Введение к работе
Актуальность темы
Использование плазмонно-резонансных частиц (ПРЧ), в частности золотых наночастиц (ЗНЧ), в диагностике и терапии онкологических заболеваний является альтернативой традиционным методам обнаружения и лечения опухолей [Л1, Л2]. В последнее время разработаны новые методы детектирования онкозаболеваний с помощью ЗНЧ. Новым направлением биомедицины является конструирование композитных наночастиц, состоящих из материалов с различными физическими и химическими свойствами, для проведения исследований в области одновременной диагностики и терапии опухолевых заболеваний (тераностики) [Л1]. Благодаря высокой эффективности светорассеяния и сильно развитой поверхности, золотые нанозвезды (ЗНЗв) могут использоваться в качестве оптических зондов, для доставки целевых веществ к биомишеням или в качестве плазмонного ядра в составе многофункциональных нанокомпозитов. Одним из перспективных направлений в терапии онкозаболеваний с использованием ЗНЧ является адресная (направленная) доставка лекарственных веществ непосредственно в опухолевую ткань или перерожденную клетку. Несмотря на большое количество проведенных исследований, некоторые аспекты направленной доставки продолжают оставаться актуальными. В частности, механизмы взаимодействия лекарственного вещества с поверхностью наночастиц и собственной токсичности носителей не являются универсальными и требуют специального изучения для каждой конкретной системы. Зачастую, используемые комплексы, включающие в себя наночастицы и лекарственные препараты, имеют сложный состав и их синтез трудновоспроизводим.
Для успешной диагностики и терапии опухолей необходимо определение локализации ЗНЧ в тканях и клетках. Среди способов одновременной визуализации ЗНЧ и клеточных структур следует выделить конфокальную микроскопию и оптическую когерентную томографию (ОКТ), которые позволяют определить локализацию ЗНЧ на клеточном уровне и на уровне тканей. В конфокальной микроскопии визуализация ЗНЧ возможна в режиме мультифотонной флуоресценции, в то время как конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) требует использования флуоресцентных зондов. Однако большинство стандартных методов флуориметрических исследований не предполагают использования ЗНЧ в силу принципиальных особенностей системы освещения и регистрации сигнала. Кроме того, экспериментальные данные по оптическим спектрам поглощения и рассеяния нанокомпозитов на основе золотых нанозвезд отсутствовали в литературе. К тому же, не были исследованы возможности доставки распространенного противоопухолевого лекарственного средства проспидина в нормальные и опухолевые клетки с использованием золотых наночастиц. Этим определяется актуальность и научная значимость темы диссертации.
Целью диссертационной работы было сравнительное экспериментальное исследование золотых наносфер, нанонанозвезд и композитов (нанозвезды с оболочкой из двуокиси кремния) в качестве оптических зондов для цитологических исследований и носителей противоопухолевого препарата проспидина при взаимодействии с нормальными и опухолевыми клетками.
Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи исследования:
-
Синтезировать золотые наносферы и нанозвезды с повышенной эффективностью светорассеяния. Разработать микроскопические методики одновременной регистрации рассеянного и флуоресцентного излучения для исследования проникновения полученных частиц в живые клетки в присутствии различных красителей и для оценки цитотоксичности исследованных наносистем.
-
Получить конъюгаты золотых наночастиц с противоопухолевым препаратом проспидином и изучить влияние конъюгатов на клетки нормальных и опухолевых линий.
-
Получить и охарактеризовать эффективности поглощения и рассеяния нанокомпозитных частиц, состоящих из золотых нанозвезд, покрытых оболочкой из двуокиси кремния.
-
Экспериментально оценить варианты использования композитных нанозвезд в цитологических исследованиях и в оптической когерентной томографии на моделях фантомов тканей.
Научная новизна полученных результатов заключается в следующем:
-
Обнаружено усиление светимости золотых наночастиц и их агрегатов в результате взаимодействия с катионным флуоресцентным красителем акридиновым оранжевым. На этой основе предложен оригинальный метод использования смешанных меток (наночастицы+флуорсцентные красители) в режимах темнопольной и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
-
С использованием комбинирования дифференциально-интерференционного контраста и темного поля впервые показана внутренняя или наружная локализация ЗНЧ в клетках, подтвержденная конфокальной лазерной сканирующей микроскопией в режиме регистрации светорассеяния.
-
Впервые показано синергетическое действие противоракового препарата проспидина в комплексе с ЗНЧ на опухолевые клетки в культуре.
-
Экспериментально получены плазмонные нанопорошки золотых нанозвезд в смеси с проспидином в качестве препарата длительного хранения и использования.
-
Золотые нанозвезды, покрытые оболочкой из двуокиси кремния, впервые использованы в оптической когерентной томографии на моделях фантомов тканей.
Научно-практическая значимость работы. Разработанные методы использования смешанных меток и системы освещения стандартных микроскопов не требуют уникального оборудования и могут использоваться во многих лабораториях для наблюдения проникновения ПРЧ в живые клетки и влияния этого процесса на жизнеспособность клеточных культур. В частности, эти методы уже нашли применение в таких учреждениях, как ИБФРМ РАН (г. Саратов, Россия), СГУ (г. Саратов, Россия), Университет Оулу и Биоцентр Оулу (г. Оулу, Финляндия). Полученный комплекс проспидин+ЗНЧ является перспективным потенциальным противоопухолевым препаратом. Золотые нанозвезды, покрытые оболочкой из диоксида кремния, используются в Университете Оулу для контрастирования фантомов тканей в ОКТ.
Достоверность научных результатов подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных и их соответствием теоретическим расчетам, а также качественным и количественным согласием с результатами независимых исследований других авторов.
На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:
1. Катионные флуоресцентные красители, сорбируясь на частицах золота и/или вызывая их агрегацию, увеличивают светимость золотых частиц (агрегатов), позволяют исследовать локализацию золота и жизнеспособность клеток методами КЛСМ и световой микроскопии в режиме темного поля и в комбинированных режимах.
2. Комплекс золотых наночастиц с проспидином при малых концентрациях проспидина (8 мМ) эффективно подавляет жизнеспособность опухолевых клеток в сравнении с чистым проспидином и не оказывает токсического действия на нормальные животные клетки.
3. Усиление сигнала флуоресценции от препарата клеток, инкубированных с золотыми наночастицами, зависит от поверхностных свойств наночастиц. В отличие от ЦТАБ-покрытых золотых нанозвезд, золотые нанозвезды, покрытые ХЕПЕС, не увеличивают интенсивность светорассеяния от клеточных структур и флуоресценции красителей. Механизм увеличения сигнала флуоресценции можно объяснить изменением проницаемости цитоплазматических мембран.
4. Золотые нанозвезды, покрытые оболочкой из диоксида кремния, обладают настраиваемым плазмонным резонансом в диапазоне длин волн 750-900 нм. Подобные нанокомпозиты нетоксичны в концентрациях золота до 28 мкг/мл и являются перспективными контрастирующими агентами для оптической когерентной томографии.
Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями. Экспериментальные результаты получены лично автором в сотрудничестве с д.б.н. В.А. Богатыревым, д.б.н. Л.А. Дыкманом, д.б.н. С.А. Староверовым, д.б.н. О.И. Соколовым, к.б.н. М.К. Соколовой, к.б.н. Т.Е. Пылаевым, аспирантом А.Ю. Прилепским. Общее планирование экспериментов, их обсуждение и подготовка результатов к публикации проводились совместно с д.ф.-м.н. проф. Н.Г. Хлебцовым и д.б.н. В.А. Богатыревым. Эксперименты по синтезу нанокомпозитов и исследование их токсичности и оптических свойств выполнены совместно с к.ф.-м.н. А.П. Поповым, к.ф.-м.н. А.В. Быковым, к.б.н. И.Н. Сковородкиным, д.техн.н. М. Киннюнен, проф. С. Вайнио и проф. К. Кордаш в университете Оулу (Финляндия) и на базе Биоцентра Оулу (Финляндия). Работа выполнена на базовой кафедре биофизики факультета нелинейных процессов Саратовского госуниверситета и в лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках госбюджетных тем: «Нанобиотехнология частиц с настраиваемым плазмонным резонансом: синтез, функционализация, оптические свойства, применения в биологии и медицине», № гос. регистрации 01200904392 и «Многофункциональные наноматериалы на основе металлических и композитных наночастиц: синтез, характеристика и биомедицинские применения», № гос. регистрации 01201359050 (рук. д.ф.-м.н. профессор Хлебцов Н.Г). На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей.
Государственные контракты и гранты. Работа поддержана программой УМНИК, проект № 16910 «Разработка метода использования золотых наночастиц в качестве носителей противоопухолевых препаратов и средств диагностики» государственный контракт № 10497р/16910 от 08.06.2012 г. (рук. асп. Бибикова О.А.). Стипендией CIMO Fellowships (Финляндия) «Nanocomposites containing drug-loaded hollow mesoporous silica and gold nanoparticles: multifunctional capability of fluorescence diagnostic, photothermolysis and drug delivery» проект № 24301281, TM-12-8278 от 23.04.2012 (рук. асп. Бибикова О.А.).
Диссертационные исследования были также частично поддержаны грантами РФФИ (08-02-0399а, 09-02-00496а, 11-02-00128а); программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине»; Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования (научн. рук. член.-корр. РАН Никитов С.А., научн. рук. направления от ИБФРМ РАН д.ф.-м.н. профессор Хлебцов Н.Г.); госконтрактом № 02.513.11.3043 в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (рук. д.х.н. Горин Д.А.); контрактом № 24.439.11.0/ИБФРМ в рамках ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.)» (рук. д.б.н. Дыкман Л.А.).
Апробация результатов
Основные результаты диссертации представлялись автором на следующих научных конференциях:
-
Saratov Fall Meeting – International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics, Saratov, Russia, 2009, 2010, 2012 (два стендовых доклада и один устный доклад).
-
Открытый урок по нанотехнологиям в биологии в гимназии № 87, Саратов, Россия, 2010 (устный доклад).
-
Всероссийский Форум «Селигер 2010», Тверская область, Россия, 2010 (заочное участие).
-
Конкурс молодежных инновационных проектов на получение национальной премии в области инноваций – Зворыкинская премия, Саратов, Россия, 2010 (устный доклад).
-
Вторая и третья Международная конференции «Наноонкология», Тюмень, Саратов, Россия, 2010, 2011 (заочное участие).
-
Вторая и третья Всероссийские конференции для молодых ученых «Проблемы медицины третьего тысячелетия», Санкт-Петербург, Россия, 2010, 2012 (заочное участие).
-
Workshop of Local Cluster Saratov (Рабочее совещание в рамках Европейского проекта Photonics4Life FP-7, Саратов, Россия, 2011(стендовый доклад).
-
Четвертый Всероссийский конгресс «Симбиоз-Россия», Воронеж, Россия, 2011, (устный доклад).
-
II Международная конференция «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий», Казань, Россия, 2011 (устный доклад).
-
XXV зимняя школа для молодых ученых «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, Россия, 2012 (стендовый доклад).
-
Международная летняя школа «NANOTECHNOLOGY: from fundamental research to innovations», при поддержке «FP7 Nanotwinning Project of European Commission», Буковель, Украина, 2012 (устный доклад).
-
Международная конференция «Development, Regeneration and Aging», Оулу, Финляндия, 2012 (стендовый доклад).
-
Oulu BioImaging (OBI) Network Workshop, Оулу, Финляндия, 2013 (стендовый доклад).
-
Международная конференция Optics Days, Хельсинки, Финляндия, 2013 (стендовый доклад).
-
Международная конференция European Conference on Biomedical Optics, Мюнхен, Германия, 2013 (устный доклад).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 22 работы, в том числе 4 статьи в журналах из списка, рекомнндованного ВАК.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей 5 глав, заключения и списка использованных литературных источников (216 наименований). Работа изложена на 174 страницах, иллюстрирована 42 рисунками и 4 таблицами.
