Содержание к диссертации
Введение
ГДАВА I. Поверхностные маркеры В-лимфоцитов на различных стадиях дифференцировки 8-30
ГЛАВА 2. Моноклональные антитела к дифференцировочным антигенам В-лимфоцитов и иммунологическое типирова-ние клеток при лимфопролиферативных заболеваниях 31-40
ГЛАВА 3. Материал и методы исследования 41-56
ГЛАВА 4. Получение штамма гибридных, клеток, 57-64
ГЛАВА 5. Изучение специфичности ЦКАТ ИП0-І0 на линиях клеток лейкозов и лимфоы человека, клетках крови, кроветворных и лимфоидных органов практически здоровых людей 65-73
ГДАВА 6. Изучение с помощью моноклональных антител антигенов поверхностных мембран лимфоцитов при митогенной стимуляции 74-84
ГЛАВА 7. Иммунологическая характеристика клеток больных при лимфоидных формах лейкозов человека 85-107
7.1. Острый лимфоблаетный лейкоз S5-S3
7.2. Хронический лимфолейкоз 93-101
7.3. Волосатоклеточный лейкоз 101-10
7.4. Миеломная болезнь 105-107
Вывода I20-I2I
Литература 123-150
- Поверхностные маркеры В-лимфоцитов на различных стадиях дифференцировки
- Моноклональные антитела к дифференцировочным антигенам В-лимфоцитов и иммунологическое типирова-ние клеток при лимфопролиферативных заболеваниях
- Изучение специфичности ЦКАТ ИП0-І0 на линиях клеток лейкозов и лимфоы человека, клетках крови, кроветворных и лимфоидных органов практически здоровых людей
- Иммунологическая характеристика клеток больных при лимфоидных формах лейкозов человека
Введение к работе
Совершенствование методов диагностики опухолевых заболеваний лимфоидной ткани» является одной из актуальнейших проблем современной онкологии и гематологии. Многообразие цитологических вариантов лимфоидных форм лейкозов обусловлено злокачественной трансформацией различных по своей природе клеток-мишеней, отличающихся по стадиям созревания, на которых произошло нарушение дифференцировки клеток, наличием необычных фенотипических признаков при сохранении признаков нормальных клеток-аналогов {Н.С.Кноляк с соавт., 1972; Р.С.Самойлова с соавт., 1982; З.А.Бутенко с соавт., 1984; А.И.Воробьев, М.Д.Бриллиант, 1985; Murphy et al ., 1983).
В последние годы, наряду с классическими морфологическими и цитохимическими методами, в уточненной диагностике лимфоидных форе лейкозов стали шире применять иммунодиагностические методы с использованием монокл опальных антител (ЖАТ) С А. Ю.Барышников, 1984; Г.Ю.Митерев с соавт., 1987; Bernard et al -, 1961; Poon , lodd ( 1986; Greaves et al, 1983, 1988).
Обнаружение с помощью MKAT новых поверхностных маркеров В-лим-фоцитов, которые являются субстратом ряда лимфоидных форм лейкозов человека, расширяет наши знания о стадиях дифференцировки клеток этого ряда, дает возможность выяснить принадлежность злокачественных клеток к одной из линий лимфолоэза, определить уровень блока дифференцировки клеток патологического клона при различных формах и цитологических вариантах заболеваний.
В нашей стране получен ряд МКАТ к поверхностным антигенам лимфоцитов человека. Среди них МКАТ против la-подобного антигена (ИК0-І), панель ЫКАТ против дифференцировочных антигенов Т-лимфоцитов серии ИКО, полученные А.Ю.Барышниковым с соавт.
(1984, 1985, 1988) в Институте клинической онкологии ВОНЦ АМН СССР. В Институте иммунологии МЗ СССР А.В.Филатовым с соавт. CI986, 1987) создана панель даКАТ против антигенов Т-лимфоцитов человека. Ими же получены МКАТ IB4, реагирующие как с В-, так и с Т-лимфоцитами. МКАТ к антигенам Т-лимфоцитов и других кроветворных клеток получены Т.И.Булычевой с соавт. в ВГНЦ МЗ СССР CI988). МКАТ к тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов получены в лаборатории иммунологии ВКНЦ АМН СССР О.В.Рохлиным с соавт. (1986) и В.Б.Климовичем с соавт. CI988) в центральном научно-исследовательском рентгено-радиологическом институте МЗ СССР.
МКАТ, выявляющие дифференцировочные антигены, специфичные только для В-лимфоцитов, в отечественной литературе ранее не были описаны. Поэтому получение таких МКАТ и их использование наряду с морфологическими признаками, цитохимическими и иммунологическими маркерами для характеристики патологических клеток больных лимфоидными формами лейкозов человека является актуальной задачей.
Диссертация выполнена в соответствии с научно-техническими программами 0.69.02 "Злокачественные новообразования", 0.69.05 "Лейкозы человека и сельскохозяйственных животных" и проблемой 5.2.3 КП НТП стран-членов СЭВ "Создание новых диагностических средств и методов на основе биотехнологии, в том числе монокло-нальных антител для диагностики инфекционных, соматических, онкологических заболеваний, аллергических состояний, нарушений иммунитета".
Целью работы явилось получение и характеристика специфичности МКАТ к дифференцировочному антигену В-лимфоцитов человека и их использование наряду с отечественными и зарубежными МКАТ для изучения, классификации и дифференциальной диагностики лимфоид-ных форм лейкозов человека.
Задачи исследования:
Получение МКАТ против дифференцировочного антигена В-лим-фоцитов человека.
Изучение специфичности полученных МКАТ на линиях клеток человека различного происхождения.
Определение специфичности МКАТ при изучении клеток крови, кроветворных и лиыфоидных органов здоровых людей.
Изучение с помощью МКАТ антигенов поверхностных мембран культивируемых ик витро лимфоцитов при митогенной стимуляции.
Характеристика с помощью МКАТ поверхностного фенотипа пато логических клеток крови при некоторых формах злокачественных лиыфопролиферативных заболеваний (хронический лимфолейкоз, острый лимфобластный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, миелоыная болезнь).
Выяснение возможности применения МКАТ для классификации и уточненной диагностики отдельных форм и цитологических вариантов лейкозов человека.
Научная новизна результатов исследования. Впервые в нашей стране получены и охарактеризованы МКАТ, обозначенные ИП0-І0, выявляющие дифференцировочный антиген В-лимфоцитов человека, эк-спрессированшй на различных стадиях их развития - от ранних предшественников В-лимфоцитов до иммунобластов. Антиген, распознаваемый МКАТ ЖЮ-10, не идентичен ранее охарактеризованным маркерам В-лимфоцитов таким как slg , Fc- и СЗ-рецепторы,
СІМ9 ) CD20 , CD21 , CD22 , СВ23 » CD24 , HLA-L* анти-
гены.
С помощью панели МКАТ, включающей МКАТ ИП0-Ї0, охарактеризован поверхностный фенотип патологических клеток больных острым
лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), хроническим лимфолейкозом СХПЛ), волосатоклеточным лейкозом (ВКЯ), ыиеломной болезнью и установлено, на каком уровне произошел блок дифференцировки клеток патологического клона. В зависимости от степени зрелости лимфоцитов периферической крови больных выделено четыре подварианта не-Т-ОЛЛ, два подварианта Т-ОЛЛ, две группы больных ХЛЛ.
Практическая ценность работы* Проведенные исследования показали возможность использования ЖАТ ИП0-І0 в комплексе с другими МКАТ к линейно-специфическим, а также дифференцировочныы антигенам Т- и В-лимфоцитов, морфологическими и цитохимическими методами для уточненной дифференциации отдельных форм и цитологических вариантов системных опухолевых заболеваний лимфоидной ткани.
Внедрение результатов исследования в практику. МКАТ ИП0-І0 приняты в производство и выпускаются Кооперативным научно-производственным объединением "Діагностикум". МКАТ ИП0-І0 применяются в диагностических исследованиях в лабораториях клинической иммунологии, гематологических и онкологических клиниках 33 научных и практических учреждений МЗ СССР, АМН СССР, МЗ УССР, МЗ РСФСР.
Основные положения диссертации изложены в 4 научных публикациях. Материалы работы доложены на конференции молодых ученых Института проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого АН УССР (1987), Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1983), Всесоюзной конференции гематологов и трансфузиологов (Сухуми, 1988).
Основные научные положения» которые выносятся на защиту:
I. Получены МКАТ ИПО-Ю против антигена В-лимфоцитов человека, экспрессированного на различных стадиях дифференцировки кле-
ток этого ряда - от ранних клеток-предшественников до иммуно-бластов.
Антиген, распознаваемый МКАТ ИПО-Ю, не идентичен таким известным маркерам В-лимфоцитов, как поверхностные иммуноглобулины ( slg ), Рс-( СЗ-рецепторы, антигены С&\Э » сшо ,hla-Dt, CD21 ', С1Э22 , CD23, CD24 и, вероятно, участвует в процессе активации В-лимфоцитов.
Антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, является маркером В-клеточных линий, В-лимфоцитов периферической крови, кроветворных и лиыфоидных органов практически здоровых людей.
При изучении иммунологического фенотипа клеток крови больных с использованием панели реагентов, включающих МКАТ ИПО-Ю, выделено 2 подварианта Т-ОЛЛ, 4 подварианта не-Т-ОДЛ, две группы больных с В-клеточным ХШ1.
Антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, является маркером клеток с волосатоклеточным лейкозом и не обнаружен на клетках периферической крови больных миеломной болезнью.
Структура и объем работы. Материал диссертации изложен на страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Библиографический указатель включает 236 источников литературы С 48 отечественных и 188 иностранных авторов). Диссертация иллюстрирована II рисунками, 10 таблицами и 5 микрофотографиями. Работа выполнена в отделе цитологии опухолевого роста (зав. - чл. корр. АН УССР В.Г.Пинчук) и лаборатории цитохимии и иммуноцитологии (зав. - проф. Д.Ф. Глузыан) Института проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого АН УССР.
ШАБА I. ПОВЕРХНОСТНЫЕ МАРКЕШ В-ЛЙШОЦИТОВ НА РАЗЛИЧНЫХ СТАДИЯХ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
Изучение поверхностного фенотипа Т- и В-лимфоцитов и их субпопуляций приобретает все большее значение при уточнении патогенеза и разработке усовершенствованных способов диагностики лимфопролиферативных заболеваний (ЛПЗ). В основе развития ряда форы ЛОЗ лежит ыоноклональная пролиферация В-лимфоцитов, блок дифференцировки которых произошел на определенной стадии созревания. Дри этом злокачественные клетки в основном сохраняют антигенные характеристики нормальных клеток-аналогов. Точное опре деление уровня дифференцировки и иммунологическое типирование В-лимфоцитов, составляющих субстрат ЛПЗ, имеет большую теоретическую и практическую ценность. Исходя из этого, представляется необходимым остановиться на наиболее важных маркерах В-лимфоцитов» нашедших применение в диагностике и классификации ЛПЗ.
Основой идентификации различных субпоцуляций лимфоидных клеток служат особенности антигенного состава и рецепторов их поверхностных мембран. На поверхности В-лимфоцитов присутствуют легко выявляемые иммуноглобулины ( ig ) /192/, которые играют роль рецептора для антигенов /22, 23, 30, 31, 231/ и участвуют в трансмембранной передаче активирующего клетку сигнала /84/« Иммуноглобулиновые рецепторы В-лимфоцитов являются интегральными компонентами их цитоплазматической мембраны. Они встроены в мембрану, пронизывая оба ее слоя так, что конец их молекулы оказывается погруженным в цитоплазму /28/. В качестве антиген-связывающих рецепторов лимфоцитов В-ряда могут выступать Ig различных классов и подклассов, состоящих из тяжелых цепей К (tt, ^, , &(-* и оди01*0 типа легких цепей < или
Рецепторний IgM имеет константу седиментации 8S , т.е. представляет собой только одну мономерную единицу сывороточного. IgM /39/. Почему в В-лимфоцитах, синтезирующих мономерный IgM , не происходит сборки дентамера 19S IgM f аналогично сывороточному? Как известноі помимо легких и тяжелых цепейі в полимерных формах сывороточного igA и в сывороточном IgM содержится еще одна небольшая полипептидная цепь (9^ -цепь) с мол. массой около I2Q00 Д. Ей отводят важную роль в сборке полимерных форм Ig /19/. По способности к синтезу этой полипептидной цепи, не имеющей структурного родства с полипептидными цепями Ig , можно судить о созревании клеток В-ряда в онтогенезе, в том числе об их способности выполнять те или иные функции. В ходе онтогенеза В-лиыфоцитов поверхностные IgM -рецепторы появляются первыми /213, 235/. В отличие от 19& IgM , мембранный IgM не секретируется, а слущивается с поверхности клетки в комплексе с мембранным липидом с полупериодом более 20 часов /234/* Хотя в молекуле мембранного IgM имеются "коровые" сахара (ман-ноза и глюкозамин), он лишен концевых углеводов (галактозы и фукозы), необходимых для секреции Ig . Поскольку эти сахара присоединяются к jU -цепи непосредственно перед секрецией из клетки, можно думать, что неспособность секретировать IgM связана с отсутствием в малых лимфоцитах галактозилтрансферазы. Еще одно различие синтеза мембранного и секретируемого IgM -чуствительность первого к актиномицину D
В-лимфоциты с рецепторами класса IgM являются универсальными предшественниками В-клеток, синтезирующих Ig других классов /41/. На 13-Й неделе эмбрионального развития у человека на поверхности В-лимфоцитов появляются, а затем постепенно увеличиваются в количестве рецепторы другого класса - IgD , причем
igM не исчезает с поверхности лимфоцитов /69, 143/. IgD , в отличие от других классов Ig , секретируется лимфоцитами в незначительных количествах /7/. Независимо от видового происхождения В-лимфоцитов в том случае, когда они экспрессируют одновременно два класса иммуноглобулиновых рецепторов, и тот и другой белки имеют одинаковый тип легкой цепи ( эе или А. ) и направлены к одной и той же антигенной детерминанте /82, 174/* Появление способности к экспрессии IgD -рецепторов по времени совпадает с возникновением способности В-лимфоцитов отвечать на антигенный стимул превращением в антителопродуцирующие клетки. До этого периода В-лимфоциты, с точки зрения их иымунореактивности, относятся к числу незрелых. Специфическая функция IgD-рецепторов мало изучена. Поскольку в В-клетках синтез IgD-рецепторов и способность реагировать на тимус-зависимые антигены возникают одновременно, предполагается, что IgD представлены на мембране только тимус-зависимых В-клеток и необходим для их активации тимус-зависимым антигеном /173, 212/.
Если нестимулированные В-лимфоциты экспрессируют только IgM и IgD рецепторы, то В-лимфоциты, появляющиеся после иммунизации или поликлональной активации, могут иметь рецепторы класса IgG> IgA , IgK , Стимулированные антигеном В-лимфоциты могут иметь рецепторы, соответствующие по изотипу одному из подклассов IgG в сочетании с IgM или IgA , только IgA , или igE /82/. Спорным является вопрос о числе и физиологической роли лимфоцитов, несущих на своей поверхности эти рецепторы /172, 184, 213/. Считают, что наличие Ig на поверхности многих клеток обусловлено адсорбцией его из сыворотки крови.
Механизм переключения синтеза рецепторов одного класса на синтез рецепторов другого класса еще во многом не изучен. Повидимо-
- II -
му, ему предшествует "вырезание" на хромосомы части ДНК, несущей структурные гены для константных районов тяжелых цепей, синтез которых прекращается. Этот вывод свидетельствует о необходимости утраты той или иной функции лимфоцитов наряду с приобретением новых в ходе дифференцировки /83/.
Имыуноглобулиновые рецепторы структурно независимы от других встроенных в мембрану В-лимфоцитов белков, например 1а-белка, Ее-рецепторов, рецепторов к эритроцитам мышей, к различным компонентам комплемента. Часть лимфоцитов, как и моноциты, макрофаги и гранулоцити, обладают рецепторами t Ее -участку молекул !g . Ес-рецепторы представляют собой гликопротеиды с мол. массой 50-60 кД. Ранее считали, что присутствие этих рецепторов характерно исключительно для В-лимфоцитов. Однако в более поздних исследованиях Ее -рецепторы были обнаружены не только на В-клетках /132, 188/, но и на Т-лимфоцитах /87, 173/. Т-лимфоциты человека содержат Ее-рецепторы только двух видов - Есу и Есд, Рсцд -рецепторы характерны для Т-лимфоцитов-хелперов, а среди
Еси'-лиыфоцитов преимущественно встречаются Т-лимфоциты-супре с-соры. Для выявления Ее -рецепторов как на В-, так и на Т-клет-ках используют методы розеткообразования, иммунофлюоресценции и иммунорадиоавтографии. Мембранный рецептор к Ес-фрагменту В-и Т-лимфоцитов обуславливает контакт этих клеток с антигеном /221/. Экспрессия Ее -рецепторов к различным классам ig зависит от стадии дифференцировки В-лимфоцитов /19/.
Рецептор к третьему компоненту комплемента - СЗ-рецептор также не является универсальным маркером В-лимфоцитов, так как его экспрессия характерна для Т-лимфоцитов, эритроцитов, моноцитов, макрофагов /196, 120/. Лимфоциты имеют два типа рецепторов к комплементу: "рецепторы иммуного прилипания - СЗЬ и СЗа /196/.
Большинство СЗ+-лиыфоцитов в норме имеют оба типа рецепторов, присутствующих на различных участках плазматической мембраны и взаимодействующих с различными участками молекул - С4 или СЗ. Рецептор, связывающий С?ъ , представляет собой гликопротеид, который удалось очистить из солюбилизированных детергентом мембран эритроцитов, В-лимфоцитов с помощью аффинной хроматографии /120/. Очищенный белок обладал свойством ингибировать образование розеток между эритроцитами, покрытыми СЗЪ , и различными клетками, несущими СЗЪ -рецептор. Мол. масса СЗЪ -рецептора окончательно не установлена. Полученные различными авторами величины колеблются от 55 до 205 кД /Й8/.
Способность В-лимфоцитов реагировать с эритроцитами мышей является отличительной чертой этих клеток /ЇІ4/- В нормальном онтогенезе В-лимфоцитов рецептор к эритроцитам мышей появляется рано, и его выявление может служить маркером ранних стадий диф-ференцировки клеток этого ряда. Клетки с плазмоцитоидной направленностью дифференцировки не способны к образованию розеток с мышиными эритроцитами /149/. Т-лимфоциты, гранулоциты, клетки Ходжкина и Березовского-Штернберга не образуют розеток с эритроцитами мышей /70/.
Все перечисленные выше поверхностные маркеры В-лимфоцитов, кроме рецепторов Ig , не являются маркерами определенных популяций или субпопуляций В-лимфоцитов. Однако они нашли широкое применение при иммунологическом типировании клеток при злокачественных ЛПЗ и выяснении уровня дифференцировки вовлеченных в этот процесс клеток.
Следующим этапом в иммунологической характеристике клеток лимфоидного ряда было изучение маркеров лимфоцитов с помощью мо-ноклональных антител. К началу 80-х годов против антигенов лейко-
- ІЗ -
цитов человека было получено множество антител, постоянный поток информации о которых привел к необходимости систематизации сведений о них и сравнительной характеристике.
С этой целью в Ї98І г. было создано Международное научное сообщество (своеобразная лаборатория-мастерская - Workshop) для обмена антителами и совместной работы по изучению дифференциро-вочных антигенов. В 1982 г. в результате совместных исследований, выполненных по ранее выработанному протоколу, было проведено заключительное совещание, выводы и обобщения которого были опубликованы в книге leukocyte Typing (1984).
В 1984 г. в Бостоне (США) было завершено Второе Международное рабочее совещание по изучению дифференцировочных антигенов лейкоцитов, на котором были представлены результаты изучения специфичности 800 МКАТ. Эти ЖАТ были сгруппированы в ,24 кластера дифференцировки (CD ), каждый из которых включал МКАТ со сходной специфичностью, распознающие антигены с одними и теми же биохимическими свойствами, с одной (или близкой) мол. массой. При связывании с антигенами некоторые МКАТ, принадлежащие к одной группе, полностью или частично блокировали друг друга. Таким образом, МКАТ, объединенные в один кластер, взаимодействуют с одним и тем же или разными эштопами одного антигена.
К 1986 г. МКАТ, направленные против дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека, были сгруппированы в 45 кластера дифференциро вки , среди которых 5 кластеров включали МКАТ направленные против антигенов, ограниченных экспрессией на В-клетках, и один кластер Б-ассоциированных антигенов (табл. I) /176/.
Экспрессия антигенов, будучи исследована на нормальных В-лим-фоцитах, клетках больных лейкозами и лимфоыаыи В-клеточного происхождения, позволяет судить о том, определяется ли этот антиген
Таблица I. Панель МКАТ против В-клеточных дифференцировочных
антигенов
Специфичность
МКАТ
В-клеточная Наименование Мол. Класси-
реактивность МКАТ масса фикация
(kD) (CD)
І. МКАТ, реагирующие только с В-клетками
Сгруппированные Пан-В
Сгруппированные Пан-В Несгруппированные Пан-В
CD1 9
CD20
Сгруппированные Ограниченная 29-110tHD6,
mm і sjio-
1Н11, SHTO-1 Сгруппированные Ограниченная ШШ&, РЬ-13»
Blast-2
CD22
CD23
Сгруппированные Ограниченная В2» BL-13» 143
НВ-5, RPB б
Несгруппированные Ограниченная SHCI._2 ?32
UL-65 ?30
BII6-2, ?
29-132» С-1, SJ12-3G2, ВВ-1, В8.7, В1-4, В1-7, НВ-2, НВ-7
CD21
Продолжение табл. I
Продолжение табл. I
I ~2 3 4 Е~~
Несгруппированше Ограниченная Н616 ?90
/ад/
Условные обозначения: В - В-лимфоциты,
М- моноциты, Г - гранулоцити, Т - Т-лимфоциты.
на протяжении всего онтогенеза (Пан-В) или на определенной стадии дифференцировки В-лимфоцитоіз.
Прототипом GD19 кластера являются МКАТ В4 /91/. Эти антитела определяют антиген, экспрессированный на нормальных и злокачественных В-клетках, полученных из периферической крови, селезенки, лимфатических узлов, миндалин. На Т-лимфоцитах и гранулоцитах не обнаружен dug антиген. Антиген СШ19 экспрессиро-ван на всех пре-В клетках, В-лимфобластоидных линиях клеток, линиях клеток, полученных из лимфомы Беркитта, некоторых линиях миеломных клеток. Следует отметить, что плазматические клетки, выделенные из костного мозга больных с миеломной болезнью, не экспрессируют OD19 антиген. Это дало возможность предположить, что CD19 не содержится на плазматических клетках /188/. Обнаружение, антигена CD19 на злокачественных лимфоидных клетках также подтверждает, что его экспрессия ограничена клетками В-ряда. Все клетки, выделенные от больных с В-клеточныы вариантом хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ), не-Т-клеточным острым лимфобластным лейкозом (не-Т QUI), В-клеточными лимфомаыи, со-
держали антиген Cl>i9 . МКАТ В4 не реагировали с клетками больных острым миелобластным лейкозом, Т-клеточными лейкозами и лим-фомами /III, 176/*
При изучении криостатных срезов лимфатических узлов установлено, что ОІП9 антиген экспрессирован на большинстве клеток в первичных фоликулах и мантийной зоне вторичных фолликулов. Клетки этих зон экспрессируют поверхностные антигены подобно клеткам, выделенным из периферической крови. Некоторые клетки зародышевых центров реагируют с МКАТ В4, что свидетельствует о фе-нотипической гетерогенности клеток после антигенной или митоген-ной активации. Этот антиген появляется на ранних стадиях онтогенеза В-лимфоцитов, но позже Іа-подобного антигена /186/. В-лимфоциты, находящиеся на поздних стадиях дифференцировки, не содержат CD19 антиген. МКАТ против CDig антигена в низких дозах блокируют пролиферацию В-клеток, а также ингибируют активацию В-лимфоцитов /105, 187/.
Примером МКАТ, определяющих антиген CD20 , являются МКАТ BI /80, 91, 179, SI2/. Антиген, выявляемый этими МКАТ, представляет собой негликозилйрованный фосфопротеид с мол. массой 35 кД /75, 177/. МКАТ BI не реагируют с нормальными и злокачественными Т-лимфоцитами, клетками ыиелоидного ростка кроветворения и дают положительную реакцию с В-лимфоцитами, выделенными из периферической крови здоровых людей. Различия между МКАТ, определяющими антигены CD19 и CD20 , заключаются в их реактивности с В-клеточньши линиями и клетками больных с не-Т СИЛ. Антиген CD19 экспрессирован на всех клетках этих линий, тогда как CD20 лишь на 5С$>. При изучении клеток костного мозга было отмечено, что они по мере созревания приобретают су м , CD19 и Сї)20 антигены. Дричем, Ш>і9 и свго антигены появляются раньше су м.
Экспрессия антигена, выявляемого МКАТ BI, сильнее выражена на стадиях дифференцировки от незрелых В-лимфоцитов до плазматических клеток /62/. МКАТ BI реагируют с В-лимфоцитами из лимфатических узлов, миндалин, селезенки, клетками больных с В-клеточными формами ЛГО. Экспрессия CD20 антигена также изучена в тканевых срезах /60, 125, 126/. Лимфоидные фолликулы служат удобной моделью для изучения дифференцировки В-клеток, так как содержащиеся в них клетки соответствуют последовательным стадиям созревания В-лимфоцитов. Большинство лимфоидных клеток первич' ных фолликулов и мантийной зоны реагируют с анти- igM , igD МКАТ, МКАТ против la-подобного антигена, CD20 антигена. Клетки зародышевых центров экспрессируют IgM , igG , СЕ20 антиген, но не содержат IgE . —
Ereedman et al. (І986) в опытах по активации В-лимфоцитов вирусом Эпштейна-Барр (ЭБВ), белком А, анти-Ig сывороткой установили, что CD20 содержится на зрелых и активированных В-клетках и исчезает на терминальных стадиях дифференцировки В-клеток. Большой интерес представляют работы по изучению функциональной роли CD20 антигена /105» 218/. МКАТ IF5 индуцируют активацию В-клеток, тогда как МКАТ В1а и Вів ингибируют функции В-лимфоцитов. МКАТ В1а, добавленные в концентрации 1-Ю мкг/мл к культуре лимфоцитов периферической крови человека в первые 24 часа после активации Щ ингибируют секрецию ig , синтез РНК, вхождение лимфоцитов в клеточный цикл. Используемые МКАТ, однако, не влияют на экспрессию рецепторов к транферину и II.-2 f МКАТ Вїа не ингибируют пролиферацию лимфоцитов, вызванную фор-болмиристатацетатом./99/. МКАТ к CD20 антигену реагируют с различными эпитопами этого антигена. Механизм, с помощью которо-
го МКАТ ингибируют пролиферацию В-лимфоцитов, остается неизвестным.
Антигенные детерминанты антигена GD21 определяются с помощью таких наиболее изученных ЫКАТ как В2 /177, 179/, НВ5 /216/, ЕРБ б /75/. Эти МКАТ реагируют только с субпопуляцией нормальных и злокачественных В-клеток и дают отрицательную реакции с Т-лимфо-*цитами, клетками миелоидного роотка кроветворения. СБ21 антиген слабее экспрессировал на В-клетках периферической крови, чем на В-лимфоцитах из лимфоидных органов. Этот антиген появляется на стадии IgK Igp клеток и исчезает в ходе активации В-лимфоци-тов /55, 75, 156/. Содержание CD21 антигена значительно ниже на В-лимфобластоидных линиях клеток и В-клеточных опухолях по сравнению с CD19 и CE2Q антигенами. Лишь небольшой процент клеток, выделенных из костного мозга, содержит С21 антиген. Он не выявлен на пре-В лимфоцитах, хотя его экспрессия наблюдалась на небольшом количестве клеток больных не-Т ОЛЛ, линиях клеток из лимфомы Беркитта американского типа, ЭБВ - трансформированные лимфобластоидные линии клеток также экспрессируют CD21 антиген. Во многих случаях В-ХЛЛ определяется CD21 антиген. Процент клеток у больных с высоко дифференцированными формами В-клеточных лимфом, содержащих СР21 антиген, значительно ниже числа клеток, зкспрессирующих CD21 , у пациентов с низко дифференцированными лимфомами. Это свидетельствует об исчезновении антигена CD21 по мере созревания В-лимфоцитов. Ни в одном случае миеломной болезни не обнаружен сх>21 антиген. В некоторых случаях Т-ОЛЛ выявлен CD21 антиген с помощью МКАТ В2.Биологическое значение экспрессии этого антигена на Т-клетках при ОЛЛ в настоящее время окончательно не выяснено /177, 55/.
Дри изучении срезов лимфоидных тканей отмечена слабая экс-
прессия CD21 антигена на мембранах лимфоцитов в мантийной зоне и более сильная в маргинальной зоне и зародышевых центрах лим-фоидных фолликулов /60,126/. Дальнейшие исследования показали, что экспрессия антигена CD21 начинается на стадии незрелых В-клеток и прекращается при активации В-лимфоцитов на стадии В-лимфобластов. МКАТ этого кластера блокируют рецепторы к 05а-компоненту комплемента С CR2 ), что предотвращает связывание ЭБВ с В-клетками. СЕ2 содержится на зрелых В-лимфоцитах, но не выявляется на плазматических клетках. МКАТ НВ5 не индуцируют зрелые В-клетки к пролиферации, синтезу Ig /127, 218/.
UD22 антиген - гликопротеид с мол. массой 135 кД. Впервые сведения об МКАТ, определяющих этот антиген, были представлены на втором Международном рабочем совещании по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека в 1984 г. в Бостоне /176/. Этот антиген содержится на В-лимфоцитах, выделенных из периферической крови и лимфоидных органов. Плотность размещения этого антигена на лимфоцитах периферической крови ниже экспрессии сшо антигена, CD22 антиген постепенно появляется в цитоплазме пре-В-кле-ток, находящихся в костном мозге, на клеточной поверхности Iglil В-клеток, на IgM , lgG+ В-лимфоцитах. МКАТ HD6 » НВД » выявляющие этот антиген, не реагируют с Т-клетками, клетками грану-лоцитарного ряда. OD22 содержится на некоторых линиях клеток, полученных из лимфомы Беркитта ( Eaji ,Daudi , Ramos ,Ualm-1 ] и отсутствуют на миеломных, Т-клеточных линиях, линиях клеток миелоидного происхождения. МКАТ, определяющие антиген этого кластера, реагируют подобно МКАТ BI и 1 » выявляющими 6В20антиген, с клетками больных не-Т ОЛЛ. В 2 случаев В-ХЛЛ отмечена экспрессия CD22 антигена /75/. Цри центроцитарной, крупноклеточной центробластной лимфоме также наблюдается экспрессия CD22 антигена
Он содержится на всех клетках при ВКЛ. /169/.
В криостатных срезах лимфатических узлов окрашиваются только лимфоциты мантийной зоны, тогда как клетки зародышевых центров не окрашиваются ЫКАТ к CD22 антигену.
В результате активации В-лимфоцитов ЭБВ, белком А клетки очень быстро теряют CD22 антиген /64, 187/. Таким образом, CD22 антиген начинает экспрессироватъся на стадии пре-В лимфоцитов вслед за появлением GD19 и CD20 антигенов и исчезает на стадии активированных В-лимфоцитов, о чем свидетельствует распределение CD22 на клетках костного мозга, клетках больных не-Т QJIJ1, В-ХПЛ. Считают, что CD22 антиген участвует в регуляции активации В-клеток. Наличие CD22 на клеточной мембране, повидимому, является фактором, определяющим способность В-клеток к ответу на анти-ig антитела посредством увеличения содержания внутриклеточного Са2+ /64, 187/.
Антиген CD25 является глинопротеидом с мол. массой 45 кД /93, 220/. Этот антиген отличается от других В-клеточных анти-генов тем, что он не экспрессируется на зрелых В-лимфоцитах, выделенных как из периферической крови, так и лимфоидных органов. CD23 также не содержится на Т-лимфоцитах, моноцитах, гранулоцитах /87/. МКАТ шгм-6 , PL-13 , Blast2 , выявляющие этот антиген, были получены в результате слияния спленоцитов мышей, предварительно иммунизированных клетками ЭБВ- трансформированных В-лимфобластоидных линий, с клетками миеломы. Поэтому неудивительно, что все ЭБВ- трансформированные лимфобласто-идные линии клеток содержат сшз антиген. Этот антиген не экспрессируется на пре-В, миеломных, Т-клеточных, миелоидных линиях клеток. В большом проценте случаев В-ХЛЛ и 30 случаев не-
ходжкинских злокачественных лимфом наблюдается выраженная эк-
— 22 -
сцрессия этого антигена, отличающегося от антигенов активированных клеток, определяемых МКАТ BB-I /233/, Blast-1 /220/. При параллельном изучении экспрессии СЮ2? антигена и антигена, определяемого МКАТ BB-I, установлено, что процентное содержание положительно реагирующих клеток у отдельных больных с В-ХЛЛ разное. МКАТ BB-I выявляют В-лиыфобластоидный антиген, экспрес-сированный только на Ig клетках. Антиген Blast-1 появляется на шестой день в результате активации В-лимфоцитов анти- Ig . ЭБВ вызывает экспрессию этого антигена позже, чем анти- Is Считают, что МКАТ Blast-1 выявляют антигенные детерминанты активированных В-клеток, функция которых пока неизвестна /220/.
В криостатных срезах лимфатических узлов экспрессия антигена CD25 четко выражена в клетках зародышевых центров и отсутствует в клетках мантийной зоны. Это служит еще одним доказательством того, что CD23 антиген присутствует на активированных клетках. МКАТ Blast-2 , определяющие CD2J антиген, не реагируют с пре-В лимфоцитами, зрелыми В-клетками, тогда как в результате активации В-лимфоцитов уже на третий день обнаруживается пик экспрессии CD25 антигена. МКАТ к CD25 действуют только на клетки, находящиеся в фазе &I и способствуют вхождению лимфоцитов в клеточный цикл /199/.
Среди несгруппированных В-дифференцировочных антигенов можно выделить две группы. Первая включает пан-В антигены, определяемые МКАТ, реагирующими со всеми В-клетками. Вторая содержит антигены, зкспрессируемые на определенных стадиях дифферен-цировки В-лимфоцитов. Представителями первой группы являются антигены, определяемые МКАТ AB-I /129/, BI-2 /136, 227, ЇІ8/. Большинство В-лимфоцитов выделенных из периферической крови, лимфоидных органов, эмбриональной печени, костного мозга, селе-
зенки, экспрессируют эти антигены. Нормальные и злокачественно трансформированные Т-лимфоциты, плазматические клетки, клетки йиелоидного ростка кроветворения при взаимодействии с МКАТ AB-I, BI-2 дают отрицательную реакцию. Вое антитела этой группы реагируют с большинством клеток, выделенных от больных с В-ХЮІ, В-клеточными НЗИ.
Биохимические характеристики антигенов второй группы еще не изучены, что не дает возможности объединить их в кластеры диф-ференцировки. Однако специфичность этих антител достаточно полно изучена в ряде работ /49, 61, 66, 106, 150, 216, 236/ и позволяет судить о том, что эти МКАТ определяют антигены, экс-преесированные на определенной стадии дифференцировки В-клеток.
Помимо МКАТ, реагирующих только с В-клетками, известно зна-чительное количество МКАТ, которые взаимодействуют как с В-лим-фоцитами, так и с клетками иного происхождения. Среди них выделены две группы реагентов: МКАТ, определяющие пан-В клеточные антигены, и МКАТ, реагирующие с В-лимфоциташ, находящимися на определенных стадиях дифференцировки (см. табл. I).
Экспрессия CD24 антигена характерна для В-клеток и грануло-цитов, хотя небольшое число моноцитов также содержит этот антиген /176/. Антиген CD24 содержится на пре-В клетках, линиях клеток из лимфоыы Беркитта, В-лимфоцитах, выделенных из периферической крови и лимфоидных тканей. На клетках больных не-Т 0ЮІ, В-ХЛЛ, В-клеточных НЗЛ также экспрессирован этот антиген. В 50$ случаев при миеломной болезни наблюдается положительная реакция с МКАТ НВ8, НВ9, определяющими CD24 антиген. Функциональная роль CD24 антигена пока остается неизученной.
Немалый интерес для классификации и диагностики лейкозов и лимфом представляет антиген ОЛЛ общего типа С саііа ), опреде-
ляемый МКАТ J-5>, VIL-A1 , Ku-N2 , QKB-cALLA ,.. Їїи-Щ
/112, 135» 180/« cALLA был выделен и охарактеризован как одно-
,^; цепочечный гликозилированный полипептид с мол. массой 95-100 кД /109, 195/. Впервые cAliA был идентифицирован с помощью адсорбированной антисыворотки кроликов, предварительно иммунизированных клетками больного с ни-Т» ни-В-клеточным вариантом ОЛЯ. сАЪЬА отсутствует на лимфоцитах периферической крови здоровых
, людей. Но он не является лейкозоспецифическим, так как присутствует на небольшой субпопуляции 1а+-клеток в костном мозге. cALLA также был идентифицирован на клетках почечных канальцев и клубочков, эпителии молочной железы, тонкого кишечника, фибро-бластах, линиях клеток, полученных из лимфомы Беркитта, клетках больных ни-Т, ни-В ОЛЛ. Властные клетки больных острым миело-бластным лейкозом, клетки миелоидного ростка кроветворения в норме не несут этот антиген. Установлено, что МКАТ J5 , распознающие cALLA , реагируют с клетками при некоторых вариан-
v."t тах В- и Т-клеточных ЛПЗ /109, 195/ и являются диагностическим маркером фолликулярных лимфом /XI7/. cAiLA экспрессирован на В-лимфоцитах, находящихся на стадии пре-пре-В-клеток, и появляется после la-подобного, CDig , СБ24 антигенов.
Таким образом, благодаря методу соматической гибридизации, за последние годы получен ряд гибридом» секретирующих ,МКАТ к дифференцировочным антигенам В-лимфоцитов человека. Эти МКАТ позволили дополнить наши представления о гетерогенности популяции В-лимфоцитов, экспрессии тех или иных маркеров поверхностных мембран на определенной стадии дифференцировки клеток. Попытки представить цепь последовательных изменений В-клеток в
/,. процессе созревания, использовав такие маркеры дифференцировки как рецепторы к Fc -участку молекул Ig ,третьему компоненту комплемента, иммуноглобулиновым детерминантам привели к созда-
нию схемы онтогенеза В-лимфоцитов. Полученные в результате соматической гибридизации МКАТ позволили обнаружить ряд новых поверхностных маркеров В-лимфоцитов, которые расширили наши знания о стадиях дифференцировки клеток этого ряда и дали возможность более детально охарактеризовать этапы созревания лим-фоидных клеток /96, 97, 102, 103/. Работы в этом направлении заслуживают большего внимания, поскольку определение блока дифференцировки, наступившего в клетках злокачественного клона, важно при выделении иммунологических вариантов ОЛЛ, ХИЛ, НЗЛ. Исходя из этого, представляется необходимым подробнее остановиться на современных данных о стадиях созревания, последовательности экспрессии маркеров при дифференцировке В-лимфоцитов.
Предшественником лимфоцитов и кроветворных клеток является полипотентная гемопоэтическая стволовая клетка (ПГСК) (рис. I) /9, 47/. Дифференцировку ПГСК можно представить как последовательное включение определенных дифференцировочных программ с необратимым блокированием других, что обеспечивает однонаправленность этого процесса в норме /13/. На первом этапе дифференцировки ПГСК образуются частично детерминированные клетки-предшественники лимфо- и миелопоэза. Клетки следующего этапа дифференцировки предшественников лимфопоэза - коммитированные предшественники Т- и В-лимфоцитов /15, 182/, источником которых во взрослом организме является костный мозг /182, 197/;
Одним из ранних маркеров предшественников В-лимфоцитов является la-подобный антиген - гликопротеид с мол. массой 33-37 кД С *С-цепь) и 28 кД ( уЗ-цепь). В ядре клеток определяется фермент Ч&Т /62, 75/. К настоящему времени получено большое количество гибридом, продуцирующих МКАТ против la-подобных ан-
тигенов /б, 49, 123, 156/. Эти МКАТ реагируют о В-лимфоцитами, находящимися на всех стадиях дифференцировки. Экспрессия 1а-подобных антигенов также выражена на моноцитах, активированных Т-лимфоцитах, клетках-предшественниках гранулоцитарного и эри-троидного ряда /115, 160/^ la-подобные антигены неодинаково представлены на поверхности Т- и В-лимфоцитов. На Т-клетках их значительно меньше, они распределены на поверхности диффузно и настолько слабо связаны с мембраной, что слущиваются во время фильтрации клеток через нейлоновую вату« Напротив, на поверхности В-лимфоцитов их много, они располагаются в виде скоплений рядом с г с-рецепторами и относительно стабильны /156/.
Предшественники В-лимфоцитов дают начало пре-пре-В-клеткам /194/. Пре-пре-В-лимфоциты представляют собой гетерогенную популяцию быстро делящихся клеток, на поверхностных мембранах которых постепенно появляются СІУ19 » СБ24 , СБ20 , CD22 антигены /177, 184/* Появление cAlLA предшествует экспрессии антигена CD20 /106, 117/. На следующем этапе лимфопоэза происходит каскад перестроек, начинающийся с генов вариабельных частей тяжелых Ш -цепей Ig , что ведет к появлению пре-В клеток с Ш -цепями в цитоплазме ( су М ) /83, 122/. Пре-В клетки отличаются от В-клеток на терминальных стадиях дифференцировки тем, что они способны секретировать только тяжелые цепи, но не легкие 4ennlg /84/« На мембранах пре-В клеток сохраняются 01)4 CD24 » GD20 , CD22 , сіШЬА, Іа -аНТИ-гены. Причем, экспрессия антигена СШ9 на стадии пре-В клеток достигает максимума. dl в пре-В лимфоцитах уже не обнаруживается.
Дальнейшая дифференцировка клеток В-ряда отмечена появлением на мембране лимфоцитов молекул Xg , в первую очередь igM ,
+
пгск
эанние предшественники І-лимфоцитов
пре-пре-В лимфоциты
пре-В
лимфоциты
Н ; 1
&
IgM, IgD
IgM,IgD
IgM, IgD IgM,IgG,IgA IgM,IgG,IgA v IgG.IgA.IgE,
+
+
незрелые В-лимфоциты
зрелые В-лимфоциты
ш/мунобласты плазматические
клетки
СХЕМА ДІЇФФЕРЕНЦИРОВКИ В-ЛИМФОЧИТОВ.
Рисунок I.
- 28 -Условные обозначения:
la-подобный антиген
CD19 антиген
call антиген
GD24 антиген
CD20 антиген
GD21 антиген
Fc -рецепторы
рецептор к эритроцитам мышей
CD22 антиген
CD25 антиген
СЗ-рецептор
этап дифференцировки
что обусловлено связыванием легких и тяжелых /U -цепей эндо-плазматически ретикулумом и транспортом этого комплекса через аппарат Гольджи на клеточную поверхность. Таким образом, пре-В клетка превращается в ранний В-лимфоцит /116/. Несмотря на наличие igM , эти клетки не способны отвечать на антигенный и митогенный стимулы /142/. Добавление к таким клеткам антиимму-ноглобулиновых реагентов вызывает эндоцитоз IgM-рецепторов. Культивирование ранних В-лимфоцитов, лишенных IgM , в отличие от зрелых В-лимфоцитов, не приводит к восстановлению этих рецепторов. Одновременно с появлением на поверхности ранних В-кле-ток IgM исчезает cAXLA и появляются Рс -рецепторы /200/. В дальнейшем на поверхности ранних В-лимфоцитов появляются IgD рецепторы /147/ и обнаруживаются CD19 і CD24 * CDgo » CD22 антигены. Этим завершается превращение ранних В-клеток в девственные В-лимфоциты, которые, мигрируя из костного мозга, заселяют селезенку и лимфатические узлы /109/. Допускается существование отдельной линии дифференцировки В-лимфоцитов, на поверхности клеток которой экспрессированы только молекулы IgM без ІЄЕ /174, 190/. Считается, что IgM В-клетки дифференцируются В IgM+IgD+ , IgS* , Igb^IgG4" , ІЄД+ КЛЄТКИ. ДрОИСХОДИТ
ли последовательная смена изотипа рецепторов или lgM+ клетки могут превращаться в любую из указанных клеток, пока не ясно /I» 60, 82, 151/. Плотность поверхностных lg детерминант в ходе дифференцировки В-лимфоцитов уменьшается /35, 200/.
Следующим этапом дифференцировки В-лимфоцитов является экспрессия рецепторов к эритроцитам мышей и GD21 антигена /98, 218/. В дальнейшем, после появления СЗ-рецепторов, девственные В-лимфоциты превращаются в зрелые В-клетки /166/. Только после появления СЗ-рецепторов, В-клетки под воздействием тимусзави-
- зо -
симых антигенов с помощью хелперных клеток (Т-лимфоцитов, макрофагов), могут активироваться, подвергаться пролиферации и образовывать клоны /165/. На мембране активированных клеток появляется CD25 антиген и постепенно исчезают рецепторы к эритроцитам мышей, GD21 , GD22 антигены /79, 177/. Поверхность клеток теряет Ее -рецепторы к igM , затем к СЗ, уменьшается плотность поверхностных Fc -рецепторов /132/. При последующей необратимой дифференцировке в антителопродуцирующие плазматические клетки отмечается утрата многих антигенов В-клеточного ряда - GD19 » CD20 , CD2? антигенов /75, 225/, поверхностных Jg , за исключением їа-подобшх и CD24 антигенов. В цитоплазме плазматических клеток обнаруживается значительное количество ig /115/. На поверхности клеточных мембран появляется ряд антигенов плазматических клеток - FC-I, PGA-I, TI0 /53, 56, 74, 109, 163/.
Таким образом, на каждой стадии созревания В-лимфоцитов эк-спрессируется набор диффербцировочных маркеров, среди которых присутствуют антигены, характерные для большинства стадий диф-ференцировки В-клеток - la-, CD19 , CD20 , CD24 > а также антигены, специфичные для клеток на определенной стадии диффе-ренцировки - cALLA , CD23 , CD21 . Уникальность антигенного набора клеток на различных стадиях дифференцировки открывает широкие перспективы для идентификации злокачественных клеток и установления уровня блока дифференцировки клеток патологического клона при различных формах и вариантах ЛПЗ.
- ЗІ -
Поверхностные маркеры В-лимфоцитов на различных стадиях дифференцировки
Изучение поверхностного фенотипа Т- и В-лимфоцитов и их субпопуляций приобретает все большее значение при уточнении патогенеза и разработке усовершенствованных способов диагностики лимфопролиферативных заболеваний (ЛПЗ). В основе развития ряда форы ЛОЗ лежит ыоноклональная пролиферация В-лимфоцитов, блок дифференцировки которых произошел на определенной стадии созревания. Дри этом злокачественные клетки в основном сохраняют антигенные характеристики нормальных клеток-аналогов. Точное опре деление уровня дифференцировки и иммунологическое типирование В-лимфоцитов, составляющих субстрат ЛПЗ, имеет большую теоретическую и практическую ценность. Исходя из этого, представляется необходимым остановиться на наиболее важных маркерах В-лимфоцитов» нашедших применение в диагностике и классификации ЛПЗ.
Основой идентификации различных субпоцуляций лимфоидных клеток служат особенности антигенного состава и рецепторов их поверхностных мембран. На поверхности В-лимфоцитов присутствуют легко выявляемые иммуноглобулины ( ig ) /192/, которые играют роль рецептора для антигенов /22, 23, 30, 31, 231/ и участвуют в трансмембранной передаче активирующего клетку сигнала /84/« Иммуноглобулиновые рецепторы В-лимфоцитов являются интегральными компонентами их цитоплазматической мембраны. Они встроены в мембрану, пронизывая оба ее слоя так, что конец их молекулы оказывается погруженным в цитоплазму /28/. В качестве антиген-связывающих рецепторов лимфоцитов В-ряда могут выступать Ig различных классов и подклассов, состоящих из тяжелых цепей К (tt, , , &(- и оди01 0 типа легких цепей или
Рецепторний IgM имеет константу седиментации 8S , т.е. представляет собой только одну мономерную единицу сывороточного. IgM /39/. Почему в В-лимфоцитах, синтезирующих мономерный IgM , не происходит сборки дентамера 19S IgM f аналогично сывороточному? Как известноі помимо легких и тяжелых цепейі в полимерных формах сывороточного igA и в сывороточном IgM содержится еще одна небольшая полипептидная цепь (9 -цепь) с мол. массой около I2Q00 Д. Ей отводят важную роль в сборке полимерных форм Ig /19/. По способности к синтезу этой полипептидной цепи, не имеющей структурного родства с полипептидными цепями Ig , можно судить о созревании клеток В-ряда в онтогенезе, в том числе об их способности выполнять те или иные функции. В ходе онтогенеза В-лиыфоцитов поверхностные IgM -рецепторы появляются первыми /213, 235/. В отличие от 19& IgM , мембранный IgM не секретируется, а слущивается с поверхности клетки в комплексе с мембранным липидом с полупериодом более 20 часов /234/ Хотя в молекуле мембранного IgM имеются "коровые" сахара (ман-ноза и глюкозамин), он лишен концевых углеводов (галактозы и фукозы), необходимых для секреции Ig . Поскольку эти сахара присоединяются к jU -цепи непосредственно перед секрецией из клетки, можно думать, что неспособность секретировать IgM связана с отсутствием в малых лимфоцитах галактозилтрансферазы. Еще одно различие синтеза мембранного и секретируемого IgM -чуствительность первого к актиномицину D
В-лимфоциты с рецепторами класса IgM являются универсальными предшественниками В-клеток, синтезирующих Ig других классов /41/. На 13-Й неделе эмбрионального развития у человека на поверхности В-лимфоцитов появляются, а затем постепенно увеличиваются в количестве рецепторы другого класса - IgD , причем igM не исчезает с поверхности лимфоцитов /69, 143/. IgD , в отличие от других классов Ig , секретируется лимфоцитами в незначительных количествах /7/. Независимо от видового происхождения В-лимфоцитов в том случае, когда они экспрессируют одновременно два класса иммуноглобулиновых рецепторов, и тот и другой белки имеют одинаковый тип легкой цепи ( эе или А. ) и направлены к одной и той же антигенной детерминанте /82, 174/ Появление способности к экспрессии IgD -рецепторов по времени совпадает с возникновением способности В-лимфоцитов отвечать на антигенный стимул превращением в антителопродуцирующие клетки. До этого периода В-лимфоциты, с точки зрения их иымунореактивности, относятся к числу незрелых. Специфическая функция IgD-рецепторов мало изучена. Поскольку в В-клетках синтез IgD-рецепторов и способность реагировать на тимус-зависимые антигены возникают одновременно, предполагается, что IgD представлены на мембране только тимус-зависимых В-клеток и необходим для их активации тимус-зависимым антигеном /173, 212/.
Если нестимулированные В-лимфоциты экспрессируют только IgM и IgD рецепторы, то В-лимфоциты, появляющиеся после иммунизации или поликлональной активации, могут иметь рецепторы класса IgG IgA , IgK , Стимулированные антигеном В-лимфоциты могут иметь рецепторы, соответствующие по изотипу одному из подклассов IgG в сочетании с IgM или IgA , только IgA , или igE /82/. Спорным является вопрос о числе и физиологической роли лимфоцитов, несущих на своей поверхности эти рецепторы /172, 184, 213/. Считают, что наличие Ig на поверхности многих клеток обусловлено адсорбцией его из сыворотки крови.
Механизм переключения синтеза рецепторов одного класса на синтез рецепторов другого класса еще во многом не изучен. Повидимому, ему предшествует "вырезание" на хромосомы части ДНК, несущей структурные гены для константных районов тяжелых цепей, синтез которых прекращается. Этот вывод свидетельствует о необходимости утраты той или иной функции лимфоцитов наряду с приобретением новых в ходе дифференцировки /83/.
Имыуноглобулиновые рецепторы структурно независимы от других встроенных в мембрану В-лимфоцитов белков, например 1а-белка, Ее-рецепторов, рецепторов к эритроцитам мышей, к различным компонентам комплемента. Часть лимфоцитов, как и моноциты, макрофаги и гранулоцити, обладают рецепторами t Ее -участку молекул !g . Ес-рецепторы представляют собой гликопротеиды с мол. массой 50-60 кД. Ранее считали, что присутствие этих рецепторов характерно исключительно для В-лимфоцитов. Однако в более поздних исследованиях Ее -рецепторы были обнаружены не только на В-клетках /132, 188/, но и на Т-лимфоцитах /87, 173/. Т-лимфоциты человека содержат Ее-рецепторы только двух видов - Есу и Есд, Рсцд -рецепторы характерны для Т-лимфоцитов-хелперов, а среди
Еси -лиыфоцитов преимущественно встречаются Т-лимфоциты-супре с-соры. Для выявления Ее -рецепторов как на В-, так и на Т-клет-ках используют методы розеткообразования, иммунофлюоресценции и иммунорадиоавтографии. Мембранный рецептор к Ес-фрагменту В-и Т-лимфоцитов обуславливает контакт этих клеток с антигеном /221/. Экспрессия Ее -рецепторов к различным классам ig зависит от стадии дифференцировки В-лимфоцитов /19/.
Моноклональные антитела к дифференцировочным антигенам В-лимфоцитов и иммунологическое типирова-ние клеток при лимфопролиферативных заболеваниях
Собрав надосадочную жидкость, во флакон с клетками осторожно добавляли среду ДМШ (10-15 мл). Трехкратное центрифугирование проводили при тех же параметрах. В дальнейшем бессывороточная среда была заменена на среду с 15% HS и антибиотиками. Осадок без взбалтывания заливали 20 мл среды с сывороткой и инкубировали в течении часа при 37С в атмосфере с 5% СОр. Гомогенную суспензию клеток разливали по 0,1 мл в 96-луночные плоскодонные пластиковые планшеты (ЬгпЪго, США) с предварительно приготовленным фидерным слоем перйтоне-альных макрофагов мышей линии ВАЬВ/с. Платы помещали в атмосфере с 5% С02 при 37С.
После 24 часов культивирования в каждую лунку была добавлена ГАТ-среда по 100 мкл» т.е. конечная концентрация ГАТ-среды составляла 50$. Через 48 часов, а затем через 96 часов после гибридизации половина среды была заменена на свежую ГАТ-среду. ГЛТ-среду добавляли в течение двух недель. На 14-й день культивирования ГАТ-среда замещалась на ГТ-среду, а через неделю ДМШ с 15% нз . Из лунок, в которых был обнаружен рост колоний гибридом, отбирали культуральную среду для проведения скрининга специфичности антительной активности методом иммунофлуорес-ценции в непрямом варианте на монослое живых клеток Daudi . В случае положительной реакции проводили клонирование гибридных клеток методом лимитирующих разведений в 96-луночные пластиковые планшеты с расчетом 0,5, I, 10 и 50 клеток на лунку. Клетки, давшие начало клонам, были вторично проверены на способность продуцировать антитела и подвергались реклонированию методом лимитирующих разведений. Клоны обнаруживали на 7-Ю день культивирования. Следует отметить, что при клонировании гибридом, необходимо постоянно проводить скрининг антительной активности. После клонирования и пассирования были отобраны штаммы гибридных клеток.
Данный раздел выполнен совместно с к.б.н. ст. науч.сотр. СП. Сидоренко, к.м.н. науч.сотр. Е.П.Ветровой» мл.н.сотр. А.Г. Бердовой. Электронномикроскопическое исследование гибридных клеток выполнено к.б.н., науч.сотр. О.В.Юрченко.
3.7. Иммунологические методы. Проведенные нами.иммунологические исследования включали изучение маркеров лимфоцитов периферической крови и кроветворных органов здоровых людей и больных ЛПЗ о. помощью непрямого иммунофлуоресцентного метода. Материалом исследования служили клетки периферической крови 20 здоровых людей; клетки миндалин, удаленных в фазе компенсации у 15 больных хроническим тонзиллитом; клетки тимуса 3 детей в возрасте 9-12 лет; клетки эмбриональной печени на 7-24 неделе беременности; клетки крови 43 больных ЛПЗ, в том числе 19 больных хроническим лимфолейкозом, 5 больных волосатоклеточным лейкозом, 13 больных острым лимфобластным лейкозом, 6 больных миеломной болезнью.
Диагноз ставился на основании общепринятых клинических, морфологических, цитохимических, иммунологических критериев. Ци-томорфологические исследования проведены д.м.н. проф. Д.ф. Глузманом. Больные со злокачественными ЛПЗ находились на лечении в гематологическом отделении 25-й клинической больницы г. Киева {зав.-проф. А.Ф.Романова), в отделении детской гематологии Киевского НИИ гематологии и переливания крови МЗ УССР (зав.-к.м.н. В.Д.Дроздова) на базе 14-й детской больницы г. Киева. Выделение фракции мононуклеаров. Для иммунологического исследования готовили суспензии клеток тимуса, миндалин, разволок-няя ткань в охлажденной культуральной среде с последующей фильтрацией через четырехслойный капроновый фильтр. Клетки отмывали путем трехкратного центрифугирования в бессывороточной среде в течение 5 мин. при 400 g.
Мононуклеарные клетки из гепаринизированной периферической крови выделяли с помощью дифференциального центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографина. Для этого гепарини-зированную кровь разводили 0,9% ДаСі в соотношении І;І. В центрифужные пробирки, с предварительно налитым 1,5 мл градиента фиколл-верографина наслаивали Z мл крови. После центрифугирования в течение 30 мин. при 400 g собирали фракцию мононуклеаров, расположенную в виде кольца между слоями градиента и плазмы крови. Суспензию клеток отмывали путем трехкратного центрифугирования в среде ІШАРХ (0, раствор гидролизат лактальбумина в растворе Хенкса без сыворотки) при 400g по 0 мин.
ИммуносЬлуоресцентный метод окраски клеток в монослое. Постановку иммунофлуоресцентного (Иф) теста проводили на предметных стеклах, предварительно обезжиренных в смеси Никифорова. Полоски из Parafilm м с 8-12 отверстиями диаметром 5 мм накладывали на стекла и нагревали на электрической плитке до прозрачности. После прикрепления arafilm и в лунки наносили раствор поли-Ь-лизина (100 мкг/мл PES , мол. масса 40-80 кД) и инкубировали при 37С 40-60 мин. во влажной камере. Следует отметить, что инкубацию на протяжении всего опыта вели во влажной камере. К отмытым в беесывороточной культуральной среде (КС) (ГНАЕХ, раствор Хенкса, среда 199) стеклам прикрепляли клетки-мишени в концентрации 2-4x10 и культивировали 20 мин. при 37С, Для блокировки Ее-рецепторов лимфоцитов в каждую лунку добавляли 10 мкл нормальной кроличьей сыворотки в разведении 1:10 на PBS, предварительно инактивированной при 56С, после чего препараты помещали на 20 мин. в термостат при 37С, а затем переносили в холодильник (20 мин. 4С). Остаток неприкрепившихся к поли-Ь-лизину клеток отсасывали, а стекла промывали круговыми движениями в трех сменах НС. В дальнейшем между культивированием с реагентами стекла каждый раз отмывали в трех стаканчиках с КС, На отмытые клетки-мишени наносили по 50 мкл МКАТ в рабочем разведении, или супернатант из лунок, в которых был обнаружен рост клонов, после чего препараты промывали и инкубировали 30 мин. при 4С с коныогированной ШТЦ кроличьей сывороткой к Ig мыши (Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР) в количестве 50 мкл на лунку. С промытых и подсушенных стекол снимали Parafilm м и наносили 50$ глицерин. Препараты накрывали покровными стеклами и запаивали парафином.
Для изучения экспрессии поверхностных Ig нами использовался прямой вариант ИФ-метода. Подготовку стекол и инкубацию клеток-мишеней проводили как и в случае непрямого варианта ИФ-ме-тода. Затем на промытые в КС стекла наносили меченные ШТЦ кроличьи моноспецифические антисыворотки против Ig человека ( ig G, IgM ) и поликлональные сыворотки против IgG , IgA , IgM , ,- ( Dakopatts , Дания) и помещали на 30 мин. при 4С. Промытые препараты покрывали глицерином, накрывали покровным стеклом, запаивали и микроскопировали при увеличении 900х в люминисцентном микроскопе ЛШАМ ИІ (ЛОМО).
Изучение специфичности ЦКАТ ИП0-І0 на линиях клеток лейкозов и лимфоы человека, клетках крови, кроветворных и лимфоидных органов практически здоровых людей
На первом этапе изучения специфичности полученных МКАТ ИПО-Ю исследованы 12 линий клеток человека различного происхождения. Линии клеток являются интересной моделью для исследования диф-ференцировочных антигенов лимфоцитов, так как большинство из них представляют собой гомогенную популяцию клеток, находящихся на определенной стадии дифференцировки. В то же время, клетки В-лимфобластоидных линий клеток RPMI -1788, PHS , а также клетки миеломы КРИ -8226 представлены элементами на различных стадиях В-клеточной дифференцировки и, по-видимому, дозревают in т/itro . Параллельно с МКАТ ИПО-Ю использовали МКАТ ИК0-І против la-подобного антигена, ИПО-3 к антигену В-бластов человека, экспрессированному на антигензависимой стадии дифференцировки (табл. 4).
МКАТ ИПО-Ю, ИКО-І, ИПО-3 взаимодействовали с поверхностными антигенами клеток ЭБВ+ линий, полученных из клеток лимфомы Беркитта - Daudi, Uamalva, Ea i . С ЭБВ+ линией клеток ЕВ-3 взаимодействовали МКАТ ЙЛО-3 и ИПО-Ю. Ia-подобный антиген не был выявлен на клетках этой линии. При изучении взаимодействия МКАТ ИПО-Ю, ИК0-І с линиями клеток Daudi, HamaLva, Kaji отмечена интенсивная флуоресценция при высоком, но различном относительном содержании антигенположительных клеток. Реакция МКАТ ИПО-3 с клетками этих же линий была несколько ниже по сравнению с МКАТ ИПО-Ю и ИК0-І. Таким образом, несмотря на общность происхождения клеток линий Daudi» Namalva, Надії ЕВ-3, мы не наблюдали однотипной реакции с перечисленными антителами. С клетками Ramos , полученными из лимфомы Беркитта американского типа (ЭБВ-отрицательная), реагировали только МКАТ ИК0-І (14,05). Антиген В-бластов, а также определяемый антителами ИП0-ІО не были обнаружены,
С антигенами поверхностных мембран В-клеточной лимфобласто-идной линии РНЗ реагировали МКАТ ИПО-ІО (2($), ИПО-3 (43,8 ), ИК0-І (98, Qfo). При постановке ИФ-теста с клетками линий HS мы наблюдали разную интенсивность флуоресценции: от сильной в виде ободка, состоящего из крупных гранул, с МКАТ ИК0-І до слабой при взаимодействии с МКАТ ИПОЗ. Относительное число клеток линии КРМІ -1788, реагирующих с ИК0-І и ИПО-3, составляло 59,5% и 51,2$ соответственно. МКАТ ИПО-ІО не реагировали с этими клетками. Подобно МКАТ, определяющим антигены стэ . , отяо , МКАТ ИПО-ІО взаимодействовали с линией клеток миеломы КРЬП -8226 (5 $), причем интенсивность флуоресценции была низкой. Низкая интенсивность свечения, по-видимому, обусловлена небольшой плотностью антигена на поверхностных мембранах клеток. 1а-лодобные антигены, определяемые МКАТ ИК0-І, присутствовали на клетках линии КРМІ -8226. Процент этих антигенположительных клеток был несколько выше (55,0$) по сравнению с клетками, содержащими антиген, выявляемый МКАТ ИПО-ІО. На поверхности клеток линии КРЩ-8226 антиген В-бластов отсутствовал.
Т-клеточные линии, на которых исследовали специфичность МКАТ, отличаются по уровню дифференцировки клеток. Клетки М0ІТ-4, в соответствии со схемой дифференцировки гемопоэтических клеток, предложенной Minowada (1972), являются Т-бластами III, а клетки CGRP-H3B2 имеют характеристику Т-блаатов ІУ. Клетки игка получены из Т-клеточной лимфомы и представлены относительно зрелыми Т-клетками, способными вырабатывать интерлейкин-2. С клетками всех Т-клеточкых линий МКАТ ИПО-IQ, ШО-3, ИК0-І не реагировали.
Отрицательная реакция наблюдалась при взаимодействии МКАТ Ш10-І0 и ШО-3 с клетками К-562. Только 5,0 клеток К-562 реагировали с МКАТ ИК0-І.
Анализируя приведенные данные, можно прийти к заключению, что МКАТ ИПО-Ю, ИПО-З, ИК0-І определяют разные дифференциро-вочные антигены, так как относительное количество клеток отдельных линий, реагирующих с этими МКАТ, неодинаково. МКАТ ИПО-Ю реагируют с В-лимфоцитами, находящимися как на антигеннезавиеи-мой, так и антигензавистдой стадиях дифференцировки В-клеток. МКАТ ИПО-З, определяющие антиген В-бластов; реагируют с большим количеством клеток В-лимфобластоидных линий и дают слабую реакцию с клетками Daudi, Hamalva, Raji, ЕВ-3 по сравнению с МКАТ ИПО-Ю. Распределение антигена, выявляемого МКАТ ИПС-Ю, сходно с распределением la-подобного антигена только на клетках линии Daudi . При изучении остальных линий В-клеточного происхождения наблюдались существенные различия. Так как МКАТ ИПО-Ю не реагировали с Т-клеточньши линиями, а также с линией клеток К-562, можно предположить, что они определяют антиген, присутствующий на В-лимфоцитах человека.
Известно, что лимфоциты на пути превращения в зрелые иммуно-компетентные клетки проходят многоэтапный путь дифференцировки. Для Т- и В-клеток он различен. Созревание лимфоцитов происходит в центральных и периферических органах лимфопоэза, где клетки приобретают и теряют маркеры соответствующего.этапа дифференцировки. В эмбриональном и постнатальном периоде кроветворные и лиыфоидные органы человека содержат различное число Т-, В-лимфоцитов с определенным набором поверхностных маркеров в зависимости от степени зрелости клеток.
Представляло интерес изучить экспрессию антигена, определяемого МКАТ ИПО-Ю на клетках, выделенных из эмбриональной печени, гимуса детей, из небных миндалин, периферической крови здоровых взрослых людей.
Эмбриональная печень играет большую роль в развитии и становлении иммунной системы человека, особенно на самых ранних этапах эмбриогенеза. В-лимфоциты с slgG обнаруживаются в печени на 9-й неделе, а с IgA - на 11-й неделе развития плода. После 11-й недели лимфоциты с IgA, igM, IgG обнаруживаются в печени, селезенке и крови плода /45, 53/. Исходя из этого, нами были изучены клетки эмбриональной печени плодов в различные сроки внутриутробного развития (табл. 5).
Иммунологическая характеристика клеток больных при лимфоидных формах лейкозов человека
Важными цитохимическими критериями для выделения ОЛЛ служили отрицательная реакция при выявлении активности пероксидазы, содержания липидов, обязательное наличие 2 AS -положительной реакции с характерным расположением конечных продуктов в виде крупных гранул. Основным критерием отнесения к Т-клеточному варианту ОЛЛ было определение в большинстве лимфоцитов кислой фосфатази (Щ ), кислой неспецифической эстеразы (КНЭ) в виде пятна или одно-двух крупных гранул в одном из участков цитоплазмы. В бластных клетках больных с В-ОЛЛ также выявлена активность ли-зосомальных ферментов, но отложение конечных продуктов реакции было иным - диффузным или мелкогранулярным. При нуль-ОЛЛ, пре-пре-В-ОЛЛ реакции при выявлении активности КФ, КНЭ были отрицательными.
Антигенная характеристика бласа-ьых клеток 13 больных ОЛЛ представлена в табл. 7. Как следует из приведенных данных, 20,0-28,0$ мононуклеаров периферической крови больных 3-я, Б-а эк-спрессируют la-подобный антиген. Отсутствие каких-либо других иммунологических маркеров Т- и В-лимфоцитов указывает на существование среди лейкозных клеток 1а+ клона клеток, блок дифферен-цировки которых, по-видимому, произошел на уровне ранних предшественников клеток лимфоидного ряда.
Большинство бластных. клеток больного Ш-ц реагировали только с МКАТ ИК0-І. В данном случае мы также не наблюдали положительной реакции с другими МКАТ против антигенов Т- и В-лимфоцитов. Изучение поверхностного фенотипа патологических клеток больного Ж-ц позволяет сделать вывод о пребывании этих клеток на стадии либо ранних лимфоидных предшественников, либо ранних предшественников В-лимфоцитов. Поскольку ИЛ0-10+-клетки не были обнаружены среди популяции клеток патологического клона больных 3-я, Ш-ц, Б-а, можно думать об отсутствии маркера, определяемого МКАТ ИП0-І0, на ранних предшественника:: лимфоцитов. В то же время, эти данные позволяют прийти к заключению, что ИК0-І и ИП0-І0 распознают различные антигены»
Блок дифференцировки в лейкозном клоне больного В-ко был связан со стадией созревания Т-клеток, для которых характерна экспрессия на мембране антигенов незрелых (ИК0-ІІ и ИК0-І6) и зрелых (ТІ и Т2) Т-лимфоцитов. Среди лейкозных клеток не обнаружены ранние предшественники Т-ряда, так как при постановке Щ-тес-та с МКАТ ИК0-І не были определены la-подобные антигены. В пользу Т-клеточной природы клона патологических клеток свидетельствует и тот факт, что нами не выявлены как поверхностные, так и цитоплазматические иммуноглобулины. Таким образом, патологические клетки больного В-ко с Т-клеточным вариантом ОЛЛ имели поверхностный фенотип: ИК0-І", ИПО-ІО", ИК0-П+, ИК0-І6+, 11+, Т2+, ТВ", су у/" , S1Q . Такой фенотип характерен для переходных тимоцитов - кортикально-медуллярных клеток.
Маркерный фенотип злокачественных клеток больного С-ч соответствовал поверхностной характеристике незрелых Т-лимфоцитов. 99, Ofo бластных клеток периферической крови больного давали интенсивную реакцию в виде ободка, состоящего из крупных гранул, с МКАТ ИК0-І и 76,052 - с МКАТ ИК0-ІІ. Небольшая слабоположительная реакция отмечена и с МКАТ ИПО-4. Вероятно, в .этом случае МКАТ ИПО-4, определяющие антиген бластных форм Т- и В-лим-фоцитов, реагировали с Т-бластами. Как и в предыдущем случае, мы не обнаружили Ig , что являемся еще одним из доказательств наличия Т-клеточного лимфопролиферативного процесса у больных С-ч и В-ко. В обоих случаях реакция МКАТ ИП0-І0 с клетками больных не была выявлена, что дало нам право сделать заключение об Таблица . - 89 отсутствии антигена, определяемого МКАТ ИП0-ІО, на Т-лимфоци-тах.
Патологические клетки больного В-а имели признаки Т-клеточ-ной направленности дифференцировки с характеристикой незрелых Т-лимфоцитов. Эти клетки реагировали с МКАТ ИК0-ІІ, ИК0-І6, ДАКО Т2 и не содержали la-антигены и Ig .На их поверхности не были обнаружены антигены зрелых Т-лимфоцитов. В популяции лимфоцитов периферической крови В-а присутствовала также фракция нормальных В-лимфоцитов, которые взаимодействовали с МКАТ IB4. Относительное содержание 1В4+ клеток соответствовало количеству лимфоцитов, давших положительную реакцию с МКАТ ИПО-Ю. Среди В-лимфоцитов не выявлены активированные формы В-клеток. Итак, иммунологический фенотип лейкоэных клеток больного В-а имел следующее выражение: ИКО-І", ИЛ0-І0", ИКО-ІІ4", ИК0-І6+, ТІ", Т2+, T8",cyyl/ , slg".
