Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Биологическая характеристика инулиназ и их продуцентов 11
1.2. Физико-химические свойства инулиназ 21
1.3. Кинетика ферментативного катализа и субстратная специфичность инулиназ 31
1.4. Структурно-функциональные свойства инулиназ, механизм ферментативного гидролиза полифруктанов 37
1.5. Методы иммобилизации инулиназы и их применение 46
Глава 2. Объект и методы исследования 57
2.1. Объект исследования 57
2.2. Методы исследования 62
2.2.1. Культивирование дрожжей Kluyveromyces marxianus 62
2.2.3. Осаждение белков ацетоном 62
2.2.4. Фракционирование белков сульфатом аммония 63
2.2.5. Гель-фильтрация на сефадексе G-25 63
2.2.6. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 63
2.2.7. Гель-хроматография на сефадексах G-150 и G-200 64
2.2.8. Электрофорез белков по модифицированному методу Дэвиса 65
2.2.9. Метод Лоури 66
2.2.10. Метод определения каталитической активности инулиназы 67
2.2.11. Методика подготовки к работе ионообменных смол 67
2.2.12. Подготовка к иммобилизации ионообменных волокон 68
2.2.13. Методика сорбционной иммобилизации 69
2.2.14. Цифровая методика дифференциального термического анализа (ДТА) для исследования процесса термической инактивации белков 69
2.2.15. Визуализация молекул методом атомно-силовой микроскопии 70
2.2.16. Определение доли агрегированных молекул 71
2.2.17. Определение доли инактивированных молекул 71
2.2.18. Подготовка и анализ образцов методом инфракрасной спектроскопии (ИКС) 71
2.2.19. Определение размеров молекул методом динамического светорассеивания 73
2.2.20. Статистическая обработка результатов экспериментов 73
Глава 3. Получение гомогенных препаратов иііулиназ из kluyveromyces marxianus и helianthus tuberosus и исследование их физико-химических и кинетических свойств 74
3.1. Очистка инулиназ из Khiyveromyces marxianus и Helianthus tuberosus 74
3.2. Некоторые физико-химические и кинетические свойства инулиназ 84
Глава 4. Исследование надмолекулярной организации инулиназ 90
Глава 5. Исследование закономерностей процесса термической инактивации инулиназ из kluyveromyces marxianus y-3 03 и helianthus tuberosus 101
Глава 6. Разработка гетерогенных биокатализаторов на основе инулиназ и исследование их физико-химических и кинетических свойств 111
6.1. Исследование механизма взаимодействия молекулы инулиназы с матрицей синтетических ионитов, поиск наиболее перспективного носителя для иммобилизации фермента 111
6.2. Физико-химические и кинетические свойства инулиназ, иммобилизованных па различных носителях 123
6.3. Исследование гетерогенного биокатализатора на основе иммобилизованной инулиназы в реакторах периодического и непрерывного действия 129
Заключение 135
Выводы 139
Список использованных источников 141
Приложение 167
- Структурно-функциональные свойства инулиназ, механизм ферментативного гидролиза полифруктанов
- Осаждение белков ацетоном
- Методика подготовки к работе ионообменных смол
- Некоторые физико-химические и кинетические свойства инулиназ
Введение к работе
з
Актуальность проблемы. Исследования в области получения
высокостабильных гетерогенных биокатализаторов на основе
иммобилизованных ферментов приобретают все большую актуальность. Общепризнано, что при промышленном масштабировании каталитических процессов гетерогенный режим их проведения является экономически более выгодным по сравнению с гомогенными технологиями, так как при этом значительно упрощается и удешевляется весь производственный цикл. Очевидно, что носители для гетерогенных биокатализаторов должны быть доступными, обладать хорошими эксплуатационными свойствами и высокой адсорбционной емкостью по отношению к ферментативно активному компоненту.
Изучение структурно-функциональных, физико-химических и
кинетических свойств гликозидгидролаз (инулиназ, инвертаз,
фруктозилтрансфераз, леваназ) в нативном и иммобилизованном состояниях имеет большое теоретическое и прикладное значение. Эти ферменты участвуют в углеводном метаболизме высших растений и микроорганизмов, являются важнейшими компонентами сигнальных путей, играют важную роль в контролировании процессов клеточной дифференцировки и развития. Они также могут быть использованы в циклах производства Сахаров с различной степенью полимеризации, в частности, инулина, фруктозы и инулоолигосахаридов - неотъемлемых компонентов функционального питания, снижающих риск возникновения сахарного диабета, кариеса и ожирения.
В отечественной пищевой промышленности, в том числе в производстве сахаристых веществ (крахмальные патоки, глюкозо-фруктозные и инвертные сиропы), гетерогенные биокаталитические процессы практически не реализованы. В связи с этим разработка отечественных биотехнологических производств и замена устаревших гомогенных катализаторов на передовые гетерогенные является актуальной.
Решение многих вопросов и задач, связанных с методическими приемами иммобилизации, подбором носителей, определением кинетико-термодинамических параметров катализа, является необходимым условием для создания новых технологических разработок, конструирования реакторов и проектирования более эффективных гетерогенных биокатализаторов пролонгированного действия для промышленности, медицины и аналитических целей.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение структурно-функциональных, физико-химических и кинетических свойств гомогенных и гетерогенных биокатализаторов на основе инулиназы, выяснение особенностей гидролиза молекулы инулина нативными и иммобилизованными ферментными образцами, определение типов взаимодействий между белковой глобулой и матрицами ряда синтетических ионитов.
В связи с вышесказанным перед нами были поставлены следующие задачи: 1) получение гомогенных препаратов инулиназы из Kluyveromyces marxianus и Helianthus tuberosus и исследование надмолекулярной организации
4 этих ферментов; 2) поиск наиболее перспективного носителя для иммобилизации инулиназы и исследование механизма взаимодействия молекулы фермента с матрицей синтетических ионитов; 3) изучение физико-химических и кинетических свойств инулиназ в свободном и иммобилизованном состояниях; 4) исследование закономерностей процесса термической инактивации инулиназы из Kluyveromyces marxianus и Helianthus tuberosus; 5) изучение режимов работы гетерогенного биокатализатора на основе иммобилизованной инулиназы в реакторах периодического и непрерывного действия.
Научная новизна: разработана методика получения гомогенных препаратов инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Helianthus tuberosus; определены молекулярные массы и линейные размеры инулиназ из Helianthus tuberosus; впервые для визуализации молекул инулиназ был применен метод атомно-силовой микроскопии; исследованы некоторые физико-химические и кинетические свойства гетерогенных биокатализаторов на основе инулиназы, адсорбированной на синтетических катионитах и анионитах; установлены закономерности процесса термической инактивации инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Helianthus tuberosus.
Практическая значимость. Получены гомогенные препараты инулиназы из культуры дрожжей Kluyveromyces marxianus Y-303 и инулиназ I, II и III из клубней Helianthus tuberosus. Степень очистки и выход фермента соответственно 39,8 и 13,5 %, 55,7 и 5,4 %, 28,9 и 3,1 %, 21,6 и 1,9 %. Показано, что оптимальными условиями гидролиза инулина для инулиназы из Kluyveromyces marxianus являются температура катализа 50 С и рН 4,7. Энзимы растительного происхождения характеризуются оптимумами функционирования соответственно 48 С, рН 6,8 (I), 39С, рН 6,2 (II) и 44 С, рН 4,5 (III). Изучение особенностей молекулярной организации расширило представление о механизмах регуляции функциональных свойств гликозидгидролаз in vivo.
Предложены гетерогенные биокатализаторы на основе
иммобилизованной инулиназы, определены оптимальные условия их функционирования. Установлено, что катионит КУ-2 и анионит АВ-17-2П, являющиеся отходами пищевых производств, могут применяться в качестве носителей для адсорбции энзима. Показано, что для дрожжевой инулиназы, адсорбционно иммобилизованной на ВИОН КН-1, АВ-17-2П и КУ-2, оптимум рН практически не изменяется, а температурный оптимум смещается в сторону более высоких значений с максимальной активностью при 70 С, что на 20 С выше, чем для нативного фермента. Иммобилизованные на КУ-2, КУ-2-8чС и АВ-17-2П препараты инулиназы из Helianthus tuberosus проявляют максимальную каталитическую способность в диапазоне температур 60-70 С, прирН от 5 до 7.
Выявлены закономерности процесса термической инактивации ферментов из Kluyveromyces marxianus и Helianthus tuberosus, что позволяет подобрать температурный режим для использования препаратов в производственных циклах. Разработаны технологические режимы работы
5 реактора непрерывного действия, которые можно рекомендовать для применения в промышленных масштабах.
Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены на научной конференции «Innovation Technologies» (New-York, 2007); XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ», (Москва, 2008); Международной научной конференции «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники» (2008); Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2008); Втором международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008); II Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008); Пятом съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008); Международном междисциплинарном Симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2008); конференции Десятого юбилейного международного форума «Высокие технологии XXI века» (Москва, 2009); международной научно-практической конференции «Современные направления теоретических и прикладных исследований '2009». (Одесса, 2009); X международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2009); 1-ой Международной научной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Московская область, 2009); III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009); International Conference «Nanobiophysics: Fundamental and Applied Aspects» NBP 2009 (Kharkov, 2009); в материалах VI Международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии. БФФХ - 2010» (Севастополь, 2010), а также на ежегодных научных отчетных конференциях преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2008 - 2010).
Публикации. По теме диссертационной работы имеется 23 публикации: 12 статей и 11 тезисов.
На защиту выносятся следующие положения:
Разработана методика выделения и очистки до гомогенного состояния инулиназы из культуры дрожжей Kluyveromyces marxianus Y-303 и инулиназ I, II и III из клубней Helianthus tuberosus.
Инулиназа, выделенная из Kluyveromyces marxianus, и инулиназа I из Helianthus tuberosus функционируют в форме гетеродимеров, инулиназы II и III существуют в мономерной форме.
Дрожжевая инулиназа более устойчива к температурным воздействиям по сравнению с энзимами растительного происхождения.
Адсорбционный способ иммобилизации инулиназы позволяет сохранить до 75,5 и 80,4 % активности нативного энзима у фермента дрожжевого и растительного происхождения соответственно. Ионообменные смолы АВ-17-2П и КУ-2, являющиеся отходами пищевых производств, могут применяться в качестве носителей для адсорбции инулиназы.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа включает 178 страниц машинописного текста; состоит из «Введения», 6 глав, «Заключения», «Выводов» и «Приложения». Список литературы содержит 253 источника. Иллюстрационный материал включает 36 рисунков и 21 таблицу в основном тексте и 22 рисунка в «Приложении».
Структурно-функциональные свойства инулиназ, механизм ферментативного гидролиза полифруктанов
Существует мало данных о структурных особенностях инулиназы и родственных ей ферментов из группы гликозидгидролаз (GH32). Встречаются отдельные работы, посвященные анализу первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры молекул этих энзимов. Модели пространственной организации предложены только для инвертазы Thermotoga maritima, экзоинулиназы Aspergillus awamori и фруктан 1-экзогидролазы Cichorium intybus, поэтому знания в этой области необходимо расширять и углублять [68, 69,201,228,250]. Аминокислотный состав инулиназ из различных источников также изучен в недостаточной степени. Известно, что превалируют аспарагиновая кислота, глицин, треонин, серии, глутаминовая кислота, аланин. Сумма вышеперечисленных аминокислот составляет около 75 % всех аминокислотных остатков энзима. В структуре молекулы фермента, выделенного из Aspergillus awamori, присутствует 178±17,8 остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот, 20±2 остатков гистидина, 9,5±0,95 - цистеина, 34±3,4 остатков лизина и тирозина. Молекула инулиназы содержит 38 боковых ЫН2-группировок, которые являются весьма существенными для проявления каталитической активности некоторых гликозидаз [13, 20]. Эндоинулиназа, экзоинулиназа. инвертаза, леваназа, фруктозилтрансфераза входят в группу [3-фруктофуранозидаз семейства гликозилгидролаз.
Эти ферменты объединяет наличие характерных консервативных последовательностей WMN(D/E)PN; RDP и ЕС(Р) в первичной структуре. Было показано, что каталитический механизм большинства гликозилгидролаз предполагает участие двух кислых остатков, один из которых действует как нуклеофил, а другой - как донор протона. Методами химической модификации и сайт-специфического мутагенеза было установлено, что в молекуле дрожжевой инвертазы эти функции выполняют остатки Asp 23 и Glu 204, соответственно входящие в состав последовательностей WMN(D/E)PN и ЕС(Р). Возможно, что остатки Asp 20 или Glu 20 также участвуют в катализе. Установлено, что эндоинулиназа из Arthrobacter, экзоинулиназа из Aspergillus awamori, фруктозилтрансфераза из Aspergillus foetidus, леваназа из Gluconacetobacter diazotrophicus, инулиназа из Aspergillus ficuum, инвертаза из Thermotoga maritima и инулиназа из Aspergillus niger AF10 имеют консервативные последовательности WMNXPNGL и RDPKVF. По-видимому, участок WMNXPNGL действует как нуклеофил, a RDPKVF также выполняет важную роль в акте катализа [26, 49, 68, 108]. Экзоинулиназа Aspergillus niger (AnglnuE) полностью идентична фруктозилтрансферазе 1-SST из Aspergillus foetidus, которая, что удивительно, не проявляет гидролитической активности по отношению к инулину и левану. Более того, AnglnuE отличается на 3 аминокислоты от экзоинулиназы (InuE) из Aspergillus niger 12, способной гидролизовать инулин, но не активной по отношению к левану. AnglnuE является также высокогомологичным белком с 91 % идентичности к инулин- и леван-гидролизующей экзоинулиназе (Inul) из Aspergillus awamori [137, 201]. Экзоинулиназа из Bacillus polymyxa MGL21 гомологична на 57, 39 и 41 % соответственно экзоинулиназам из Pseudomonas mucidolens и Aspergillus niger и леваназе из Bacillus subtilis. Шесть высоко консервативных участков, характерные для ферментов, расщепляющих инулин, леван и сахарозу, были обнаружены у инулиназы из Bacillus polymyxa.
Инулиназа из Bacillus polymyxa имеет консерватиный остаток цистеина, аналогичный таковому в активном центре сахаразы из Zymomonas mobilis, инвертазы из Saccharomyces cerevisiae и инулиназы из Klayveromyces marxianus [57, 61]. Эндоинулиназа из Arthrobacter species S37 оказалась длиннее других инулиназ на 135-297 аминокислотных остатков. Секвенирование фермента показало, что он на 15,3; 15,3; 15,6; 13,8; 16 и 13,3 % идентичен эндоинулиназам из Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, и Penicillinm purpurogenum, экзоинулиназе из Kluyveromyces maxianus, леваназе из Bacillus subtilis, инвертазе из Saccharomyces cerevisiae [60, 61, 120, 141]. Аминокислотные последовательности экзоинулиназ из Aspergillus niger и Aspergillus awamori идентичны на 91 %. Экзоинулиназа из Aspergillus niger показала высокую степень гомологии со следующими (3-фруктофуранозидазами: бактериальными леваназами из Bacillus subtilis (42 %), Actinomyces naeslundii (41 %) и Bacillus polymyxa (39 %); дрожжевыми инвертазами из Saccharomyces cerevisiae (39 %) и Pichia anomala (40 %); дрожжевой экзоинулиназой из Kluyveromyces marxianus (38 %); грибными эндоинулиназами из Penicillium species strain TN-88 (37 %), Penicillium purpurogenum (36 %) и Aspergillus niger (35 %) [61, 137, 139, 140-143, 152, 201, 226, 232]. Сравнение структур 1-экзогидролазы На (1-FEH Па) из dehorium intybus (GH32), инвертазы из Thermotoga maritima (GH32), экзоинулиназы из Aspergillus awamori (GH32) и леванцукразы Bacillus subtilis (GH68) показало, что каталитически важные группы располагаются у них в пределах Р-пропеллерового домена. Т. Pons et al. (1998) предложили структурную модель для семейства 32 гликозидгидролаз, основанную на Р-пропеллеровых складчатостях. Были выявлены три консервативных аминокислотных остатка, входящих в состав активного центра: Asp, Glu и Cys [68, 69, 135, 220, 228, 251]. R.A. Nagem et al. (2004) на основе данных рентгено-структурного анализа построили пространственную модель инулиназы, выделенной из Aspergillus awamori. Авторы показали, что фермент состоит из 2 доменов. N-Концевой домен, включающий каталитический центр, содержит 353 аминокислотных остатка (от Phe 20 до Gin 372). Он принадлежит к семейству Р-пропеллеровых структур с пятью Р-листами, располагающимися как лопасти пропеллера, радиально вокруг центральной оси. Каждая лопасть включает четыре антипараллельных Р-тяжа. Все тяжи объединены поворотом шпильки, причем четвертый тяж одной лопасти связан с первым тяжом последующей. Пятилопастная Р-пропеллеровая складчатость встречается редко, в частности
Осаждение белков ацетоном
Глубинное культивирование дрожжей Kluyveromyces marxianus -1 т проводили в колбах емкостью 500 см , содержащих по 50 см питательной среды, в течение 72 часов на лабораторной роторной качалке. Для выращивания дрожжей Kluyveromyces marxianus использовали питательную среду следующего состава (%): пептон - 1,0, дрожжевой экстракт - 0,5, фруктоза - 2; рН среды от 5,5 до 8,0. Среду стерилизовали в течение 40 минут при 0,8 МПа, охлаждали до 30 С и засевали водной суспензией дрожжей. Биомассу продуцента отделяли от питательной среды путем центрифугирования при 250 g в течение 10 минут. Клеточную массу промывали водой для удаления остатков питательной среды и снова центрифугировали в течение 10 минут при 250 g. Готовую биомассу продуцента сушили при 25-27 С. Инулиназу из экстракта топинамбура мы осаждали ацетоном в соотношении 1 объем растительного экстракта к 4 объемам органического растворителя. Экстракт и ацетон мы предварительно охлаждали до 0 С, внесение растворителя проводили при постоянном перемешивании. Далее осуществляли центрифугирование при 250 g в течение 15 минут. Полученный осадок растворяли в минимальном объеме буфера для снижения в препарате концентрации ацетона. Кристаллический сульфат аммония добавляли к белковому препарату в количестве, соответствующем нижней границе насыщения (35 %). Смесь центрифугировали при 250 g в течение 15 минут. Затем к надосадочной жидкости добавляли (NH SCU в количестве, соответствующем верхнему пределу насыщения (60 %).
После центрифугирования получали осадок, содержащий инулиназу, который затем растворяли в минимальном количестве буфера. При расчете количеств (NH4)2S04, вносимых в раствор до достижения необходимого процентного насыщения, пользовались специальными таблицами. Сефадекс G-25 применяли для освобождения ферментных препаратов от низкомолекулярных примесей. Перед использованием сефадекс оставляли в дистиллированной воде для набухания на 3-4 часа. Суспензию геля заливали в установленную строго вертикально колонку размером 1,5x11 см. Ферментные образцы наносили в количестве 3 мл. Скорость элюции составляла 12 мл/ч. Каждую фракцию объемом 2 мл анализировали на присутствие ферментативной активности. Фракции, обладающие максимальной ферментативной активностью, объединяли и использовали для дальнейшей очистки. хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. ДЭАЭ-целлюлоза, благодаря своей функциональной группе [-0-CH2-CH2-N=(C2H5)2] - диэтиламиноэтильному остатку - обладает свойствами слабого анионообменника. Перед использованием ДЭАЭ-целлюлозу подвергали специальной обработке: на каждый грамм сухого вещества добавляли 30 мл дистиллированной воды и оставляли набухать в течение 3-4 часов. Затем выдерживали в течение часа в 0,5 н NaOH, потом в 0,5 н НС1 и снова в 0,5 н NaOH. После каждой стадии обработки ионообменник отмывали дистиллированной водой до нейтрального значения среды в промывных водах. После предварительной обработки ДЭАЭ-целлюлозу помещали в колонку 2x22 см и уравновешивали элюирующим буфером. Для формирования столбика ДЭАЭ - целлюлозы всю конструкцию устанавливали строго вертикально, закрывали нижний кран, помещали на дно колонки тонкий слой стекловаты, поверх нее - фильтровальную бумагу, затем наполняли растворителем и при перемешивании постепенно вносили в колонку ионообменник.
Поверх слоя целлюлозы помещали кружок фильтровальной бумаги, диаметр которого соответствовал диаметру колонки. Для нанесения образца избыток элюата из колонки удаляли почти полностью и в один прием осторожно вносили пипеткой 2 мл раствора фермента. После того, как раствор впитывался, поверхность дважды промывали равным объемом элюата. На колонку наносили ферментный препарат, предварительно освобожденный от низкомолекулярных примесей при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-25. После сорбции белка на колонке проводили десорбцию фермента в градиенте рН элюирующего буфера 8,0-4,0. Скорость элюции — 12 мл/ч. Фракции, относящиеся к пику активности, объединяли и использовали для дальнейшей очистки. Предварительную подготовку колонки сефадексом G-150 (или G-200) осуществляли следующим образом: методом декантации удаляли мелкие частицы, затем суспензию геля в рабочем буфере заливали в колонку 0,7x35 см. Слой суспензии перемешивали, а стенки колонки слегка простукивали, что способствует удалению попавших в колонку пузырьков воздуха и равномерному ее заполнению. После заполнения колонки пропускали через нее несколько объемов элюирующего раствора до тех пор, пока слой геля не переставал уплотняться.
Необходимо следить, чтобы колонка не высыхала, для этого над наполнителем всегда должен находиться слой растворителя [22]. На подготовленную к работе колонку наносили ферментный препарат объемом 1 мл. Элюцию проводили со скоростью 12 мл/ч, каждую фракцию анализировали на присутствие ферментативной активности. При определении кажущейся молекулярной массы ипулиназы пользовались калибровочной прямой. Для её построения через колонку с сефадексом G 150 (fine) пропускали следующие белки — метчики: каталаза (230 кДа), бычий сывороточный альбумин (БСА) (68 кДа), сывороточный альбумин человека (САЧ) (67 кДа), интерферон (22 кДа), цитохром с (13 кДа). Калибровочную прямую строили в координатах: по оси ординат - десятичный логарифм молекулярной массы белка - метчика, по оси абсцисс - элюционный объем (мл). Гомогенность полученных фракций фермента определяли путем электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по модифицированному методу Дэвиса. Содержание акриламида в мелкопористом геле составляло 7,5 %, в крупнопористом геле - 4 %. На пластину наносили образец объемом не более 200 мкл, сверху наслаивали электродный буфер (трис-глицериновый, рН 8,3). В качестве маркера электрофоретического фронта использовали бромфеноловый синий. Разделение проводили в камере для вертикального электрофореза белков и нуклеиновых кислот VE-2M («Хеликон», Россия). Электроды присоединяли к источнику тока «Эльф-8» («ДНК-Технология», Россия). Образцы перед нанесением на концентрирующий гель смешивали с
Методика подготовки к работе ионообменных смол
Метод основан на определении редуцирующих веществ, освобождающихся в процессе гидролиза субстрата под действием фермента, при помощи реакции Селиванова на фруктозу [12, 20]. При нагревании раствора, содержащего фруктозу, с соляной кислотой или другими сильными кислотами фруктоза превращается в оксиметилфурфурол, который, реагируя с двумя молекулами резорцина, образует комплексное соединение вишнево-красного цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию оксиметилфурфурола (и, следовательно, фруктозы) в растворе. Содержание фруктозы в гидролизате вычисляют на основе измерения интенсивности оптической плотности при помощи КФК-3 (X = 540 нм). Активность инулиназы рассчитывали по формуле где А — активность, ед/мг; а — количество фруктозы, мкг; Ъ — количество фермента в реакционной смеси, мг/мл гидролизата; t - время гидролиза, мин; 180 - молекулярная масса фруктозы. За единицу инулиназной активности принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоль фруктозы за 1мин. Исследуемые образцы ионитов помещали в насыщенный раствор NaCl на 3-4 часа для предотвращения растрескивания гранул, затем сорбент переносили в колонку и промывали дистиллированной водой.
Для удаления минеральных примесей ионит сначала обрабатывали растворами НС1 в количестве 5 объемов на 1 объем смолы в нарастающей концентрации (0,5; 1; 2; 3 моль/л) до отсутствия ионов железа, затем обработку соляной кислотой повторяли при соответствующем уменьшении концентрации кислоты и отмывали смолу дистиллированной водой до нейтральной реакции. Следующая стадия подготовки ионитов-носителей — обработка растворами гидроксида натрия в нарастающей концентрации в диапазоне 0,1-0,25 моль/л, затем смолы отмывали дистиллированной водой. Для более полного удаления примесей кислотно-щелочную обработку проводили троекратно. После очистки ионообменник переводили в требуемую ионную форму. Для перевода катионообменника в Н-форму использовали раствор НС1, для перевода анионообменника в ОН-форму — раствор щелочи, для получения соответствующих солевых форм (Na-форма, С1-форма) применяли растворы хлоридов или других растворимых солей [4, 9, 28]. Подготовленный таким образом носитель высушивали при комнатной температуре и хранили в посуде с плотно притертой крышкой. В связи с тем, что ионообменные волокна отличаются от зернистых ионитов, методика подготовки существенно отличается от описанной выше. При кондиционировании ионообменные волокна помещали в дистиллированную воду. После набухания обрабатывали растворами НС1 переменной концентрации (0,5; 1,0; 1,5; 1,0; 0,5 моль/л) для удаления ионов железа. Обработку проводили в статических условиях. После отмывки дистиллированной водой осуществляли попеременную четырехкратную обработку 1 моль/л растворами NaOH и НС1 с промежуточной промывкой дистиллированной водой. г носителя оставляли на 12 часов при комнатной температуре в 50 мл ацетатного буфера (рН 4,5). К суспензии носителя добавляли 5 мл фермента (10"5 моль/л) и перемешивали в колбе с помощью электрической мешалки в течение 1,5 часов при 25 С. Центрифугировали 5 мин при 500 g. Осадок промывали ацетатным буфером (рН 4,5) до отсутствия в промывных водах белка. Контроль осуществляли на спектрофотометре СФ-46 при \= 280 нм.
Содержание белка в иммобилизованном ферментном препарате определяли модифицированным методом Лоури, а активность — спектрофотометрическим методом. Метод ДТА основан на сравнении термических свойств образца исследуемого вещества и термически инертного вещества, принятого в качестве эталона. Регистрируемым параметром служит разность их температур, измеряемая при нагревании или охлаждении образца с постоянной скоростью, которая может быть представлена в виде функции температуры образца, эталона или нагревателя. Минимумы на термограмме обусловлены охлаждением образца (по сравнению контрольным образцом) за счет протекания эндотермической реакции, максимумы соответствуют протеканию экзотермической реакции [27]. Цифровая методика, сохраняя достоинства классического метода ДТА, позволяет интенсифицировать процесс исследования, повысить точность, воспроизводимость и объективность полученных результатов. В эксперименте использовались две стандартные химические пробирки, в одну из которых помещался образец исследуемого вещества, в качестве эталона выступал воздух. Пробирки закреплялись внутри печи с помощью держателя,
Некоторые физико-химические и кинетические свойства инулиназ
Исследование зависимости каталитической активности инулиназ из Kluyveromyces marxianus Y-303 и Helianthis tuberosus от температуры протекания реакции гидролиза инулина мы проводили в диапазоне от 20 до 80 С (рис. 17А). За 100 % принята ферментативная активность инулиназы, наблюдаемая при оптимальных условиях гидролиза инулина (50 С, рН 4,7, концентрация субстрата в реакционной смеси 5x10"4 моль/л). Обнаружено, что фермент дрожжевого происхождения имеет оптимум функционирования в интервале температур 45-55 С, с максимумом активности при 50 С. Энзим является термостабильным, так как даже при 70 С сохраняется 20 % его каталитической способности. По литературным данным, оптимальная температура каталитической реакции для инулиназы из Kluyveromyces marxianus var bulgarcus соответствует 55 С или 60 С, а из Kluyveromyces species Y-85 - 52 С. Показано, что дрожжи Kluyveromyces marxianus проявляли максимальную инвертазную активность при 50 С и величине рН 4,0, а инулиназную - при 55 С и рЫ 5,0. По другим источникам, максимальный гидролиз инулина инулиназой из Kluyveromyces marxianus происходил при 45 С и 50 С. В результате наших исследований получено, что при 35 С ферментный препарат обладал 26,7 % максимальной Анализ данных литературы показывает, что инулиназы из различных микроорганизмов отличаются по рН-оптимуму. По данным различных авторов рН-оптимум для инулиназ из Kluyveromyces marxianus находится в диапазоне рН 3,5-5,5. Для ферментов из Kluyveromyces marxianus АТСС 52466, CDBBL-278, NRRL Y-7471 данный параметр соответствует рН 5,0. R. Xiao et al. (1989) и R.T. Kushi et al. (2000) показали, что оптимум рН для дрожжевой инулиназы составляет 4,4; E.J. Vandamme и D.G. Derycke (1983) - 4,7-5,2, а R.J. Rouwenhorst et al. (1988)-4,5-5,0 [129, 166,239,251]. Результаты наших экспериментов по изучению влияния различных концентраций ионов водорода на каталитическую активность инулиназы, выделенной из Kluyveromyces marxianus, представлены на рис. 17Б. Установлено, что кривая зависимости величины удельной активности от значений рН субстрата для данного энзима в свободном состоянии имеет максимум при рН 4,7. Для большинства ферментов графики зависимости скорости реакции от значений рН среды имеют форму, соответствующую однократной или двукратной ионизации.
Связано это с тем, что единственной важной ионизирующей группой является группа активного центра, непосредственно участвующая в катализе, либо группа, расположенная вне активного центра, но ответственная за сохранение активной конформации белка. Для многих энзимов график зависимости активности от рН среды имеет колоколообразную форму: «кислая» и «щелочная» ветви ее симметричны [23]. Инулиназа Kluyveromyces marxianus является исключением из этого положения. Подобное явление свидетельствует о том, что действие Н+-ионов отражает суммарный процесс: 1) на протолиз функциональных групп активного центра; 2) на структуру каталитического центра инулиназы. Снижение величины каталитической активности инулиназы по обе стороны рН-оптимума может быть обусловлено уменьшением насыщения фермента субстратом вследствие понижения сродства молекул инулина к функциональным группам субстратсвязывающего центра катализатора, а также дестабилизацией энзима под воздействием концентраций ионов водорода, отличающихся от оптимального значения, сопровождающейся необратимой инактивацией белка. Таким образом, оптимальными условиями для функционирования свободного ферментного препарата являются температура 50 С и рН 4,7. В следующей серии экспериментов нами была изучена зависимость удельной активности инулиназы от концентрации раствора инулина (рис. 17В). Значения константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции, найденные графическими методами Лайнуивера-Берка, Хейнса и Иди-Хофсти [18] составили для инулиназы Kluyveromyces marxianus 0,22 мМ и 102 мкмоль/(мгхмин) соответственно. Форма графиков зависимости каталитической активности инулиназы от концентрации субстрата характеризуется наличием двух стационарных режимов, что связано, по-видимому, с субъединичной структурой молекулы фермента. Аналогичные серии экспериментов были проведены для инулиназ I, II и III из Helianthis tuberosus. Обнаружено, что инулиназа I имеет оптимум активности при 48 С, инулиназа II - ри 39 С, а инулиназа III - при 44 С (рис. 18 А). Так как инулин обладает хорошей растворимостью только при высоких температурах (около 50 С), для промышленного получения фруктозы из инулинсодержащего растительного сырья целесообразно использовать только
Похожие диссертации на Исследование структурно-функциональных свойств гомогенных и гетерогенных биокатализаторов на основе инулиназы
