлении целлюлозы и других компонентов растительной биомассы).
Таким образом, помимо фундаментальных исследований в области целлюлолитических ферментов, направленных на выяснение биохимических и физико-химических закономерностей биодеградации целлюлозы в природе, механизмов действия грибных и бактериальных ферментов, в последние 30 лет наиболее активно развивались прикладные исследования в области ферментативного гидролиза целлюлозы, а также разработки, направленные на поиск и получение новых штаммов - суперпродуцентов целлюлаз. При этом основные усилия были направлены на поиск и изучение ферментов, способных наиболее эффективно и полно разрушать целлюлозу до растворимых Сахаров и в итоге - до мономера (глюкозы).
С конца 1980-х годов целлюлазы стали активно применяться для обработки текстильных изделий и материалов [3,4]. Первым таким процессом стала ферментная обработка джинсовых изделий, приводящая к частичному удалению красителя с поверхности ткани, в результате которой изделия приобретают внешний вид «вареных джинсов». В течение нескольких лет ферменты практически заменили пемзу и химические агенты, применявшиеся для этой цели ранее. Позднее целлюлазы стали широко использоваться для биополировки трикотажа и изделий на основе хлопчатобумажных и смесовых тканей. В результате такой обработки с поверхности материала удаляются ворсинки и неровности, в результате чего материал становится более гладким, приятным на ощупь, и после серии стирок на
нем не происходит образования «катышков» (пилей), что повышает потребительские свойства изделий. Наконец, в последние годы стало развиваться направление применения целлюлаз (совместно с пектиназами) для биоотварки («биоскоринга») суровых хлопчатобумажных тканей с целью увеличения смачиваемости целлюлозных волокон, что облегчает окрашивание материала на последующих стадиях технологического процесса. Такая обработка является необходимой стадией в текстильной промышленности, однако в течение многих столетий отварка производится в горячем растворе щелочи, приводя к быстрой коррозии оборудования и вредным выбросам в окружающую среду.
В последнее десятилетие целлюлазы также стали активно использоваться в качестве добавок к детергентам и моющим средствам [3,4] для того, чтобы воздействуя при стирке на текстильные материалы, содержащие в своем составе целлюлозные волокна, облегчить удаление грязей за счет гидролиза части поверхностных волокон и предотвратить образование пилей.
В отличие от ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов, где ферменты должны обладать максимальной «агрессивностью» по отношению к полимерному субстрату (высокой сахаролитической активностью), в процессах биообработки текстиля (в том числе, при стирке современными моющими средствами) требуются целлюлазы, способные мягко воздействовать на поверхность волокон, не приводя к глубокой деструкции целлюлозной матрицы, т. е. так называемые «тополитические» ферменты.
Среди других областей применения целлюлолитических ферментов следует отметить их использование в качестве добавок к кормам животных и птиц для разрушения некрахмальных полисахаридов [3,4]. В данном случае, как правило, используются мультиферментные препараты, содержащие широкий спектр карбогидраз, т.е. не только целлюлазы, но и ксиланазы, р-глюканазы, пектиназы. Например, добавка таких препаратов в составе премиксов к комбикормам в птицеводстве позволяет не только повысить их усвояемость, но и использовать кормовые диеты на основе таких трудноусвояемых видов злаков, как рожь и ячмень.
Специфика применения целлюлолитических ферментов в новых технологиях часто требует, чтобы ферменты обладали высокой активностью не только в кислой среде (при рН 4-5), что типично для грибных целлюлаз, но также и в нейтральной и слабощелочной среде. Поэтому в последнее время различными научными и
производственными коллективами ведется интенсивный поиск нейтральных и щелочных целлюлаз.
Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз различные штаммы грибов рода Trichoderma (Т. reeseU Т. viride, Т. hngibrachiatum) играют ведущую роль [3]. Это обусловлено их высокой секреторной способностью, а также разнообразием продуцируемых ферментов с различной субстратной специфичностью, что делает эти продуценты универсальным объектом для использования по различным направлениям. Препараты целлюлаз на основе грибов Trichoderma выпускаются во многих странах ведущими компаниями -производителями промышленных ферментов, в частности, Novozymes (Дания), Genencor International (США), Iogen (Канада), PrimAlko (Финляндия), Rohm Gmbh (ФРГ), Meiji Seika Kaisha Ltd. и ShinNihon Chemical Co. (Япония) и др. В последние годы в связи с бурным развитием «текстильного» направления целлюлаз некоторыми компаниями стали производиться ферментные препараты на основе других грибных продуцентов, оптимизированные для использования в конкретных биотехнологических процессах. Например, на основе грибного продуцента Humicola insolens фирмой Novozymes (Дания) производятся ферментные препараты серии Denimax для «биостонинга» джинсовых изделий. Для этой же цели выпускаются специальные ферментные препараты фирмой Meiji (Япония). В отличие от целлюлаз Trichoderma указанные ферменты функционируют в нейтральной области рН.
По оценкам зарубежных специалистов общий объем продаж промышленных ферментов на мировом рынке должен составить в 2005 г. от 1,7 до 2 млрд. долларов США, при этом доля целлюлаз может составить 15-20% [3,4].
В СССР в 1970-1980-е годы микробиологическая промышленность также производила в промышленных масштабах или в виде опытно-промышленных партий ферментные препараты целлюлаз - такие как Целловиридин ГЗх (Т. viride), Целлобранин ПОх (Т. longibrachiatum), Целлолигнорин П10х (Т. lignorum), Целлокандин ПОх (Geotrichum candidum) и некоторые другие [5-7]. Несмотря на то, что по продуктивности секреции внеклеточного (целлюлолитического) белка и удельной целлюлазной активности указанные продуценты и ферментные препараты на их основе, как правило, уступали зарубежным аналогам, с точки зрения качества целлюлазного комплекса (т.е. набора целлюлаз с различной специфичностью) отечественные препараты мало чем от них отличались, а иногда обладали более интересными свойствами, К середине 1990-х годов из-за распада СССР и общего
экономического кризиса производство ферментных препаратов на большинстве биохимических заводов стран СНГ прекратилось.
Начиная с конца 1980-х годов, в Лаборатории физико-химии ферментативной трансформации полимеров кафедры химической энзимологии МГУ им. М.В.Ломоносова совместно с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН в рамках Государственной научно-технической программы «Новейшие направления биоинженерии» велись разработки, направленные на поиск новых перспективных продуцентов грибных целлюлаз, усовершенствование существующих штаммов микроорганизмов, повышение удельной активности секретируемых ферментных комплексов, а также использование препаратов целлюлаз для биокопверсии лигноцеллюлозного растительного сырья в различные полезные продукты. В 1991 г. на основе штамма Т. reesei 18.2КК на Приволжском биохимическом заводе при участии кафедры химической энзимологии МГУ было налажено производство ферментного препарата Целловиридин А (взамен менее продуктивного штамма Т. viride, на основе которого до этого производился Целловиридин ГЗх). Несмотря на то, что к середине 1990-х годов на Приволжском заводе производство данного ферментного препарата прекратилось, оно в дальнейшем было возобновлено на ряде биохимических заводов России и бывших республик СССР (препараты Целловиридин Г20х и Г2х). В течение последних 15 лет в ИБФМ РАН путем селекции и мутаногенеза были получены новые штаммы гриба Т. reesei TW-1 и TW-307 (отличающиеся повышенной секрецией целлюлаз), на основе которых были произведены ферментные препараты с улучшенной осахаривагащей способностью при гидролизе целлголозосодержащих материалов. Были также получены новые промышленные штаммы гриба Penicillium verruculosum В40-221-6 и В40-221-151, дерепрессированные по глюкозе и способные секретировать на дешевых питательных средах до 40-50 г/л внеклеточного белка. Основным достоинством ферментных препаратов P. verruculosum по сравнению с целлюлазами Т. reesei является более сбалансированный состав целлюлазного комплекса, и, в частности, более высокий уровень р-глюкозидазной активности, что, как будет показано в диссертационной работе, позволяет получать более высокий выход целевого продукта (глюкозы) при ферментативном гидролизе целлюлозосодержащих материалов. Наконец, в результате совместных исследований ИБФМ РАН и кафедры химической энзимологии МГУ был найден перспективный продуцент целлюлаз и гемицеллюлаз — гриб Chrysosporium lucknowense, на основе
которого были получены новые штаммы (в частности, UV 18-25), отличающиеся крайне высокой секреторной способностью. По уровню секреции внеклеточного белка (50-80 г/л) С. lucknowense UV 18-25 не уступает, либо превосходит лучшие известные промышленные продуценты целлюлаз (например, различные штаммы Т. reeset). Серьезным преимуществом С. lucknowense также является то, что некоторые из целлюлаз данного продуцента обладают высокой активностью в нейтрально-щелочной среде, что делает данные ферменты перспективными для использования в ряде бнотехнологических процессов (в частности, для обработки текстиля, а также для применения в моющих средствах).
Следует отметить, что к настоящему времени ферменты целлюлазного комплекса Т. reesei относятся к наиболее изученным ферментам, разрушающим природные полисахариды. За последние 50 лет опубликовано более тысячи статей, патентов и монографий, а также проведены десятки международных конференций, посвященных микробиологическим, биохимическим и биотехнологическим аспектам гриба Т. reesei {Т. viride), а также продуцируемых данным грибом целлюлаз. Тем не менее, полный геном Т. reesei до сих пор не расшифрован, и далеко не все карбогидразы данного гриба были вьщелены и охарактеризованы. В литературе имеется также немалое количество публикаций по целлюлазам, продуцируемым различными видами грибов рода Penicillium, однако сведения, касающиеся пеницилльных ферментов-карбогидраз (и целлюлаз в частности), весьма противоречивы. Что касается ферментов, продуцируемых грибом С. lucknowense и другими видами грибов рода Chrysosporium, то сведения по ним практически отсутствуют в научной литературе, а также в белковых и других базах данных.
Учитывая актуальность исследования целлюлазных комплексов, продуцируемых различными микроорганизмами, как главных разрушителей растительной биомассы в природе, а также принимая во внимание все более широкое применение целлюлолитических ферментов в качестве биокатализаторов в различных биотехнологических процессах, в данной работе были поставлены следующие задачи и цели:
детально охарактеризовать внеклеточный целлюлазный комплекс, продуцируемый грибом С. lucknowense, включая выделение всех секретируемых эндоглюканаз и целлобиогидролаз, изучение их субстратной специфичности, основных биохимических и физико-химических свойств, а также получение
информации по аминокислотным последовательностям белков (или отдельных пептидов из данных белков), на основании которой ферменты могли бы быть классифицированы с точки зрения их принадлежности к той или иной семье гликозид-гидролаз;
изучить закономерности трансгликозилирования и ингибирования продуктами реакции при катализе целлюлолитическими ферментами (как важных факторов, влияющих на эффективность гидролиза природных субстратов целлюлаз);
провести сравнение осахаривающеи способности широкого круга отечественных и зарубежных целлюлазных препаратов на основе различных грибных продуцентов при гидролизе реальных видов целлюлозосодержащего сырья и выявить наиболее эффективные целлюлазные комплексы и штаммы-продуценты;
найти возможности интенсификации процесса ферментативного осахаривания целлюлозы в лабораторных гидролиз-аппаратах различной конструкции; с помощью экспериментальных подходов, а также используя методы математического моделирования, выявить основные факторы, влияющие на кинетику ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов;
выявить наиболее перспективные «тополитические» целлюлазы, обладающие высокой эффективностью при действии на текстильные материалы - в таких процессах, как ферментативная депигментация джинсовой ткани и биоотварка («биоскоринг») суровых хлопчатобумажных тканей; разработать теоретические основы действия «тополитических» целлюлаз; получить и испытать новые ферментные препараты, наиболее подходящие для применения в процессах биообработки текстильных материалов.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Другие полисахариды растений и лигнин
Полисахариды матрикса растительной клетки подразделяются на два класса: гемицеллюлозы и пектины. В основе такого подразделения лежит различие в их растворимости. Пектины - это группа полисахаридов, экстрагирующихся из клеточной стенки в результате продолжительной обработки кипящей водой, тогда как гемицеллюлозы - группа полисахаридов, которые экстрагируются 4 М раствором КОН при комнатной температуре [8]. Гемицеллюлозы составляют около 20% клеточной стенки растений. В зависимости от источника (и способов выделения), молекулы гемицеллюлоз могут иметь как линейную, так и разветвленную структуру [8,18]. Большинство изученных гемицеллюлоз являются гетерополисахаридами (табл.1 Л). В состав звеньев основной цепи полимерных молекул могут быть включены: D-ксилоза, D-манноза, D-галактоза, D-глюкоза, D-глюкуроновая кислота, D-4-О-метилглкжуроновая кислота, L-арабиноза, а также присоединенные через сложноэфирные связи остатки уксусной, феруловой и кумаровой кислот [18,19]. Наиболее распространены среди гемицеллюлоз ксиланы. Функциональная роль гемицеллюлоз заключается в осуществлении взаимосвязи между основными компонентами клеточной стенки за счет формирования переходного слоя между ними. В первичной клеточной стенке они объединяют пектины и целлюлозу, во вторичной - целлюлозу и лигнин. Присоединение лигнина осуществляется для большинства растений посредством образования диферуловых (дикумаровых) мостиков между ксиланом и лигнином. У некоторых растений (например, бука) присоединение также возможно за счет образования сложноэфирной связи между глюкуроновой кислотой ксилана и ароматическим спиртом лигнина. Присоединение пектина к гсмицеллюлозе осуществляется через арабинаиы и арабиногалактаны. Некоторые авторы считают, что в отдельных случаях, например, для пектина из явора, арабипогалактан следует рассматривать как смесь двух индивидуальных полисахаридов: арабииана и галактана, в которых по крайней мере некоторые цепи арабинапа связаны с цепями галактана гликозидной a-l-4-связью, и присоединение пектина к гемицеллюлозе в данном случае осуществляется через галактан [8]. СП гемицеллюлоз существенно меньше, чем у целлюлозы, и варьирует от 50 до 200 [18]. Арабиноглнжуроноксилан (арабиноксилан) - гетерополисахарид, составляющий 7-8% сухой массы мягкой (хвойной) древесины.
Основная цепь его построена из 1,4-Р-0-ксилопиранозиых звеньев, а боковые группы представляют собой 4-0-метил-Б-глюкуроновую кислоту (а-1,2-связь, 20%) и L-арабинофуранозу (а-1,2 и а-1,3-связь, 10-15%) [18]. Структура арабиноксиланов злаковых растений зависит от их локализации. Арабиноксиланы, входящие в состав оболочки (шкурки) зерна, по структуре схожи с араби ноксиланом мягкой древесины. Арабиноксиланы, входящие в состав эндосперма зерна, в качестве боковых заместителей содержит только L-арабинозу (a-1,3 и a-1,2-связь, а-1,3 доминирует) [8,18] (рисі .5а), причем ее содержание существенно выше, чем в арабиноксиланах деревьев хвойных пород. Высокое содержание боковых арабинозных заместителей обуславливает высокую вязкость арабиноксиланов данного типа. Арабиноксиланы однодольных растений этерифицированы по С-5 атому L-арабинофуранозы феруловой или кумаровой кислотами [20]. Степень этерификации варьирует в зависимости от источника арабиноксилаиа. Так, например, доля феруловой и кумаровой кислот составляет 1/150 от пентозных остатков в арабиноксилане пшеничных отрубей и 1/240 в арабиноксилане соломы ячменя (в то же время доля боковых арабинозных остатков колеблется, соответственно, от 1/15 до 1/30). СП арабиноксилаиа варьирует в пределах от 70 до 130 [18]. Ацетилглюкуроноксилан (глюкуроноксилаи) - основной ксилан твердых (лиственных) пород деревьев. Содержание его варьирует от 15 до 30% от сухой массы древесины. В основной цепи глюкуроноксилаи содержит D-ксилопиранозные остатки, соединенные [3-1,4-связями, 70% которых ацилировапо по С-2 или С-3 углеродным атомам. Кроме того, в среднем к каждому десятому ксилозному звену в качестве боковой группы присоединена сс-1,2-связью молекула 4-0-метил-О-глюкуроновой кислоты (рис. 1.56). СП глгакуроноксилана твердых пород деревьев составляет 150-200 [18]. Галактоглюкоманнан преобладающий компонент гемицеллюлоз мягких (хвойных) пород деревьев. Основная цепь галактоглкжоманнана сформирована Р-1,4-связанными остатками D-маннопиранозы и D-глкжопиранозы, которые чередуются большей частью произвольным образом, а боковые цепи - остатками D-галактозы, соединенной с основной цепью а-і,6-связью. Кроме того, в среднем каждый четвертый гликозидный остаток основной цепи ацетилирован по С-2 или С-3 атомам. Выделяют два типа галактоманнанов: с высоким и низким содержанием галактозы. В первом, составляющем 5-8% от сухой массы хвойной древесины, соотношение галактоза : глюкоза : манноза можно представить как 1:1:3, во втором, составляющем 10-15% от сухой массы хвойной древесины —как 0,1; 1:3 [18]. Глюкоманнан, составляющий 2-5% от сухой массы твердой древесины - это сополимер р-1,4-связапных D-маннопиранозных и D-глкжопиранозных остатков. Относительное содержание Сахаров зависит от источника выделения глюкоманнана, но в среднем может быть описано как 1:1 или 1:2 [18]. Арабиногалактаны входят в качестве компонента гемицеллюлозы деревьев лиственных пород, а также в состав пектинов растений.
Основная цепь арабиногалактанов построена из чередующихся звеньев галактозных и арабинозных олигомеров. Боковые цепи также образованы галактозой и арабииозой и присоединены к гликопротеинам клеточной стенки через серии и гидроксипролин. Выделяют два основных класса арабиногалактанов [18]: Арабиногалактан I (выделен из соевых бобов). Основная цепь состоит из (3-1,4-связанных молекул D-галактопиранозы, из которых каждая четвертая или пятая замещена (а-1,3-связь) на о Ь-арабинофуранозил-а-Ь-1,5-арабинофуранозу; Арабиногалактан 11 (выделен из лиственницы и кофейных бобов) - сильно разветвленный полисахарид, представленный цепями D-галактопиранозы, соединенной Р-1,3- и р-1,6-связями. р-1,3-Связи преобладают в основной цепи, а р-1,6-связи — в дополнительных, наиболее разветвленных цепях, которые заканчиваются Ь-арабинофуранозил-а-Ь-1,3-арабинофуранозой или, существенно реже, L-арабинопиранозидом. Арабиногалактан II входит в состав гемицеллюлоз деревьев лиственных пород, арабиногалактан I является пектиновым компонентом [8,21]. Ксилоглюкан - полисахарид из растительных клеточных стенок, состоящий в основном из D-глюкозы и D-ксилозы в соотношении примерно 4:3, а также меньших количеств D-галактозы; часто обнаруживают также остатки L-фукозы и L-арабинозы. В результате исследования ксилоглюканов разных растений стало ясно, что, в основном, их структура одинакова [22-24]. Основная цепь состоит из р-І-4-связанной D-глюкопираиозы, как и в случае целлюлозы. К каждым трем (иногда - двум) из четырех остатков глюкозы присоединены единичные остатки D-ксилопиранозы с помощью а-Ьб-связей. Боковые группы наиболее распространенного типа ксилоглюкана распределены упорядоченно - три заместителя подряд, затем пропуск (рисЛ.б). Часть остатков ксилозы содержит заместители - D-галактопиранозу, присоединенную р-1-2-связями, некоторые остатки галактопиранозы дополнительно содержат L-фукопиранозильные заместители, присоединенные a-l-2-связямн [22]. Таким образом, можно выделить основной структурный мотив ксилоглюкана - гептасахарид XybGlc4- Другие заместители, присоединенные к ксилозе, также могут быть распределены упорядоченно, однако количество и характер замещения зависит от вида растения и даже от популяции. Была предложена упрощенная система представления структуры как полисахарида, так и олигосахаридов ксилоглюкана [25]. Согласно этой номенклатуре, незамещенные остатки глюкозы обозначают буквой G; остатки глюкозы, содержащие ксилозильныи заместитель - буквой X; остатки, содержащие в качестве заместителя ксилозил-галактозу - буквой L; а сегмент, содержащий фукозу - буквой F (обозначения для других, вариантов боковых цепей, известных на сегодняшний день, даны на сайте http://www.ccrc.uga.edu/-mao/). Фрагмент молекулы, представленный на рис.1.б, можно записать как XLFGXXXG.
Механизм действия целлюлазного комплекса
Первая попытка создать механистическую модель ферментативного гидролиза целлюлозы была предпринята в 1950 г. Элвином Ризом [151], который предложил теорию, известную как «С-Сх» модель, чтобы объяснить причину, по которой некоторые грибные целлюлазные системы обладают способностью гидролизовать нерастворимую кристаллическую целлюлозу до глюкозы, в то время как другие -только аморфную или растворимые производные целлюлозы (например, КМЦ). Согласно модели Риза, ферментные комплексы, способные гидролизовать природные высокоупорядоченные формы целлюлозы, содержат некий негидролитический «Срфактор», который механически разрушает структуру кристаллической целлюлозы, разрывая водородные связи между ее молекулами и переводя ее в более реакционноспособное состояние для действия каталитического «Ск-фактора», который далее деполимеризует субстрат до коротких олигомеров и в итоге - до глюкозы. Несмотря на то, что в свое время эта теория сделала прорыв в области механизма ферментативного гидролиза целлюлозы, она не объясняла природу С} и Сх факторов. В 1972 г. Вуд и МакКрэй предложили свою интерпретацию указанных факторов, т.е. они ассоциировали С і и Сх соответственно с экзо- и эндоглюканазами, предположив, что экзоглюканазы (целлобиогидролазы), имеющие большее сродство к целлюлозе, начинают ферментативный гидролиз, и за ними вступают в реакцию эндоглюканазы [152]. Позднее эти исследователи изменили свою точку зрения и предложили механизм действия целлюлазного комплекса, согласно которому начинают атаку на целлюлозу эндоглюканазы (С ), которые неупорядоченно расщепляют молекулы полимерного субстрата и создают новые концы молекул, доступные для действия экзоглгокаиаз (С]) [153]. Это было прямое отклонение от модели Риза, согласно которой первым должен действовать Сі-фактор, т.е. порядок действия ферментов (факторов) в новой модели Вуда осуществлялся с точностью до наоборот.
Однако, такой порядок действия целлюлаз объяснял синергизм между эндоглюканазами и экзо-целлобиогидролазами - свойство, хорошо известное для ферментов целлюлазного комплекса и описанное во многих работах [153-159]. В начале 1980-х годов на кафедре химической энзимологии МГУ в группе исследователей целлюлаз под руководством А.А.Клесова было обнаружено, что способность целлюлаз расщеплять кристаллическую целлюлозу прямо коррелирует с их адсорбционной способностью на целлюлозе, и было сделано предположение, что С]-фактор Риза - это не отдельный компонент (вещество) целлюлазного комплекса, а свойство фермента прочно адсорбироваться на целлюлозе [160,161]. Эта теория получила дальнейшее развитие в рамках механистической модели, объясняющей синергизм между прочно и слабо адсорбирующимися ферментами [162,163]. Прочно адсорбирующиеся целлюлазы способны осуществлять диспергирование кристаллической целлюлозы, переводя ее в более реакционноспособное состояние. Аморфизованная таким образом целлюлоза может далее гидролизоваться слабо адсорбирующимися (более мобильными) целлюлазами. В свою очередь, слабо адсорбирующиеся ферменты могут гидролизовать субстрат в зонах локализации прочно адсорбированных на целлюлозе ферментов и облегчать их транспорт (поверхностную диффузию) к новым участкам субстрата, т.е. снимать таким образом отрицательное влияние псевдоинактивации целлюлаз [164,165]. Относительно обратимости или необратимости адсорбции целлюлаз на целлюлозе в литературе также велись дискуссии [107]. Грибные целлюлазы (в первую очередь, целлобиогидролазы) имеют свойство обратимо терять активность по отношению к целлюлозе после адсорбции на ней (так называемая псевдоинактивация, о которой уже шла речь выше) [164-166]. Это может быть результатом исчерпывания доступных для гидролиза гликозидных связей на поверхности целлюлозы в районе дислокации прочно адсорбированного фермента вследствие потери его мобильности (уменьшения скорости перемещения) по поверхности субстрата либо, как крайний случай, результатом его необратимой адсорбции. Известно, что индивидуальные целлюлозосвязывающие модули (ЦСМ) ЦБГ I Т. reesei, а также ряда других грибных и бактериальных целлюлаз обратимо адсорбируются на целлюлозе, причем они способны относительно быстро перемещаться по поверхности субстрата; иногда это свойство характерно и для полпоразмерных ферментов, обладающих ЦСМ [167-171]. Однако в случае целлюлаз, имеющих бифункциональную организацию молекул, обратимость адсорбции характерна не всегда; это может быть объяснено тем, что наряду с адсорбцией через ЦСМ фермент может быть связан с субстратом также и через каталитический домен, т.е. в данном случае может иметь место двухцентровое взаимодействие фермента с целлюлозой [172]. Поэтому в литературе были отмечены случаи необратимой адсорбции целлюлаз на целлюлозе [172,173]. Известны также примеры необратимой адсорбции индивидуальных ЦСМ [174-176]. Интересный подход для исследования обратимости адсорбции целлюлаз и эволюции фермент-субстратных взаимодействий в ходе ферментативного гидролиза целлюлозы, основанный на использовании окрашенной нерастворимой целлюлозы, был предложен Рабиновичем с соавторами [177,178]. После того, как ферменты целлюлазного комплекса адсорбировали на обычной (неокрашенной) целлюлозе и удаляли слабо адсорбирующиеся целлюлазы, в реакционную смесь добавляли окрашенный субстрат.
В результате переноса целлюлаз с неокрашенной на окрашенную целлюлозу в растворе начинали появляться окрашенные растворимые продукты гидролиза. По величине лаг-периода можно было судить о прочности адсорбции (среднем времени нахождения) ферментов на неокрашенном субстрате, а по скорости образования окраски - о количестве перенесенного фермента. Оказалось, что в случае адсорбции на аморфной целлюлозе лаг-период в образовании окрашенных продуктов больше, чем в случае адсорбции на МКЦ, т.е. фермент был менее мобильным (более прочно связанным) в случае аморфного субстрата. Эксперименты с окрашенной целлюлозой также подтвердили уменьшение подвижности адсорбированного фермента на поверхности МКЦ в ходе длительного гидролиза, т.е. существование псевдоинактивации адсорбированных целлюлаз [178]. Таким образом, по-видимому, можно говорить не столько о том, обратима или необратима адсорбция целлюлаз на целлюлозе, а скорее о том - насколько мобильным является адсорбированный фермент (его ЦСМ) в конкретной ситуации. Степень подвижности адсорбированного фермента зависит не только от свойств (строения) ЦСМ, но и от природы и свойств целлюлозного субстрата, а также условий и времени гидролиза. Несмотря на существенный прогресс в области механизма ферментативного гидролиза целлюлозы в 1970-1980-е годы, поиски негидролитического Cj-фактора, вызывающего нарушение водородных связей в микрофибриллах кристаллической целлюлозы и ее аморфизацию или диспергирование, не прекращались. На роль С\-фактора предлагались даже такие вещества, как Н2О2, образуемая некоторыми оксидоредуктазами грибов [179]. После открытия бифункциональной структуры целлюлаз в середине 1980-х годов (см. выше) па роль Сгфактора стали претендовать целлюлозосвязывающие домены (модули). В пионерской работе Дина с соавторами [180] было показано, что ЦСМ бактериальной целлюлазы, а именно ЦСМ эндоглюканазы СепА из С. Jlmi, способен негидролитическим образом диспергировать волокна кристаллической целлюлозы с высвобождением мелких частиц, что детектировали спектрофотометрически на длине волны 600 нм. В последующей работе [181] эти авторы фактически возродили теорию Риза, получив доказательство того, что при гидролизе хлопка ЦСМ выступает в роли Сі-фактора, а каталитический домен СепА — в качестве Сх-фактора, т.е. в данном случае имел место внутримолекулярный синергизм. Попытка обнаружить увеличение реакционной способности МКЦ, обработанной ЦСМ другого фермента из С. fimi (экзоглюканазы/ксиланазы Сех), при гидролизе целлюлазами Т. reesei не увенчалась успехом [176]. Однако, в другой работе [182J было обнаружено, что ЦСМ ЭГ II Т, reesei (авторы ошибочно назвали фермент ЭГ III) уменьшает количество водородных связей в высоко упорядоченной целлюлозе и ее индекс кристалличности, т.е. авторы фактически подтвердили данные Дина с соавторами [180], но на этот раз на примере грибного ЦСМ.
Аппаратурное оформление процессов ферментативного гидролиза целлюлозы
Реакторы, которые можно использовать для осуществления ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов, можно условно разделить на три типа: реактор периодического действия (как правило, с перемешиванием), проточный реактор с перемешиванием (часто снабжаемый ультрафильтрационной мембраной) и проточный колонный реактор непрерывного действия. Некоторые разновидности реакторов приведены на рис.3.1. Наиболее часто используется реактор периодического действия с перемешиванием, в который помещают субстрат и раствор целлюлазного препарата, а процесс гидролиза ведется в течение определенного времени с одной и той же исходной порцией субстрата и фермента [283,339,340]. При такой конструкции реактора возникает проблема отделения продуктов реакции от ферментов (в случае, когда целевыми продуктами являются сахара), а также отделения непрогидролизованного остатка сырья. Кроме того, скорость реакции значительно уменьшается со временем из-за ингибирования продуктами — глюкозой и целлобиозой - и инактивации ферментов при перемешивании [164,283,341]. Для отвода продуктов из зоны реакции предложено использовать ультрафильтрацию и добавлять в реактор по мере гидролиза свежие порции субстрата [340,342,343]. При этом ферменты задерживаются ультрафильтрациопной мембраной и остаются в реакторе, что позволяет продлить срок их действия. Ультрафильтрационные мембраны бывают встроенного типа (т.е. находятся в зоне реактора, где осуществляется гидролиз), а также могут быть выполнены в виде выносного модуля (рис.3.1). Использование реакторов мембранного типа целесообразно осуществлять в режиме с подпиткой сырья. Реакторы измельчения представляют собой разновидность реактора с перемешиванием и позволяют увеличить в 1,5-2,0 раза эффективность ферментативного гидролиза, хотя имеют те же недостатки, которые указаны выше. Для непрерывного измельчения (истирания) нерастворимого субстрата в ходе гидролиза в реактор добавляют абразивный материал (песок, стеклянные или стальные шарики) [319,321,322]. Одним из вариантов такого типа аппаратов является реактор изрезания [344]. На валу пропеллерной мешалки дополнительно через равные расстояния жестко закреплены диски с отверстиями, а на внутренней стенке цилиндрического реактора через те же промежутки жестко крепятся аналогичные перфорированные диски.
Диски-лезвия ротора и статора чередуются, их диаметр несколько меньше, чем внутренний диаметр реактора. Он предназначен для гидролиза целлюлозосодержащих материалов с размером частиц 0,25-25 мм. В колонных реакторах непрерывного типа действия (вытеснения или поршневого типа, см. рис.3.1) процесс гидролиза осуществляется под действием целлюлаз, прочно адсорбированных на поверхности субстрата. В ходе реакции образующиеся растворимые сахара непрерывно удаляются из объема реактора потоком жидкости, в то время как связанные с целлюлозой адсорбированные ферменты остаются в реакторе [164,345-347], По мере гидролиза в колонну подаются свежие порции целлюлозы по принципу противотока; адсорбированные ферменты после осуществления гидролиза начальной порции субстрата перемещаются на свежее сырье и, таким образом, процесс осуществляется в непрерывном режиме. Лигнин, содержащийся в растительном сырье, способен адсорбировать и инактивировать целлюлазы, выводя их таким образом из сферы реакции [348]. Понятно, что по мере гидролиза и добавления свежих порций лигноцеллюлозного сырья в реакторы лигнин будет накапливаться и все в более заметной степени снижать эффективность процесса. Недостатком колонного реактора является также то, что Р-глкжозидазы, как правило, обладают низкой адсорбционной способностью и поэтому получаемые гидролизаты обеднены целевым продуктом - глюкозой [164,346]. Кроме того, при масштабировании процесса в колонном реакторе могут возникнуть проблемы из-за высокого гидродинамического сопротивления слоя сырья в аппарате [347]. Поскольку этанол рассматривается в качестве основного потенциального продукта биоконверсии растительного сырья, со второй половины 1980-х годов большой популярностью (особенно, в США) стали пользоваться так называемые совмещенные процессы гидролиза целлюлозы и ферментации получаемых Сахаров в спирт (SSF-процессы, сокращение от англ. термина simultaneous saccharification and fermentation) [306,349-351]. Подобные процессы осуществляются в реакторах периодического типа действия. Их преимуществом является совмещение двух основных стадий биоконверсии растительного сырья в одном реакционном сосуде. Так как сахара, получаемые в результате ферментативного гидролиза целлюлозы, являются ингибиторами целлюлаз, их удаление в ходе реакции путем сбраживания в этанол способствует более высокой степени конверсии исходного субстрата. Основным недостатком SSF-процессов является то, они, как правило, проводятся при температурах, являющихся компромиссом между оптимальной температурой сбраживания (20-40С в зависимости от используемого микроорганизма) и гидролиза (45-50С для ферментов Trichoderma и большинства других грибных целлюлаз). Кроме того, ферменты и дрожжи (либо другие сбраживающие микроорганизмы) могут функционировать не при оптимальном значении рН. В итоге ни гидролиз, ни сбраживание не осуществляются в оптимальных условиях, что приводит к длительным временам процесса.
Типичный SSF-процесс с использованием традиционных дрожжей Saccharomyces cerevisiae или бактерий Zymomonas mobilis проводится при 35-37С в течение 7 сут, [306,349]. При таком длительном времени процесса повышается вероятность заражения реакционной смеси посторонней микрофлорой. В целом, в настоящий момент трудно предсказать, какие из процессов биоконверсии растительного сырья будут осуществлены на промышленном уровне -традиционные (раздельного гидролиза и сбраживания) или SSF-процесс. В итоге это, по-видимому, будет зависеть от их экономических показателей. 3.2. Ферментная обработка текстильных материалов Ферментативная депигментация джинсовых изделий. Начиная с конца 1980-х годов, целлюлазы стали широко использоваться для обработки текстильных изделий и материалов [3,4,352,353]. Первым таким процессом стала ферментативная депигментация джинсовых изделий, проводимая с целью придания им внешнего вида "вареных джинсов" [3,352-354]. Ранее для этой цели применяли пемзу и химические агенты. Процесс обработки джинсовых изделий с использованием пемзы называют в англоязычной литературе «denim stoning», поэтому для процесса с использованием целлюлаз ввели термин «biostoning» («биостонинг»). Первый ферментный препарат, произведенный для «биостонинга» фирмой Novo Nordisk (ныне Novozymes, Дания), появился на рынке в 1987 г. [3]. Позднее стали производиться подобные же специальные препараты целлюлаз другими компаниями, и ферментная обработка практически вытеснила процессы, основанные па использовании пемзы. Индиговый краситель связан с целлюлозными нитями, из которых изготовлена джинсовая ткань, нековалентпо [355]. Индиго удерживается на ткани в основном за счет контакта с отдельными ворсинками, выступающими из целлюлозных волокон. Механизм ферментативной депигментации джинсовой ткани заключается в том, что целлюлазы, гидролизуя эти выступающие ворсинки, ослабляют контакт между красителем и материалом. Поэтому, если дополнительно приложить механическое воздействие (какое осуществляется в стиральных машинах), часть красителя переходит в раствор и в результате ткань приобретает вид потертости [3,356,357]. Перед тем, как осуществлять «биостонинг» джинсовых изделий целлюлазами, их предварительно обрабатывают препаратом а-амилазы (так называемая процедура расшлихтовки) — для того, чтобы удалить с поверхности ткани крахмал, используемый в качестве шлихты при изготовлении нитей [3,352].
Исследование трансгликозилирования ЦБГІ
Эксперименты по действию ЦБГ I Т. longibrachiatum на МУФ-Р-О-целлобиозид и другие субстраты (МУФ-Р-О-глюкозид, МКЦ) в присутствии хромогенных акцепторов гликозидного остатка, проводили в термостатируемых при 30С пробирках при рН 4,5 (0,1 М Na-ацетатный буфер). В случае, когда в качестве субстрата использовали МКЦ («Chemapol», Чехословакия), реакцию проводили при перемешивании на магнитной мешалке. Продукты ферментативной реакции анализировали методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы «Bio-Rad» (США) серии 700. В данном случае хроматографическая система включала насос высокого давления, термостатируемую при 25С колонку Silasorb-Ntk (4,6 х 250 мм), УФ-детектор (318 нм), а также управляющую станцию «Bto-Rad 700» на основе IBM/XT-совместимого компьютера. В качестве подвижной фазы использовали смесь «ацетонитрил - вода». Для количественного определения МУФ, МУФ-р-О-глкжозида и МУФ-p-D-целлобиозида использовали элюент с соотношением ацетонитрила и воды 90:10. Однако, в этих условиях пики, соответствующие продуктам трансгликозилирования (МУФ-трисахариду и МУФ-тетрасахариду), размывались вследствие значительных времен удерживания данных компонентов. Поэтому для детекции МУФ-трисахарида и МУФ-тетрасахарида использовали элюент с содержанием ацетонитрила 80%. Следует отметить, что при соотношении ацетонитрил-вода 80:20 пики МУФ и МУФ-p-D- глюкози да не разделялись. В случае анализа МУФ-тетрасахарида, чтобы добиться элюирования всех компонентов реакционной смеси за относительно короткий промежуток времени и в виде узких пиков, использовали градиент скорости потока 1,5-3 мл/мин. Анализируемые растворы предварительно разбавляли в 2,5 раза ацетонитрилом и центрифугировали. 4.10. Масс-спектрометрический анализ пептидов и белков Из окрашенных кумасси белковых полос гелей после Ds-Na-ПААГ-электрофореза вырезали кусочки геля размером примерно 1 мм , которые соответствовали анализируемым ферментам.
Кусочки геля помещали в пластиковые пробирки объемом 0,5 мл, добавляли 150 мкл 50%-ного ацетонитрила в 50 мМ NH4HCO3 и проводили отмывку геля от красителя в течение 20-30 мин при 5бС. Жидкость удаляли и добавляли к кусочку геля 150 мкл ацетонитрила для его дегидратации. После 10 мин инкубации ацетонитрил удаляли и гель высушивали на воздухе (10-20 мин). Далее добавляли 1,5-2 мкл рабочего раствора трипсина (10 мкг/мл в 25 мМ ЬШ НСОз), смесь выдерживали 10 мин, добавляли 1,5 мкл 25 мМ NH4HCO3 и проводили протеолиз белка в геле в течение 2 ч при 37С. Для этого использовали модифицированный трипсин для секвенирования («Promega», США), Экстракцию полученных пептидов проводили, добавляя 5-7 мкл 30%-ного ацетонитрила в деионизированной воде (смесь также содержала 0,1% трифторуксусной кислоты) и инкубируя пробирку в течение 15 мин при комнатной температуре. Экстракт помещали в новую пробирку объемом 0,2 мл и использовали для MALDIOF масс-спектрометрии [408,409]. MALDIOF масс-спектрометрию пептидов осуществляли на приборе REFLEX HI фирмы «Bruker Daltonics» (ФРГ)- В качестве матриц использовали 2,5-дигидробензойную или а-циано-4-гидроксициннамовую кислоту. Тандемную TOFOF масс-спектрометрию пептидов осуществляли на приборе ULTRAFLEX фирмы «Bruker Daltonics» (ФРГ). Эти эксперименты проводились в отделе протеомных исследований НИИ Биомедицинской химии РАМН. Используя полученные массы пептидов, с помощью программы MASCOT (http://www.matrixscience.com/) проводили поиск в белковых базах данных NCBI, MSDB и SWISS-PROT на наличие пептидов с идентичными молекулярными массами в составе известных гликозид-гидролаз. Для MALDIOF масс-спектрометрии белков (очищенных ферментов) использовали в качестве матрицы 3,5-диметокси-4-гидроксициннамовую кислоту. Эти эксперименты проводились на приборе AUTOFLEX И фирмы «Bruker Daltonics» (ФРГ) в Лаборатории физической органической химии Химического факультета МГУ. 4.11. Анализ молекулярно-массового распределения продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов Исследование ММР продуктов гидролиза р-глюкана и ксилоглюкана (5 г/л) проводили методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ) на колонке TSK G3000SWXL (7,8 х 300 мм) фирмы «Toso-Haas» (Япония), используя систему для ВЭЖХ Chromatography Workstation 700 («Bio-Rad Laboratories», США) с рефрактометрическим детектором.
В качестве элюента использовали 50 мМ Na-ацетатный буфер, содержащий ОД М NaCl, при скорости потока 0,5 мл/мин. Калибровку колонки осуществляли с помощью декстранов (20-250 кДа, «Pharmacia Biotech», Швеция) В случае исследования ферментативного гидролиза ксилоглюкана субстрат предварительно частично деполимеризовали путем обработки эпдо-ксилоглюканазой A. japonicus. Для этого 100 мг ксилоглюкана растворяли в 10 мл 50 мМ Na-ацетатного буфера, рН 5Д Далее в реакционную смесь добавляли 0,08 ед. фермента и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 мин. За это время вязкость раствора уменьшалась примерно в 2-3 раза, что позволяло в дальнейшем использовать полученный субстрат в экспериментах по ГПХ (в отличие от исходного вязкого раствора полисахарида). Для инактивации фермента раствор обработанного ксилоглюкана инкубировали в кипящей водяной бане в течение 20 мин. При изучении ММР продуктов гидролиза ксилоглюкана модифицированный (частично деполимеризоваппый до Mw 150 кДа) субстрат смешивали с элюептом и изучаемым ферментом, получая в итоге 4 мл реакционной смеси, где концентрация полисахарида составляла 5 мг/мл, а активность фермента - 0,06 ед/мл. При таких условиях через каждые 5-7 мин реакции (на ее начальной стадии) происходил гидролиз примерно 1% гликозидных связей в субстрате (при 40С). В ходе ферментативной реакции отбирали аликвоты (300 мкл), их инкубировали в течение 5 мин в кипящей водяной бане, чтобы инактивировать фермент, центрифугировали и затем анализировали методом ГПХ, а также бицинхонинатньш методом на ВС [403]. Кинетические эксперименты по гидролизу целлюлозосодержащих материалов проводили: (1) в термостатируемых ячейках объемом 20 или 50 мл, помещенных на качалку (220-250 об/мин); (2) в виброреакторах объемом 2 или 20 л; (3) в реакторе с интенсивным перемешиванием на базе плоского электромагнитного индуктора, в котором для гидролиза использовали два вида рабочих ячеек: объемом 20 мл (из стекла) и 130 мл (из нержавеющей стали). Конструкционные особенности реакторов подробно рассмотрены в разделах 7.3 и 7.4 (глава 7). Ферментативный гидролиз целлюлозы в указанных реакционных сосудах (реакторах) проводили при 45-50С и рН 4,5-5,0, используя 0,1 М Na-ацетатный буфер, В реакционный сосуд вносили необходимую навеску субстрата, раствор ферментного препарата в буфере, и ферментативную реакцию проводили при перемешивании в течение различного времени (от нескольких часов до 7 сут). В ходе гидролиза в определенные моменты времени отбирали пробы реакционной смеси объемом 0,5-1 мл (в виде суспензии). Пробы центрифугировали, разбавляли в случае необходимости водой или ацетатным буфером и определяли в супернатанте концентрацию Сахаров методами, описанными в разделе 4.3. Условия гидролиза в каждом конкретном случае приведены в тексте и подписях к рисункам, где концентрация субстрата указана в расчете на сухой вес.
