Введение к работе
Актуальность проблемы.
Установлено, что разобщение дыхания и синтеза АТР является одним из главных механизмов срочного образования тепла у теплокровных животных. В бурой жировой ткани (БЖТ), специализированной на продукции тепла, такое терморегуляторное разобщение опосредовано разобщающим белком - 1 (UCP1), ранее именовавшимся термогеншюм (см. Skulachev, 1988; Nedergaard et ah, 2001; Klingenberg, 2001). Долгие годы термогенин считался уникальным белком, присутствующим исключительно в БЖТ. Предполагалось, что в остальных тканях такое разобщение дыхания, приводящее к дополнительному поглощению кислорода и выделению тепла при низких температурах, помимо своей основной транспортной функции, могут осуществлять другие митохондриальные белки -анионные переносчики, такие как ATP/ADP антипортер (ANT) и аспатрат/глутаматный переносчик, для функционирования которых в этом случае, как и для UCP1, требуется присутствие свободных жирных кислот (Skulachev, 1998). Однако в 1997 году были открыты еще два белка, гомологичные UCP1 по своей аминокислотной последовательности, - UCP2, был обнаружен во всех тканях млекопитающих, кроме паренхимальных гепатоцитов (Fleury et al., 1997), и UCP3, который оказался специфичным для скелетных мышц (Boss et al., 1997). В экспериментах с белками, реконструированными в липосомы, было показано, что по своим транспортным свойствам, включая способность активироваться жирными кислотами и ингибироваться GDP, эти белки в целом аналогичны UCP-1 (Jaburek et al., 1999; Echtay et al., 2000). Широкое распространение получило представление о том, что именно UCP ответственны за несократительный термогенез и регуляцию основного обмена в тканях животных. Ранее обнаруженный факт участия ANT и других мембранных митохондриальных белков в разобщающем действии свободных жирных кислот стал представляться скорее экспериментальным артефактом. В настоящее время спектр обнаруженных UCP стал еще шире, и соответствующие разобщающие белки были обнаружены даже у одноклеточных и растений. Хотя результаты различных исследований UCP противоречивы и свидетельствуют о возможности существования для этих белков других функций, отличных от функций термогенина бурой жирозой ткани, большинство авторов по-прежнему сходятся в одном, что функция этих белков в клетке основана на их протонофорной активности, осуществляемой при участии жирных кислот, и связана с разобщением процессов дыхания и фосфорилирования в митохондриях. Это являлось отправной точкой и в наших исследованиях.
У животных способных к зимней спячке (гибернации), наиболее ярко проявляются все процессы, связанные с терморегуляцией. Ранее в нашей лаборатории была изучена роль ANT в терморегуляторном разобщении дыхания и фосфорилирования в препаратах митохондрий печени и скелетной мускулатуры выходящих из состояния гибернации сусликов. Было продемонстрировано резкое увеличение ресопрягающего действия специфического ингибитора ANT -карбоксиатрактилата (cAtr), на препараты митохондрий печени и скелетных мышц сусликов, выходящих из состояния гибернации (Брустовецкий др., 1991; Amerkhanov et al., 1996). Однако участие аспартат/глутаматного переносчика и UCP в терморегуляторном разобщении дыхания и фосфорилирования в препаратах
митохондрий печени и скелетной мускулатуры у гибернирующих животных не исследовалось.
Цель работы: изучить вклад UCP и других белков - анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в механизм разобщающего действия жирных кислот и реализацию терморегуляторного разобщения в митохондриях печени и скелетных мышц гибернирующих животных в различных физиологических состояниях.
В соответствии с целью были поставлены следующие конкретные задачи:
-
Изучить механизм ресопрягающего действия GDP на митохондрии печени и скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus и дифференцировать предполагаемые функциональные проявления UCP от проявлений активности ANT и аспартат/глутаматного переносчика с помощью соответствующих ингибиторов.
-
Используя описанную в литературе способность UCP-2 и UCP-3 активироваться супероксидом, исследовать ресопрягающее действие GDP в условиях вызванного супероксидом разобщения.
-
С помощью ингибиторов аспартат/глутаматного переносчика, ANT и разобщающих белков (UCP) выявить вклад каждого из них в терморегуляторное разобщение в митохондриях печени и скелетных мышц выходящих из состояния гибернации сусликов.
-
Опираясь на описанные в литературе свойства белков UCP, обнаружить их присутствие и функционалыгую активность в тканях печени и скелетных мышц гибернирующих сусликов.
Научная новизна работы. Впервые в эксперименте, направленном на выявление активности UCP, для исключения вклада других митохондриальных белков, способных участвовать в транспорте анионов жирных кислот, использованы последовательные добавки специфических ингибиторов. Впервые показано, что ресопрягающий эффект GDP не может служить объективным тестом для выявления функционирования UCP, и представлены доказательства конкурентного взаимодействия GDP с ANT. Впервые в экспериментах на интактных митохондриях печени и мышц показано отсутствие в них проводимости для ионов хлора, характерной для митохондрий БЖТ, содержащих UCP1. Установлено, что cAtr не способен ингибировать UCP1 из БЖТ. На основании этих результатов сделано заключение, что гомологи UCP в печени и скелетных мышцах не участвуют в терморегуляторном разобщении дыхания при пробуждении животных из состояния гибернации, а также в разобщении, активируемом супероксидом. Также нами проведены измерения уровня экспрессии мРНК UCP2 в печени и UCP3 мышцах якутского суслика в различных сезонных состояниях.
Научно-практическое значение работы. Проведенные исследования расширяют представления о внутриклеточных механизмах, обеспечивающих поддержание природных гипометаболических состояний у млекопитающих. Дают новые сведения о возможных путях регуляции биоэнергетических процессов в клетке. Полученные результаты указывают на необходимость возобновления поиска функций тканеспецифических гомологов UCP. Результаты исследований
используются в учебном процессе в Образовательном центре при ИБК РАН. Они могут иметь значение для медико-биологических работ, направленных на исследование роли UCP в различных патологических процессах, включающих такие социально значимые заболевания, как диабет и ожирение.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 8-й Международной школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущине, 2004); 19-ом Съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Екатеринбург, 2004); Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина" (С-Петербург, 2005); Международной научной конференции "Современные проблемы адаптации и биоразнообразия" (Махачкала, 2006 и 2008); 16-ой Европейской Конференции по Биоэнергетике (Варшава, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы двенадцать печатных работ, из них три статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (280 источников). Работа изложена на 125 страницах, иллюстрационный материал включает 26 рисунков и 5 таблиц.
