Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 4
Индуцированные абзимы 4
Природные каталитические антитела 18
Антиидиотипические антитела 35
Результаты и обсуждение 53
Исследование каталитической активности антиидиотипического антитела 6В8-Е12. 53
Клонирование генов вариабельных доменов моноклональных антител 5-Н4 и 6В8-Е12 60
Создание генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного антитела 6В8-Е12 в виде одноцепочечного антитела 68
Исследование каталитических свойств полученного одноцепочечного антител а... 72
Материалы и реактивы 74
Стоковые растворы 75
Методы 76
Работа с нуклеиновыми кислотами ГГ 76
Методы работы с бактериями Escherichia coli 84
Работа с белками 86
Выводы 96
Список литературы 97
- Природные каталитические антитела
- Антиидиотипические антитела
- Клонирование генов вариабельных доменов моноклональных антител 5-Н4 и 6В8-Е12
- Методы работы с бактериями Escherichia coli
Введение к работе
Сложные химические превращения, регулирующие жизненно важные процессы, в большинстве своем осуществляются при участии ферментов. В последние десятилетия прошлого века исследователям удалось с помощью методов генетической инженерии и направленной химической модификации удалось создать ферменты с измененной субстратной специфичностью. В ряду каталитических активных молекул особенное место занимают рибозимы -каталитические молекулы РНК и абзимы - каталитические антитела.
Наиболее изученными абзимами являются искусственные биокатализаторы, получаемые иммунизацией стабильными аналогами переходных состояний реакций. Область их применения включает разнообразные реакции органического синтеза и в основном ограничивается уровнем энергетического барьера ускоряемой реакции. Низкая иммуногенность и высокая стабильность антител в кровотоке позволяет использовать абзимы для разрушения психоактивных веществ и активации предшественников противоопухолевых лекарственных средств in vivo.
Весьма интересным было бы получить абзим, способный разрушать белки патогенов. В этой связи крайне важной является задача создания каталитического антитела с протеолитической функцией. Эта задача -оказывается практически невыполнимой с помощью подхода с использованием аналогов переходных состояний в качестве исходных гаптенов. Антительная матрица, специфически связывающаяся со структурой, мимикрирующей тетраэдр, эффективна в качестве биокатализатора эстеролиза, но не способна осуществить более сложные превращения, требующие эффективных конформационных подстроек в комплексе биокатализатор - белковый субстрат.
Существует три основных подхода к созданию протеолитических абзимов:
1) реакционная иммунизация
индукция протеолитических антител на фоне индуцируемого аутоиммунного заболевания
получение антиидиотипических антител, как антител внутреннего образа на ферменты, катализирующие реакцию протеолиза.
Метод получения антиидиотипических антител опирается на свойства иммунной системы образовывать антитела "внутреннего1 образа" и на идиотипическую гипотезу, высказанную в 1974 году Н. Ерни [1]. Первым удачным примером абзима, полученного данным методом, является моноклональное антитело 9А8, связывающее моноклональное антитело АЕ2, которое в свою очередь связывает активный центр ацетилхолинэстеразы. Было показано, что антитело 9А8 проявляет свойства исходного антигена, то есть обладает ацетилхолинэстеразной активностью [2].
Данная диссертационная работа посвящена проблеме структурно-функционального исследования антиидибтипического антитела 6В8Е12, полученного к участку активного центра эндопротеиназы субтилизин Карлсберг.
Структурно-функциональный анализ искусственных биокатализаторов на основе антител может обеспечить пути познания «эволюционно совершенного» биокатализатора. А конструирование на их основе «каталитических вакцин», способных целенаправленно разрушать белки, ответственные за развитие конкретных патологий, могло бы стать одним из подходов к получению «лекарств будущего».
Природные каталитические антитела
Относительная легкость получения гидролитических абзимов при помощи иммунизации аналогами переходного состояния естественным образом привела нескольких исследователей к мысли о возможности существования каталитических антител в природных условиях. Первым опубликованным исследованием в этой области явилась работа группы С. Паула, изучавшей биологическую роль вазоактивного интестинального пептида (ВИП) [56]. В крови некоторых пациентов, страдающих астмой, а так же ряда здоровых людей, которые испытывали регулярные физические нагрузки, были обнаружены аутоантитела, связывающие ВИП с константами диссоциации порядка 10"7-10-9 М, причем для аутоантител, полученных от пациентов с астмой, наблюдалось более прочное связывание по сравнению с аутоантителами здоровых доноров. Было показано, что очищенные антитела класса IgG, выделенные из различных сывороток, обладают неодинаковой специфичностью, однако все они гидролизуют пептид между 14-22 аминокислотными остатками. Исследованные аутоантитела не гидролизовали пептиды и белки, отличающиеся по последовательности от ВИЛ, что указывало на их заметную селективность. В последующей работе авторы разделили легкие и тяжелые цепи аутоантител и показали, что очищенная легкая цепь гидролизует ВИЛ с удельной активностью в 32 раза большей, чем интактные антитела [57]. Это позволило предположить, что каталитический центр ВИП-аутоантител ассоциирован с легкой цепью.
Для проверки этого утверждения кДНК, соответствующая каталитически активной легкой цепи антитела, была клонирована; полученная рекомбинантная легкая цепь проявляла каталитические свойства [58]. Молекулярное моделирование позволило предположить, что за катализ ответственны аминокислотные остатки, обеспечивающие активность сериновых протеиназ. Последующий сайт-направленный мутагенез протеолитическои легкой цепи в целом подтвердил эту гипотезу: замена Ser27 и His93 и Aspl на Ala, но не замены Ser26, His27 и Asp28 на Ala, приводили к уменьшению каталитической активности приблизительно в 100 раз и не влияли на связывание легкой цепи с ВИЛ [59-61]. Так как все три остатка, образующие активный центр антитела, кодированы соответствующим геном зародышевой линии, и кДНК легкой цепи ВИП-гидролизующего антитела кодирует только 4 аминокислотные замены, был проведен сайт-направленный мутагенез клонированной кДНК для получения продукта гена зародышевой линии [61]. Полученный белок обладал практически неизменными каталитическими свойствами, что позволило авторам выдвинуть предположение о том, что протеолитические антитела могут быть отнесены к системе врожденного иммунитета. Последнее является справедливым по всей видимости и для белка Бенс-Джонса, возникающего в крови больных миеломой и представляющего собой легкую цепь антитела с неизвестной; антигенной специфичностью и обладающего протеолитическими свойствами [62].
Таким образом, природное каталитическое антитело, расщепляющее ВИИ, было описано в соответствии с современным уровнем! исследований в энзимологии. Практически одновременно с работой" лаборатории. С. Паула при исследовании сывороток крови пациентов с ревматоидным артритом, склеродермией, системной красной волчанкой (СКВ) были обнаружены антиг ДНК аутоантитела, способные после очистки гидролизовать ДНК [63]. Максимальной; способностью гидролизовать ДНК обладали сыворотки больных СКВ - заболеванием, при котором наблюдается; наиболее: высокий титр анти-ДНК аутоантител [64]. К настоящему моменту присутствие ДНК-, гидролизующих. антител было выявлено, и при ряде: других патологий — хроническом» лимфолейкозе;: пре-В-клеточном лимфолейкозе; остром миелолейкозе и., СПИД III-IV стадий: [65]; вирусных гепатитах [63]; рассеянном; склерозе [66]; и тироидите Хашимото [67]. ДНК-гидролизующие антитела ; также были найдены у мышей; линий; SJL, MRE/lpr и [NZBxNZW]Fl,. обладающих аутоиммунными- нарушениями различной природьг[68]:
Реакция гидролиза ДНК, катализируемая очищенными аутоантителами, оказалась зависимой; от присутствия;ионов,металлов (Mg2+, Mn2+, Са2+ ) и, соответственно; ингибировалась, в присутствии ЭДТА [69]. При использовании в качестве субстрата реакции сверхспирализованной; плазмидной" ДНК было показано, что аутоантитела катализируют образование: одноцепочечных разрывов., Кинетические исследования,, проведенные с использованием метода линейного дихроизма, продемонстрировали, что Fab фрагмент аутоантител обладал: очень высокой каталитической эффективностью (ккат/Км=3.2-1010 М -мин"1),- близкой к известной для нуклеаз [70]. Поскольку в последующих исследованиях было показано, что ДНК-гидролизующие антитела проявляют кросс-реактивность к ДНК-белковым комплексам [65], можно было предположить, что способность анти-ДНК антител к катализу гидролиза ДНК вызвана их аффинностью к искаженной конформации сахарофосфатного компонента ДНК, возникающей при образовании комплексов ДНК с соответствующими белками. В более строгой форме эта идея- была подтверждена обнаружением кроссреактивности ДНК-гидролизующих антител к компонентам так называемого ядерного матрикса, не содержащим ДНК [71].
Несмотря на отсутствие ясных данных о клональном разнообразии ДНК-гидролизующих антител, обнаружение и детальный молекулярный анализ моноклонального антитела BV 04-01, гидролизующего ДНК [72], позволил описать механизм действия ДНК-гидролизующих антител. При сопоставлении пространственной структуры кристалла комплекса Fab-фрагмента антитела BV 04-01 с олигонуклеотидом ( 1Т)з, предпочтительных сайтов гидролиза одно- и двунитевых молекул ДНК и кинетических данных для рекомбинантных фрагментов BV 04-01, содержащих замену в легкой цепи Tyr32Phe и делецию His27, было показано, что антитело активирует расщепляемую фосфодиэфирную связь путем индукции конформационного изгиба. Дополнительная стабилизация образующегося переходного комплекса обеспечивается координированием иона Mg аминокислотными остатками легкой цепи Туг32 и His27 и З -фосфодиэфирной связью ДНК. Также было установлено, что предполагаемый активный центр кодируется соответствующим геном зародышевой линии, а не является результатом соматических мутаций. Поскольку число генов зародышевой линии, рекомбинирующих при дифференцировке В -лимфоцита, относительно невелико, появление секретируемых ДНК-гидролизующих антител, таким образом, вполне детерминировано в случаях появления анти-ДНК антител.
Антиидиотипические антитела
В 1963 году иммунизацией кролика В антителами к Salmonella typhi из кролика А (АЫ), Ж. Уден и М. Мишель получили антитела анти-АЬ-1 [111]. Однако, сыворотка кролика В не напоминала ни сыворотку кролика А до иммунизации, ни сыворотки других кроликов, иммунизированных тем же антигеном. Иммунизация кролика А вызвала продукцию антител, направленных против введенного антигена и имеющих специфические антигенные маркеры. Эти маркеры, или идиотопы, спровоцировали затем продукцию у кролика В антител АЬ2, антиидиотипов. Гипервариабельные участки антител несут, таким образом, антигенные детерминанты, или идиотопы. Сумма идиотопов составляет идиотип.
Основываясь на этих данных, в 1974 году Н. Ерни [1] сформулировал теорию идиотипических сетей. Согласно этой теории, иммунная система представляет собой сеть идиотипических взаимодействий. Для каждого антитела АЫ, направленного против антигена и носителя идиотопа (il) может существовать второе антитело АЬ2, комплементарно направленное против идиотипических детерминант АЫ и само несущее идиотоп (І2). Идиотопы антитела АЬ2, в свою очередь, могут вызвать продукцию антител АЬЗ и так далее.
Среди антиидиотипических антител можно выделить несколько категорий [112] (Рис. 9). Антиидиотипические антитела АЬ2а узнают идиотопы, отличающиеся от сайта связывания антигена антитела АЫ. АЬ2(3 напротив, узнают сайт связывания исходного антигена, а также отражают его структуру и называются вследствие этого антителами "внутреннего образа". Антитела АЬ2у, как и АЬ2р\ узнают сайт связывания антигена, однако "внутренний образ" этого антитела не выражен как идиотип.
Теория идиотипических сетей в настоящий момент имеет некоторое практическое применение, в том числе при поиске мембранных рецепторов. Одним из затруднений в этой области является очистка рецепторов, часто очень гидрофобных, а преимуществом антиидиотипических антител является то, что они могут быть получены в тех случаях, когда нужный антиген не может служить хорошим иммуногеном или недоступен. Иммунизация одним из лигандов изучаемого рецептора позволяет получить первое антитело, направленное против лиганда (АЫ), а затем второе (АЬ2), направленное против первого антитела АЫ. Это второе антитело АЬ2Р будет являться «внутренним отражением» исходного лиганда. Применение данного метода позволило получить антитела к некоторым рецепторам. В таб. 1 представлены иммуногены, которые позволили получить антиидиотипические антитела, обладающие соответствующими функциональными свойствами [113].
Во многих случаях эти антиидиотипические антитела позволяют провести иммунопреципитацию рецепторов и модуляцию их функций. Они могут быть также использованы для очистки рецепторов. Например, никотиновый рецептор ацетилхолина был хроматографически очищен с использованием сорбента, содержащего антиидиотипические антитела к его лиганду [113].
Возможность обходить иммунологическую толерантность, токсические эффекты иммуногенов или воспалительный эффект при иммунизации идиотипами позволяет создавать достаточно эффективные антиидиотипические вакцины. Например, антиидиотипические антитела к фосфорилхолину (поверхностному антигену бактерий) были использованы для иммунизации мышей против летальной инфекции Streptococcus pneumoniae [114]. Вакцинированные мыши развивали высокий титр антител к фосфорилхолину, что защищало их от инфекции. Другим примером является работа по иммунизации шимпанзе кроличьими антиидиотипическими антителами к поверхностному антигену вируса гепатита В [115]. Было продемонстрировано, что иммунизированные антиидиотипическими антителами, но не контрольными антителами кролика, шимпанзе защищены от инфекции. Для моноклональных антиидиотипических антител в системе in vitro была продемонстрирована нейтрализация некоторых вирусов, в частности антиидиотипическое антитело 2-17-C3ssc нейтрализовало полиовирус типа II [116].
Стоит отметить, что для человеческих моноклональных антител также была продемонстрирована возможность индукции антиидиотипического иммунного ответа, защищающего от инфекции. При иммунизации мышей человеческим IgM, связывающим глюкороксиломаннат, компонент клеточной стенки Cryptococcus neoformants, было зафиксировано увеличение продолжительности жизни инфицированных животных [117].
Представляется возможным использовать антиидиотипические антитела в терапии раковых заболеваний. Так, была проведена попытка использования аналогичной стратегии для- заболеваний, дающих положительный ответ на карциномоэмбриональный антиген [118]. Принято считать, что центр связывания антигена обычно образован участками вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, хотя известны случаи, когда идиотип представлен только одной из цепей. Гаптен может ингибировать связывание антиидиотипических антител с соответствующими сайтами связывания их идиотипов. Из этого следует, что уникальные идиотипические особенности антител находятся в одном или нескольких гипервариабельных участках вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей. Секвенирование и иммунохимические исследования показали, что аминокислотные остатки второго и третьего гипервариабельных участков тяжелой- цепи важны для определения специфичности идиотипов [119]. Однако, эти исследования не в состоянии детально охарактеризовать идиотоп в терминах молекулярной структуры антитела.
Вследствие того, что исходный антиген и антиидиотипическое антитело могут конкурировать за один и тот же центр связывания специфического антитела, некоторые антитела могут нести в себе "внутреннее отражение" исходного антигена; что было продемонстрировано на примере функциональной идиотипической мимикрии лигандов биологических рецепторов [120]. К настоящему времени проведены подробные структурные исследования антиидиотипических антител в нескольких системах. Система антител к лизоциму.
Клонирование генов вариабельных доменов моноклональных антител 5-Н4 и 6В8-Е12
Вариабельные (V) домены находятся в N-концевой части цепей иммуноглобулинов. Они состоят из каркасных участков - FWR (framework) и гипервариабельных участков - CDR (complimentarity-determining regions). Больше всего различаются аминокислотные последовательности гипервариабельных участков, тогда как последовательности каркасных участков достаточно консервативны. Непосредственно к константным областям примыкают J-сегменты и D-сегмент тяжелых цепей. Три уложенных в петли CDR и, в меньшей степени, FW-районы V-доменов каждой из цепей взаимодействуют с антигеном, формируя антигенсвязывающий сайт антитела. Аминокислотная последовательность J-сегментов и D-сегмента тяжелых цепей также оказывает влияние на конформацию антигенсвязывающий сайта.
В силу того, что последовательности ДНК, соответствующие первому FWR-району и С-концевой части J-сегмента высококонсервативны, в пределах вида животных, возможно, клонировать V-гены антител, с использованием наборов праймеров к этим областям. В качестве источника мРНК для клонирования генов вариабельных доменов моноклональных антител 5-Н4 и 6В8-Е12 использовались соответствующие гибридомы. Амплификация вариабельных доменов легкой цепи (VL) проводилась с использованием прямых вырожденных нуклеотидных праймеров 1-4, соответствующих N-концевым последовательностям легких цепей мышиных антител, и обратных вырожденных праймеров, соответствующих J-фрагментам мышиных антител. Вариабельные домены тяжелой цепи (VH) амплифицировали при помощи набора прямых вырожденных праймеров, созданных на основе основных лидерных последовательнстей тяжелых цепей антител мыши [134], и обратных примеров для J-фрагментов. Очищенные ПЦР-продукты, соответствующие по размеру VL- и VH-фрагментам, были лигированы в плазмиду pGEM5Zf(+), обработанную рестриктазой EcoRV. Полученными лигатами трансформировали клетки Е. coli штамма DH5a. Клоны, отобранные в результате бело-голубого скрининга, были дополнительно проверены на наличие вставки нужного размера методом ПЦР с колоний с использованием плазмидных праймеров M13forw и M13rev. Для положительных клонов методом секвенирования по Сенгеру была определена нуклеотидная последовательность цепей ДНК и предсказана первичная структура, соответствующая FvH и FvL районам иммуноглобулинов. (Рис. 20, 21)
Сравнение аминокислотных последовательностей антител 6В8-Е12 и 5-Н4 с последовательностями известных антител и банка последовательностей (Protein Data Bank) показало, что последовательность VH-региона идиотипического антитела сходно с аналогичной последовательностью антитела против белка р24 поверхности вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1 [135]. Последовательность вариабельного домена легкой цепи 5-Н4 показала высокую степень сходства с легкой цепью антитела F11.2.32, полученного против протеазы ВИЧ 1 [136], и легкой цепи моноклонального антитела 2b-2F; это антитело ингибирует рибонуклеазную активность ангиогенина, реагируя с его ключевыми каталитическими остатками [137]. Последовательности легких цепей антител 5-Н4 и 2b-2F имеют всего пять различий в аминокислотных остатках, причем только три из них гипервариабельных областях (один расположен в CDR1, два в CDR3). Аминокислотные последовательности легких цепей антител 5-Н4 и F11.2.32 также имеют пять различий и два из них находятся в CDR1. Антитело F 11.2.32 имеет интересную структурную особенность: легкая цепь образует «выпячивание» CDR1, формируя подобие «пальца», который предположительно входит в активный сайт при связывании с протеазой ВИЧ 1 [136]. На основе данных по первичной структуре мы построили компьютерную трехмерную модель одноцепочечного антитела 5-Н4 .
Даная модель была построена с использованием программного обеспечения Insight II на основе двух структурных моделей из Protein Data Bank с высокой VH+VL гомологией, ldzb (анти-лизоцим scFv 1F9 [138]) и ljp5 (scFv фрагмент антитела 1696 против протеазы ВИЧ 1 [139]).
Анализ ЗБ-модели антитела 5-Н4 показал наличие плоской поверхности, образованной тяжелой цепью, что характерно для белок-связывающих антител, и наличие выступающей вперед легкой цепи, которая, по всей видимости, взаимодействует с активным центром субтилизина и, таким образом, может участвовать в передаче образа этого активного центра посредством идиотипической сети от фермента к антиидиотипическому антителу.
Последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела 6В8-Е12 сходна с VH последовательностью анти-СБ4 моноклонального антитела Q425 и VH последовательностью антитела 2Н1 - полисахарид связывающего антитела [140]. VL последовательность антитела 6В8-Е12 показала высокое сходство с последовательностью легкой цепи антитела AN02 [141].
Сравнительный анализ первичных структур субтилизина Карлсберг и антитела 6В8Е12 — показал отсутствие каких-либо схожих мотивов в указанных последовательностях. ЗБ-модель для одноцепочечного антитела 6В8-Е12 создавалась аналогично модели для 5-Н4. В качестве матрицы использовалась lqok (scFv против анти-карциноэмбрионного антигена [142]), как структура с высокой VH+VL гомологией. При анализе этой модели было установлено наличие плоской поверхности, типичной для белок-связывающих и пептид-связывающих антител, и широкой «щели» между VH и VL CDR участками с высокой концентрацией гидрофобных аминокислотных остатков, что возможно и определяет алифатическую и ароматическую специфичность абзима 6В8-Е12 .
Методы работы с бактериями Escherichia coli
Из отдельной колонии бактерий выращивали ночную культуру, добавляли глицерин до концентрации 12%, инкубировали 20 минут, делили на аликвоты по 1 мл, замораживали их в жидком азоте и хранили при -70 С. Штамм из музея рассевался истощающим штрихом на чашку Петри, содержащую 30 мл среды LB-arap, инкубировался 14-16 часов при 37 С в воздушном термостате. Ночная культура Бактериальную колонию помещали в 5 мл среды LB или 2xYT с добавлением селективного антибиотика и наращивали клетки при перемешивании при 37 С ночь. Получение электрокомпетентных клеток Клетки из музея истощающим штрихом высевались на чашку Петри с LB-агаром без антибиотика, инкубировались 14 часов при 37 С в воздушном термостате. Отдельную колонию инокулировали в 5 мл 2xYT без антибиотика для получения ночной культуры и растили при 37 С с хорошей аэрацией. 250 мкл и 750 мкл ночной культуры высевали с разбавлением 1:1000 и 1:333 соответственно в 2 2-х литровые банки содержащие по 250 мл среды SOB и растили при 37 С с хорошей аэрацией до оптической плотности 0,4 О.Е., но не более двух часов. Затем клетки охлаждали во льду около десяти минут, стерильно переносили в охлажденные центрифужные стаканы на 250 мл, центрифугировали на центрифуге Beckman, 4000 об./мин 10 минут при 0 С.
Суспендировали клетки в. небольшом объеме ледяной стерильной деионизированной воды, переносили в стерильные охлажденные центрифужные стаканы на 35 мл, доливали водой до верху, центрифугировали в тех же условиях. Повторяли еще 2 раза промывку водой, затем промывали охлажденным 10% глицерином. Осадок суспендировали в 2-3 мл 10% глицерина, разносили по 100 мкл в стерильные охлажденные эппендорфы, после чего замораживали в жидком азоте и хранили при - 70 С.
Компетентность клеток проверялась при трансформации плазмидой с известной концентрацией и принималась равной (количеству выросших колоний)/(количество плазмиды, мкг) Трансформация клеток E.coli методом электропорации Электропорация проводилась на приборе фирмы Genetronics, согласно инструкции производителя. Использовались 1 мм кюветы фирмы BioRad. К размороженной на льду аликвоте (100 мкл) электрокомпетентных клеток, добавляли раствор плазмиды или очищенную и обессоленную лигазную смесь, перемешивая, переносили клетки в охлажденную кювету и проводили электропорацию (1,2-1,4 В/5,19-5,22 мсек). Переносили в 1 мл теплой среды SOC без антибиотиков, инкубировали в воздушном термостате при 37 С 1 час для начала экспрессии генов устойчивости к селективным антибиотикам. Затем высевали (100 мкл при трансформации плазмидой, 1 мл при трансформации лигазной смесью) на чашку Петри с LB-агаром, с добавлением селективных антибиотиков, и помещали в воздушный термостат 37 С на 14-16 часов. ПЦР с колоний
Амплификацию проводили на приборе DNA Cycler 480 Perkin-Elmer, США по следующей схеме: Готовили инкубационную смесь следующего состава (из расчета на общий объем 25мкл на одну реакцию) 2,5 мкл 10х буфера для Taq-полимеразы по 10 пМ прямого и обратного праймера по 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата) вода до 24 мкл Разносили по пробиркам по 22 мкл, в каждую пробирку помещали кусочек парафина. Бактериальные колонии переносили петлей в пробирки и одновременно делали штрихи на свежей, размеченной чашке Петри с твердой питательной средой (которую затем помещали в воздушный термостат на 37 С). Помещали пробирки в прибор, проводили денатурацию при 94 С 3 минуты, добавляли в оставшуюся инкубационную смесь Taq-полимеразу и разносили по пробиркам на последней минуте первого цикла денатурации. Проводили 25 циклов ПЦР (денатурация: 94 С - 30 сек, отжиг праймера X = 2С х п (А/Т) +4С х п (Г/Ц) -5С - 30 сек, элонгация 72С - 30-90 сек).
Продукты полимеразной цепной реакции анализировали электрофорезом агарозном геле. Работа с белками Выделение и очистка антител. Выделение поликлональных антител класса IgG из сывороток крови мышей проводили с применением следующей методики. Глобулиновую фракцию сыворотки получали трехкратным высаливанием сульфатом аммония при 50% насыщения. Дальнейшую очистку IgG антител осуществляли на аффинной колонке HiTrap Protein-G Sepahrose (Pharmacia) в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,6. Колонку промывали до прекращения дрейфа базовой линии, но не менее чем 100 объемами буфер нанесения. Антитела элюировали 100 мМ раствором глицин-HGl рН 2,6 и немедленно- нейтрализовали 2 М раствором трис основания до рН 7,6. Все растворы для хроматографической очистки перед использованием стерилизовали автоклавированием. Непосредственно перед использованием колонку очищали 15 объемами 100 мМ раствора глицина-НС1 рН 2,6 и 2М LiCl. Дальнейшую очистку проводили на анионобменной смоле MonoQ с элюцией белков солевым градиентом NaCl 0-0,25 М в 10 мМ Tris-HCl рН 8,0 в 30 объемах колонки. Скорость потока составляла 0,8 мл/мин. Заключительным этапом очистки являлась гель-фильтрация на колонке Superdex 75 в буфере PBS на скорости 0,8 мл/мин. Отсутствие видимых белковых примесей в очищенных препаратах антител контролировали ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси синим. Очистка рекомбинантных антител (ScFv):
Ночную культуру клеток, трансформированных необходимой генетической конструкцией, высевали в среду 2xYT в разведении 1:100, подращивали до достижения оптической плотности 0,6 единиц на 37 С (1 ч. 40 мин. - 2 ч.). Индуцировали добавлением IPTG до 0,1 мМ. Растили культуру при +30 С в течении 6 часов. Клетки из 250 мл среды, осаждали центрифугированием 5 минут на скорости 5000 об/мин при 4 С. Ресуспендировали примерно в 1/20 исходного объема (12-15 мл) буфера, содержащего 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0. Добавляли 1/50 объема свежеприготовленного раствора лизоцима до концентрации 0,2 мг/мл, держали на льду 25-30 мин. Затем добавляли 1/100 объема 10% раствора Triton Х100, инкубировали, помешивая, 10 минут при 37 С. Добавляли раствор ДНКазы I до концентрации 5 мкг/мл и MgCb до 8 мМ икубировали 10 минут при 37 С (до полного исчезновения вязкости). Центрифугировали на скорости 10000 об/мин 10-20 минут при 4 Є. Супернатант наносили на предварительно уровновешенныт буфером? металлохелатныш сорбент Talon; Superflbw (BD GIIM) на скорости 0,5 мл/мин; Затем колонку промывали 100 объемами; раствора, содержащего- 50 мМ фосфата натрия, 300 мМ NaCl!, pHi 7,0: Элюцию рекомбинантного белка проводили 150 мМС раствором имидазола в, 50 мМ фосфатном? буфере: рй Щ) на скорости 0;5 мл/мин. бразец после металлохелатной хроматографии; диализовали: против. 10 мМ Tris-HCl рНС 8,0: Дальнейшую очистку проводили на анионобменной смоле; MonoQ с элюцией белков, солевым градиентом; NaCl 0-0-25 М в; 10 MMJ Tris-НС1 рН 8,0 в 30 объемах: колонки. Скорость, потока; составляла; 0,8: мл/мин. Заключительным- этапом- очистки являлась- гель-фильтрация г на колонке Superdex75 вбуфере PBSna скорости 0;8;мл/мин.
