Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Структура кардиомиоцита и его электрическая и механическая функция 11
1.2 Рианодиновый рецептор – основной элемент управления динамикой ионов кальция в клетке 14
1.3 Эксперименты по изучению изолированных RyR-каналов 16
1.4 Локальные высвобождения Са2+ в кардиомиоцитах 22
1.5 Модели функционирования RyR-каналов 23
1.5.1 Марковские модели динамики RyR-канала 23
1.5.2. Стохастическая динамика и электронно-конформационные взаимодействия в
белках 26
1.5.2. Описание динамики RyR-канала в рамках электронно-конформационной модели30
1.6 Модели «общего пула» 31
1.7. Теория локального контроля 33
1.8 Моделирование активности клеток водителя сердечного ритма 35
1.8.1 Современные представления об авторитмической активности клеток водителя сердечного ритма 37
1.8.2 Концепция внутренних Са2+-«часов» 38
1.8.3 Модель Мальцева-Лакатты 38
ГЛАВА 2. Электронно-конформационная модель RyR-канала и Са2+-высвобождающей единицы 42
2.1 Электронно-конформационная модель RyR-канала 42
2.1.1 Гамильтониан канала 46
2.1.2. Конформационный потенциал 47
2.1.3 Влияние уровня trans[Ca] на форму конформационного потенциала RyR-канала 48
2.1.4. Структурные изменения канала в электронно-конформационной модели 50
2.1.5 Динамика конформационной координаты 52
2.1.6 Динамика электронной степени свободы 52
2.1.7 Инактивационое состояние RyR-канала 53
2.1.8. Зависимость вероятности электронных переходов от концентрации Са2+ в cis-
части 55
2.1.9 Эффекты туннелирования 59
2.1.10 Проницаемость RyR-канала 62
2.2 Математическая модель Са2+ высвобождающей единицы 63
2.2.1 Электронно-конформационная модель решетки RyR-каналов 64
2.2.2 Схема динамики RyR-каналов в решетке высвобождающей единицы 65
2.2.3 Сопряжение динамики RyR-каналов с динамикой кальция в отделах высвобождающей единицы 67
2.2.4 Модель Са2+-высвобождающей единицы 68
2.3 Методы численной реализации модели 70
2.3.1 Метод Эйлера-Марайамы 71
2.3.2 Реализация электронных и туннельных переходов. Метод Монте-Карло 72
2.3.3 Численная схема для ЭК-модели RyR-канала 75
2.4 Описание программного комплекса 77
2.5 Заключение к главе 2 80
ГЛАВА 3. STRONG Результаты численного моделирования. Активность одиночного RyR-канала при
стационарных условиях STRONG 82
3.1 Анализ временных зависимостей конформационной координаты Q 83
3.2 Медленная конформационная динамика RyR-канала 86
3.2.1 Параметр эффективного трения Г. Конформационная динамика RyR-канала 86
3.2.2 Влияние коэффициента упругости канала K на форму конформационного потенциала 88
3.2.3 Зависимость конформационного потенциала от параметра электронно-конформационного взаимодействия а 90
3.3 Стохастическая динамика RyR-канала. Быстрые переходы 92
3.3.1 Кинетические характеристики динамики RyR-канала 95
3.3.2 Зависимость вероятности электронных переходов от cis[Ca] 99
3.4 Активация одиночного канала 101
3.5 Исследование процесса закрытия RyR-канала 104
3.6 Процесс адаптации RyR-каналов к продолжительной стимуляции 107
3.7 Динамика одиночного RyR-канала при установившемся уровне cis[Ca] 112
3.7.1 Зависимость активности RyR-канала от времени 112
3.7.2 Зависимость активности RyR-канала от уровня cis[Ca] 114
3.7.3 Влияние ионов Mg2+ на динамику одиночного RyR-канала 118
3.8 Заключение к главе 3 122
ГЛАВА 4. Моделирование динамики ионов Са2+ между отделами кардиомиоцита 124
4.1 Анализ модели высвобождающей единицы 124
4.1.1 Процессы открытия и закрытия каналов в высвобождающих единицах. 124
4.1.2 Анализ кооперативной динамики RyR-каналов в кластере 126
4.1.3 Эффект задержки туннелирования в процессе динамики Са2+ 129
4.1.4 Анализ модели динамики ионов Са2+ между компартментами клетки 132
4.2 Результаты моделирования Са2+ высвобождающей единицы 137
4.2.1 Высвобождающая единица как самоподдерживающийся кальциевый осциллятор 137
4.2.2 Моды динамики Са2+-«часов» 140
4.2.3 Влияние взаимодействия между RyR-каналами на стабильность осцилляций
системы 144
4.2.3 Эффект случайной остановки автоколебаний 147
4.3 Заключение к главе 4 155
Заключение 157
Список литературы 161
- Рианодиновый рецептор – основной элемент управления динамикой ионов кальция в клетке
- Влияние уровня trans[Ca] на форму конформационного потенциала RyR-канала
- Медленная конформационная динамика RyR-канала
- Эффект задержки туннелирования в процессе динамики Са2+
Введение к работе
Актуальность исследования. Современные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что одной из основных причин возникновения хронических заболеваний сердца (аритмия, сердечная недостаточность и пр.) является нарушение внутриклеточной динамики ионов кальция (Bers, 2001). По современным представлениям именно динамика ионов Са2+ является центральным звеном электро-механического сопряжения в рабочих кардиомиоцитах и формирования сердечного ритма в клетках синусно-предсердного узла. Известно, что активность сердечных клеток инициируется повышением концентрации внутриклеточного Са + на порядок величины за счет периодического высвобождения из внутриклеточных накопителей (саркоплазматического ретикулума, СР) через специфические ион-активируемые кальциевые каналы, сопряженные с рианодиновыми рецепторами (RyR-каналы). Связывание ионов Са2+ с активными центрами рецептора изменяет конформационное (структурное) состояние канала, переводя его в проводящее состояние, в результате этого возникают трансмембранные ионные токи по градиенту концентрации. Эти гигантские биологические нанообъекты являются одним из основных регуляторов динамики ионов кальция в сердечных клетках. Свое название рианодиновый рецептор получил благодаря способности связываться с алкалоидом рианодином, ингибирующим активность канала.
Выяснение и исследование механизмов функционирования RyR-каналов, определяющих динамику ионов Са2+, является одной из первоочередных задач современной биофизики. Ее успешное решение связывается не только с развитием современных экспериментальных методов исследования наноскопических биосистем, но и, прежде всего, с перспективами математического моделирования. Решение сложнейшей задачи математического моделирования RyR-канала предполагает выбор биофизически обоснованной модели канала, способной описать совокупность ключевых процессов в наноскопической молекулярной системе.
До сих пор традиционным подходом к описанию динамики RyR-канала является использование сугубо феноменологических дискретных марковских моделей
(Zahradnikova, В J, 1996; Fill, PhysiolRev, 2002), которые фактически никак не учитывают реальной структуры наноскопической молекулярной системы, что делает спорным вопрос об их адекватности.
Альтернативой марковским схемам являются непрерывные модели, которые основаны на принципах электронных и конформационных взаимодействий в белках. Примером данного типа моделей являются электронно-конформационные модели стохастической динамики RyR-каналов, разработанные А. С. Москвиным с соавторами (Moskvin, РВМВ, 2006) которые позволили объяснить ряд важнейших особенностей функционирования этого типа белков, однако, при моделировании RyR-каналов в Са2+-высвобождающей системе использовалась простейшая детерминированная схема их динамики без учета случайных переходов.
В данной диссертационной работе электронно-конформационная модель RyR-канала получила дальнейшее развитие и была применена для изучения Са2+-высвобождающей системы в клетках водителя сердечного ритма.
Цель работы. Основной целью диссертационной работы является развитие электронно-конформационной теории наноскопических белковых систем -одиночных RyR-каналов и кластеров RyR-каналов, а также разработка биофизически обоснованной физико-математической модели стохастической динамики Са2+-высвобождающей системы в клетках рабочих кардиомиоцитов и формирования сердечного ритма в клетках водителей сердечного ритма.
Для реализации поставленной цели в данной работе были сформулированы следующие задачи:
-
Усовершенствовать предложенную ранее (Moskvin, РВМВ, 2006) электронно-конформационную модель RyR-канала введением инактивационного состояния канала и детальным рассмотрением туннельных переходов с целью описания ряда эффектов стохастической динамики данного белка.
-
На основе усовершенствованной модели RyR-канала разработать модель Са2+ высвобождающей единицы и включить ее в интегративную модель динамики кальция в сердечной клетке.
-
Разработать комплекс программ для численного моделирования стохастической динамики одиночных RyR-каналов, кластера взаимодействующих каналов и моделирования кальциевой динамики в сердечных клетках.
-
Провести детальный параметрический анализ электронно-конформационной модели стохастической динамики одиночных RyR-каналов, исследовать кинетические характеристики и особенности поведения RyR-канала при постоянном значении концентрации Са2+ и при включении внешнего стимула.
-
Провести компьютерное моделирование динамики Са + в клетках водителей сердечного ритма в рамках интегративной модели Са2+ высвобождающей системы кардиомиоцитов, выявить причины возникновения автоколебательной Са2+-динамики.
-
Исследовать особенности и характеристики автоколебательной динамики Са2+ в кардиомиоцитах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, приложения и списка литературы. Работа изложена на 177 листах, включает 94 рисунка. Список литературы содержит 179 источников. Научная новизна работы.
Рианодиновый рецептор – основной элемент управления динамикой ионов кальция в клетке
В настоящее время моделированием сердечной активности занимается большое количество исследователей: биологов, биофизиков, физиков-теоретиков и математиков. Плодотворное сотрудничество учёных, работающих в различных областях знаний, позволило продвинуться в направлении понимания основных механизмов работы сердечных клеток и миокарда в целом. Физико-математическое моделирование в этой области исследований позволяет более четко объяснить многочисленные экспериментальные данные по изучению функции сердца.
Структура кардиомиоцита и его электрическая и механическая функция
Сердечная мышца относится к возбудимым тканям, клетки которых в ответ на тот или иной раздражитель (электрический, химический, механический) могут генерировать электрические потенциалы действия – характерные изменения мембранного потенциала клетки, приводящие к ее возбуждению [4, 5, 43, 83]. Более того, некоторые виды клеток могут возбуждаться самопроизвольно. В основе механизма генерации потенциала действия клетками лежит изменение проницаемости мембран клеток для некоторых ионов (натрия, кальция, калия), активирующие ионные токи через специальные структуры клеточной мембраны — ионные каналы. Процессы, обеспечивающие сокращение клетки в ответ на электрическую стимуляцию объединяются понятием электромеханического сопряжения в сердечных клетках. Для мышечного сокращения необходимо повышение внутриклеточной концентрации Са2+ от уровня покоя (около 0.1 мкМ) до 1 мкМ [43, 44]. Сердечные мышечные клетки (кардиомиоциты) включают в себя два основных типа по структуре и функциям: кардиомиоциты рабочего миокарда и клетки водителей сердечного ритма. Первый тип отвечает за механическое сокращение сердца, второй – за формирование устойчивого ритма сердечных сокращений [22]. Структура сердечной клетки является достаточно сложной [22, 83]: каждая клетка состоит из нескольких десятков повторяющихся сократительных единиц – саркомеров, длина которых около 2 мкм; поперечных трубочек (Т-трубочки, Т-тубулы), представляющих собой глубокие впячивания мембраны, опоясывают весь кардиомиоцит и локализуются у концов каждого саркомера. Сокращение саркомера обеспечивается мышечными волоконами (миофибриллами), расположенными вдоль саркомера и опоясанными сложной сетью внутриклеточных хранилищ ионов кальция, включающих продольный саркоплазматический ретикулум (СР), терминальные цистерны (ТЦ) (или люмен), примыкающие к мембране T-тубул (см. рис. 1.1б, рис. 1.3).
На мембране СР в местах контакта СР с Т-тубулами располагается группа специализированных Са2+-высвобождающих каналов, сопряженных с рианодиновыми рецепторами (RyR-каналы), через которые происходит высвобождение Са2+ из СР. Высвобождение носит триггерный характер, так как открытие RyR-каналов происходит в ответ на приток относительно небольшого количества Са2+ через ионные каналы, расположенные на мембране клетки – каналы L-типа или дигидропиридиновые рецепторы (см. рис.1.2, 1.3) [11, 83]. Рис. 1.2. Схема Са2+ высвобождающей единицы.
Адаптировано из [144]. На мембране СР RyR-каналы образуют группы (кластеры), состоящие из нескольких сотен каналов. Существуют структуры, состоящие из кластера RyR-каналов вместе с несколькими L-каналами клеточной мембраны, люменом СР и диадным пространством между мембранами СР и примыкающими Т-тубулами. Данные структуры называются Са2+ высвобождающими единицами (Release Unit) (ВЕ, рис.1.2). В кардиомиоците насчитывается несколько десятков тысяч ВЕ; они формируют кальций-высвобождающую систему клетки (рис. 1.3).
Начальное возрастание концентрации внутриклеточного кальция в ответ на электрическое возбуждение происходит благодаря поступлению ионов извне через L-каналы, однако такого повышения концентрации недостаточно для сокращения клетки [4, 43-46]. Внешний приток Са2+ активирует группы RyR-каналов, являясь стимулом для последующего высвобождения Са2+ из СР и повышения уровня Са2+ в цитозоле на порядок величины. Данный триггерный процесс носит название «кальцием вызванное высвобождение кальция» (КВВК) [43]. После высвобождения Са2+ из СР в диадное пространство и дальнейшей его диффузии в цитозоль увеличивается концентрация Са2+ вблизи миофибрилл, что приводит к сокращению саркомера. Относительная однородность повышения концентрации Са2+ в клетке обеспечивается особым устройством СР с небольшим расстоянием (не более 1 мкм) от любой точки клетки до ближайшей высвобождающей единицы [83].
Являясь одним из ключевых процессов электромеханического сопряжения, процесс КВВК требует тщательного экспериментального анализа и соответствующего математического моделирования.
В связи с тем, что высвобождение Са2+ из СР осуществляется через группы RyR-каналов, исследование их динамических свойств является важной задачей в изучении процессов электромеханического сопряжения.
RyR-канал является гигантским макромолекулярным комплексом (рис. 1.4), тетрамером, объединяющим четыре субъединицы (полипептидные цепи) с молекулярной массой 567 кДа каждая [162, 166]. Активность RyR модулируется под действием растительного алкалоида рианодина из коры Ryania speciosa, что и определило его название «рианодиновый рецептор». Существуют три изоформы RyR-каналов: RyR1 (клетки скелетной мускулатуры и мозжечка), RyR2 (клетки сердечной мышцы и мозга), RyR3 (клетки гладкой мускулатуры). Они различаются по своей структуре и динамическим параметрам. Как уже было сказано выше, RyR-каналы располагаются на мембране СР; при переходе в открытое состояние через них происходит высвобождение ионов Са2+ из просвета ТЦ (люмена). Согласно данным электронной микроскопии [162], RyR-канал имеет форму четырехлистника со стороной 27 нм (рис. 1.4).
На рисунке 1.6 приведены результаты экспериментальных исследований структуры мембраны СР [168]; видно, что на мембранах RyR-каналы объединены в кластеры (решетки) (от 100 до 300 каналов в каждой). Каналы в решетке упорядочены и находятся под определенным углом друг к другу, также экспериментальные данные многих исследовательских групп говорят о существовании взаимодействия между каналами в кластере благодаря наличию между ними специфических связывающих белков [168, 118, 163].
Изучая динамические особенности изолированных RyR-каналов независимо друг от друга несколько авторов исследовали поведение RyR-каналов в лабораторных условиях в липидных бислоях при постоянных концентрациях ионов Са2+ в растворе в условиях отсутствия кальциевой стимуляции [95, 96, 166, 170-172]. Схема типичной установки представлена на рис. 1.7. В экспериментах раствор разделяется на две части липидным бислоем, имитирующим клеточную мембрану, в котором закрепляется RyR-канал. Та часть, которая соответствует люменальной стороне канала, называется trans, цитозольной стороне – cis.
В работах [95, 111, 170-174] с помощью подобных установок была проведена серия экспериментов по регистрации ионных токов через одиночный канал при различных концентрациях Са2+ в растворе. Отсутствие тока указывало на нахождении канала в закрытом состоянии, а их присутствие – на его открытие.
Первым важнейшей особенностью RyR-канала как нанообъекта является стохастический характер процессов открытия/закрытия при постоянных значениях концентраций cis[Ca] и trans[Ca] [95, 170].
График зависимости активности канала от времени можно разбить на участки (так называемые пучки (bursts)) с различной вероятностью нахождения канала в открытом состоянии. Данный эффект получил название модовой проводимости (Modal Gating) [37, 58, 171].
Исследование зависимости вероятности пребывания канала в открытом состоянии от значения концентрации Са2+ в trans-части показало [163, 74, 76], что в ответ на повышение trans[Ca] увеличивалась частота открытий канала и вероятность Popen (рис. 1.10). Из данного экспериментального факта можно сделать непосредственный вывод, что вероятность открытия RyR-канала увеличивается с ростом концентрации Са2+ в люмене.
Зависимость вероятности пребывания канала в открытом состоянии ( Popen ) от значения trans[Ca] . Рисунок адаптирован из работы [74]. В ряде работ [15, 74, 162, 170], исследовавших влияние концентрации cis[Ca] на активность RyR-канала, показано, что при повышении концентрации Са2+ в цитозоле ( 10 мкM) наблюдается резкое повышение частоты открытий канала и, соответственно, увеличение вероятности открытия одиночного канала. Далее, при достижении определенного значения концентрации ( 100 мкM) происходит спад Popen(cis[Ca]), то есть наблюдается процесс инактивации RyR-канала при повышенной концентрации цитозольного кальция (рис.1.11).
Влияние уровня trans[Ca] на форму конформационного потенциала RyR-канала
Отдельно следует рассмотреть целый класс стохастических моделей динамики белков, и, в частности, ионных каналов, которые основаны на принципах электронных и конформационных взаимодействий в белках [12, 32, 34, 42, 102, 103, 130].
Белковые комплексы рассматривается как вязкоупругие объекты [32, 34], обладающие большим количеством степеней свободы.
Перераспределение химических связей в ходе взаимодействия активных центров белковых соединений с ионами изменяет распределение электронной плотности в реагирующих молекулах, изменяя тем самым баланс сил внутри белка, что приводит к тому, что равновесная конформация белка до и после реакции различны. Это явление называется электронно-конформационным взаимодействием, а соответствующее изменение структуры - электронно-конформационным переходом [32, 34]. Этот переход можно также рассматривать и как конформационную релаксацию под действием нескомпенсированных сил, возникающих после акта перераспределения электронной плотности или иных изменений в активном центре белка. Присоединение очень небольшого по размерам иона к активному центру ионного канала вызывает существенные изменения конформации белка -поворот субъединиц на расстояние порядка 10 А. Этот пример показывает, насколько тонким является баланс сил, стабилизирующих конформацию белковой структуры. Для различных биологических объектов, структура которых хорошо изучена, методом молекулярной динамики проводятся численные эксперименты по построению так называемых карт свободной энергии конформационных состояний. На рисунке 1.18а представлен график зависимости свободной энергии калиевого канала от расстояния между субъединицами х, образующими канал. Как видно из рисунка, открытому, закрытому и промежуточному состояниям канала соответствуют минимумы потенциала, разделенные потенциальными барьерами.
Ярким примером непрерывных моделей динамики макромолекулярных комплексов является теория процессов открытия Са2+-активируемых K+-каналов [44]. При разработке данной математической модели авторы основывались на ряде важнейших фактов, выявленных экспериментально и характеризующих кинетику активности ионных каналов, таких как:
В модели [12] конформационное состояние канала и, соответственно, его проводимость определялись с помощью введения угла отклонения подвижных трансмембранных сегментов канала от центральной оси поры (рис. 1.18б,в). Предполагалось, что канал при отсутствии внешних воздействий может находиться в двух устойчивых состояниях (открытое и закрытое). Переходы между состояниями осуществляются благодаря воздействию тепловых флуктуаций на подвижные части сегментов. Потенциальная энергия воротного механизма (структуры) описывается функцией с двумя локальными минимумами, соответствующими открытому и закрытому состояниям канала (рис. 1.18д).
Таким образом, существует альтернатива теориям, основанных на марковских процессах, описывающих процессы открытия/закрытия ионных каналов. Вышеописанные модели позволяют более детально описать динамику биомолекул и предполагают использование энергетического подхода к описанию конформационных изменений различных биофизических объектов. Рис.1.18. а. Результаты численных экспериментов по исследованию зависимости свободной энергии калиевого канала Е от расстояния между субъединицами х (адаптировано из [180]) б. Модель Гриневича К+-каналов. Структура канала с ионами К+ и молекулами воды внутри поры. в. Схема модельного ионного канала, построенного на основе структуры К+-канала. г. Упрощенная схема воротного механизма модельного канала, (рmax -максимальный угол, на который отклоняются подвижные части трансмембранных сегментов (ТМ2) канального белка при его открывании, Dтах -максимальный диаметр внутриклеточного устья канала, L - длина подвижной части сегмента ТМ2. д. Профиль безразмерной потенциальной энергии, которая описывает внешние воздействия на трансмембранные сегменты ТМ2 . Ec и E0 - глубины потенциальных ям в закрытом и открытом состояниях. Адаптировано из работы [12]. 1.5.2. Описание динамики RyR-канала в рамках электронно-конформационной модели
В ИИФ УрО РАН совместно с кафедрой теоретической физики ИЕН УрФУ была разработана непрерывная электронно-конформационная модель стохастической динамики RyR-каналов [31, 122, 123]. Основные положения электронно-конформационной модели базируются на представлениях теории фотоиндуцированных структурных фазовых переходов [71, 88, 89, 120, 124], которая нашла широкое применение в алгоритмах метода молекулярной динамики для компьютерного моделирования состава, структуры и свойств различных сложных сред [120, 124].
Основное приближение электронно-конформационной модели заключается в сведении огромного числа степеней свободы RyR-канала к двум: конформационной (отвечающей за проницаемость канала) и электронной (описывающей связанность активных центров канала с ионами Са2+). Как и в модели калиевого канала, состояние канала описывается конформационным потенциалом, минимумы которого соответствуют открытому и закрытому состоянию канала.
Простая схема динамики канала предполагала существование двух ветвей конформационного потенциала, вероятность электронных переходов между которыми зависит от концентрации Са2+ в cis-части. Процессы активации и инактивации канала включают прямые («франк-кондоновские») электронные переходы между ветвями конформационного потенциала, ланжевеновскую конформационную динамику медленной степени свободы и непрямые переходы, связанные с термофлуктуациями и квантовыми эффектами («туннелирование»).
Детальное описание электронно-конформационной модели представлено в главе 2 настоящей работы.
В рамках электронно-конформационной модели проводились численные эксперименты по исследованию динамики RyR-канала при постонянном значении концентрации Са2+ в cis- и trans-частях [31], cравнительный анализ которых с экспериментальными данными показал, что в рамках модели удалось описать ряд важных эффектов динамики RyR-канала. Например, экстремальную зависимость вероятности пребывания канала в открытом состоянии (Popen ) от cis[Ca] и эффект увеличения Popen с ростом trans[Ca]. Эти эффекты описаны в п. 1.3 настоящей работы. Однако, следует отметить, на первоначальном этапе в рамках модели не удалось объяснить эффект адаптации канала к продолжительной стимуляции и влияние ионов Mg2+ на активность RyR-канала. Для описания данных эффектов потребовались усовершенствование модели, модификация алгоритмов численной реализации, а также создание программного комплекса и проведение серий численных экспериментов.
Одной из самых распространенных теорий для описания процесса КВВК на протяжении долгого времени являлась так называемая «теория общего пула» [126, 148, 167]. Она основана на усреднении концентрации Са2+ в сарколемме и в субклеточных пространствах. В рамках этой модели огромное количество Са2+-высвобождающих единиц описывались одной обобщенной модельной высвобождающей единицей. При этом поток Са2+ через L-каналы объединен в общий стимулирующий поток, а поток высвобождающегося Са2+ – в общий поток высвобождения. Оба этих потока направлены в один обобщенный отдел клетки, называемый субпространством (объединенное диадное пространство), причём процесс высвобождения зависит от концентрации Са2+ в субпространстве. Следовательно, однажды запущенное высвобождение Са2+ из СР должно повышать концентрацию Са2+ в субпространстве по принципу "всё или ничего". Согласно этой модели количество высвободившегося Са2+ не зависит от величины стимулирующего мембранного тока, что противоречит экспериментальным данным [134].
Медленная конформационная динамика RyR-канала
Этот метод позволяет выявить скоррелированность определенного ряда данных на больших интервалах времени и определить фрактальную размерность временного ряда - размерность Хаусдорфа-Безиковича: D = 2-H, где Н - показатель Херста.
Согласно [30], значения Н 0.5 указывают на положительную корреляцию (персистентный процесс), а Н 0.5 на отрицательную корреляцию (антиперсистентный процесс) измеряемой величины со временем. И тот и другой процессы являются процессами с «памятью», когда последующие события определяются предшествующими. Величина Н=0.5 характеризует случайный процесс.
Накопившееся отклонение конформационной координаты от среднего значения ( 2(0/ определяется как: X(t,T) = Y\Q(u)-{Q(t)) . Разность между максимальным и минимальным значениями Q(t) в выборке (кумулятивное отклонение от среднего) на интервале времени описывается формулой:
Показатель Херста Н определяется через тангенс наклона прямой 1п(Д/5) = #1п(г/2), полученной в результате аппроксимации точек прямой методом линейной регрессии в логарифмических координатах. Этот показатель характеризует скоррелированность членов исследуемого ряда.
При анализе результатов численных экспериментов по изучению зависимости Q(t) на интервале времени г, вводилась новая переменная
Результаты исследования временного ряда Q(t) методом Херста при различных значениях параметра эффективного трения Г (а); при различных значениях параметра упругости канала К (б).
На основании полученных зависимостей можно сделать вывод, что динамика RyR-канала в рамках ЭК-модели является сильно коррелированной (Н 1.0) на относительно коротком промежутке времени, сравнимом с длительностью конформационной релаксации канала в метастабильный минимум потенциала, соответствующий открытому состоянию, и слабо коррелированной на длительных промежутках времени (Н 0.5).
Основываясь на результатах проведенного R/S-анализа, можно заключить, что в рамках электронно-конформационной модели динамика координаты Q канала является не только стохастической, но и детерминированной, причем на коротких интервалах времени, и при этом исследуемая система обладает «памятью».
Следует отметить, что на сегодняшний день в литературе отсутствуют экспериментальные данные, указывающие на фрактальные свойства RyR-каналов, поэтому необходим более детальный экспериментальный анализ конформационных изменений RyR-канала с целью подтверждения результатов, полученных с помощью представленной здесь модели.
Для предсказания поведения исследуемой системы требуется детальный параметрический анализ как медленной конформационной динамики, так и быстрых переходов RyR-канала в рамках ЭК модели.
Медленная конформационная динамика RyR-канала На первоначальном этапе с целью изучения активности одиночного RyR-канала исследовалось влияние основных констант конформационного потенциала (2.4) и коэффициентов, входящих в уравнение Ланжевена (2.7) на характер динамики канала. Параметр эффективного трения Г. Конформационная динамика RyR-канала Коэффициент эффективного трения Г, входящий в уравнение Ланжевена (2.7), влияет на характер изменения конформационной координаты Q со временем. Приведенное уравнение (М=1) изменения конформационной координаты при отсутствии тепловых возмущений (T7temp(t) = 0) может быть записано в терминах затухающего гармонического осциллятора: где А и В - константы. Критическое затухание примечательно тем, что именно в этом случае осциллятор быстрее всего стремится к положению равновесия, причем, если коэффициент трения Г меньше критического, то он дойдет до положения равновесия быстрее, однако, при этом «проскочит» его по инерции. В этом случае осциллятор будет совершать колебания вблизи точки минимума.
При значениях Г больше критического (Г 2Й;0) решение выглядит следующим образом: Q(t) = Ae-fi1t+Be-02t, (3.7) где Д 2 = -Г / 2 + J(T /2)2 - а 1 . В этом случае осциллятор будет экспоненциально стремиться к положению равновесия, причем тем медленнее, чем больше трение. Поскольку в электронно-конформационной модели (О0=У/К, то критическое значение трения определяется как: Тсгі(=2у/К. (3.8) Величина коэффициента Г варьировалась выше и ниже критического значения Ycnt. При фиксированном значении параметра #=12 значение Гсп6.8. При Г Гcrit наблюдались колебания системы вблизи минимума потенциала (рис. 3.4а, колебания отмечены пунктирным прямоугольником). При Г Гcrit наблюдался неколебательный случай динамики RyR-канала (рис. 3.4б)
При проведении дальнейших численных экспериментов параметр Г выбирался по значению больше критического (Г=7). Влияние коэффициента упругости канала К на форму конформационного потенциала Конформационный потенциал (2.4) имеет два локальных минимума со следующими Первый минимум соответствует закрытому, второй - открытому состоянию канала. Положение этих минимумов зависит от величины коэффициента упругости К. Варьируя значения К в широком интервале [1; 20] при фиксированном наборе остальных коэффициентов в (2.4), можно исследовать влияние этого параметра на свойства конформационного потенциала. Типичные графики конформационного потенциала представлены на рисунке 3.5. K= \E(Q) E(Q ю4/ /
Как видно из рисунков 3.5 и 3.6, с увеличением значения коэффициента K уменьшается расстояние между минимумами КП и крутизна ветвей КП. При изучении конформационной динамики канала исследовалось среднее время релаксации канала из точки, соответствующей одному минимуму КП в другой минимум (trelax ).
Как показывает график, представленный на рисунке 3.7, с ростом К уменьшается значение trelax . Другими словами, варьируя параметр К, можно менять скорости конформационной релаксации канала в ЭК-модели. В дальнейших экспериментах значение К выбиралось равным 12.
Эффект задержки туннелирования в процессе динамики Са2+
Ионы Mg2+ являются потенциальными ингибиторами RyR-каналов, в связи с этим находят активное применение в фармакологии и терапии для понижения частоты высвобождений Са2+ для предотвращения аритмии и других патологий.
Модификация электронно-конформационной модели и введение инактивационного состояния позволили описать не только основные свойства изолированных RyR-каналов, но и важнейшие тонкие эффекты взаимодействия каналов с ионами Са2+, которые являются механизмами негативного контроля и должны учитываться при моделировании процесса КВВК.
Разработанная ранее [121-123] электронно-конформационная теория динамики одиночного RyR-канала была усовершенствована в рамках данной работы. Предложена детальная схема стохастической динамики RyR-канала, включающая в себя стохастические переходы, которые соответствуют изменениям структуры RyR-канала в связи со связыванием ионов Са2+ с активационными и инактивационным центром канала.
В данной главе приведены результаты параметрического анализа усовершенствованной электронно-конформационной модели одиночного RyR-канала, сравнения результатов ЭК-модели с традиционными теориями, основанными на марковских цепях. зависимости вероятности пребывания RyR-канала в открытом и закрытом состояниях при постоянном уровне cis[Ca]; влияния ионов Mg2+ на активность RyR-канала при стационарных условиях. зависимости конформационной координаты Q от времени методом Херста.
Сравнительный анализ показал, что результаты проведенных численных экспериментов хорошо согласуются с известными экспериментальными данными, и ЭК-модель дает адекватное описание стохастической динамики RyR-канала.
Моделирование динамики ионов Са2+ между отделами кардиомиоцита В данной главе диссертационной работы описаны эффекты, связанные с кооперативной динамикой RyR-каналов в кластере высвобождающей единицы. Также представлены результаты параметрического анализа модели динамики ионов Са2+ между отделами клетки водителя сердечного ритма.
Анализ модели высвобождающей единицы При динамике ионов Са2+ в высвобождающих единицах изменяются условия функционирования RyR-каналов в кластере на мембране СР. Для описания процессов открытия/закрытия каналов в кластере требуется исследовать особенности динамики RyR-каналов при заполнении/высвобождении Са2+ из люмена СР, кроме этого необходим анализ уравнений, описывающих высвобождающие единицы, для выявления возможных вариантов поведения системы.
Процессы открытия и закрытия каналов в высвобождающих единицах. В модели, рассматриваемой в данной работе, поток высвобождения Са2+ в диадное пространство, а также количество высвободившегося Са2+ зависят от числа открытых каналов в кластере. Предполагается, что завершение процесса высвобождения напрямую связано с процессом закрытия каналов вследствие истощения люмена. В связи с этим необходимо исследовать процессы открытия и закрытия каналов в процессе Са2+-динамики в высвобождающей единице.
В процессе заполнения люмена или высвобождения в диадное пространство изменяется параметр эффективного давления p , который влияет на форму КП RyR-канала и на вероятности переходов из одного состояния в другое.
На рисунке 4.1 представлены графики конформационного потенциала при различных значениях параметра эффективного давления p . Правый минимум (О) отвечает за открытое состояние, а левый – за закрытое состояние канала (С).
Из рисунка видно, что туннелирование из состояния С в состояние О может происходить только при p 0 и, наоборот, из О в С при p 0 (то есть при понижении концентрации Са2+ в люмене ниже значения KCa). Анализ кооперативной динамики RyR-каналов в кластере При анализе модели особенно важным является изучение изменения динамики канала в зависимости от конформационного состояния его соседей при учете взаимодействия между каналами в кластере. В связи с этим была проведена серия численных экспериментов на квадратном кластере взаимодействующих RyR-каналов размерностью 9х9.
На рисунке 4.3а представлены графики конформационного потенциала RyR-канала, ближайшие соседи которого находятся в закрытом состоянии, при двух значениях параметра конформационного взаимодействия (k=0 и к=1). При сравнении этих графиков можно сделать вывод, что при включенном взаимодействии (пунктирная линия) закрытое состояние является более устойчивым, чем в случае при нулевом значении параметра к (без учёта взаимодействия) (сплошная линия).
На рисунке 4.3б представлены конформационные потенциалы канала с учетом взаимодействия с закрытыми соседями и без его учета при /7=0.
В отсутствие взаимодействия наблюдается равновесие локальных минимумов. В этом случае возможно туннелирование каналов из закрытого состояния в открытое. При включенном взаимодействии (штрихованная линия) закрытое состояние остается глобальным минимумом, и туннельный переход в открытое состояние запрещен.
При определенном значении параметра эффективного давления p устанавливается равновесие локальных минимумов КП. Условия, при которых возможно это равновесие, можно рассчитать аналитически.
Пусть канал находится в закрытом состоянии. Конформационная координата соседних каналов взаимодействующих с ним каналов равна
Это означает, что при сильном взаимодействии между каналами необходим более высокий уровень CajSR, при котором начинается процесс открытия каналов, чем в случае слабого взаимодействия. Эффект задержки туннелирования в процессе динамики Са2+
Для изучения процесса туннелирования каналов в открытое состояние при заполнении люмена ионами Са2+ была проведена серия численных экспериментов в рамках электронно-конформационной модели. В начальный момент времени все каналы находились в закрытом состоянии, уровень Ca-SR равнялся 0.05 мМ, значение параметра эффективного давления: р = -\. С течением времени происходило заполнение люмена с константой скорости заполнения kref= 0.005 мс"1. Значение уровня концентрации Ca-SR, при котором параметр р достигает нулевого значения: КСа = 0.615 мМ. Взаимодействие между каналами не учитывалось.
Как видно из рисунка, параметр p достигает нулевого уровня в момент времени 39 мс (стрелка 1), однако каналы начинают открываться только в момент времени 67 мс с начала эксперимента (стрелка 2).
По представлениям модели в момент, когда p достигает нулевого значения, минимум конформационного потенциала, соответствующий закрытому состоянию, становится метастабильным, и должно начинаться туннелирование каналов в открытое состояние. Однако в эксперименте наблюдалась задержка процесса туннелирования. При анализе экспериментов было выявлено, что данную задержку открытия каналов определяют особенности конформационной динамики RyR-канала. Необходимо рассмотреть более подробно процесс изменения конформационного потенциала при заполнении люмена, схематично изображенный на рисунке 4.6.
