Введение к работе
Актуальность проблемы
Основополагающей функцией хемосенсорных клеток в составе вкусовой почки является распознавание вкусовых веществ, их трансдукция и кодирование информации об их концентрации и вкусовой модальности с целью дальнейшего анализа в соответствующих структурах мозга. Эти и другие функции клеток вкусовой почки реализуются при участии разветвленных межклеточных коммуникаций, обеспечивающих синхронизацию разнородных физиологических процессов, протекающих во вкусовой почке. В этой клеточной системе идентифицировано семейство метаботропных и ионотропных рецепторов к таким классическим нейротрансмиттерам, как глутамат, серотонин, ГАМК, АТР, норадреналин, холектокинин, пейропептид Y, и несколько сигнальных каскадов, сопряженных с ними. Роль этих сигнальных систем в физиологии периферического вкусового органа по большей части неизвестна. Возможность избирательно контролировать активность сигнальных процессов представляет собой инструмент, с помощью которого можно судить на физиологическом уровне о биологической функции исследуемой сигнальной системы. В настоящей работе ставились и решались задачи, как часть исследования роли серотонинергической и пуринсргической систем в физиологии вкусовой почки.
Основываясь на ряде фактов, в качестве основного кандидата на роль афферентного нейротрансмиттера во вкусовой почке до недавнего времени рассматривался серотонин (5-НТ). Так, было установлено, что в окончаниях вкусового нерва, иннервирующего вкусовую почку, локализован 5-НТз-рецептор и, что вкусовые вещества стимулируют высвобождение серотошша из вкусовых клеток. Оказалось, однако, что у мышей с нокаутированным геном 5-НТ3 рецептора периферическая вкусовая система функционирует практически без нарушений. Эти результаты показывали, что серотонин не является ключевым афферентным нейротрансмиттером, непосредственно используемым для кодирования вкусовой информации.
Еще одной важной сигнальной системой вкусовой почки является пуринергическая система. Методами иммуногистохимии было показано присутствие ионотропных (Р2Х2 и Р2Х3) пуринорецепторов в окончаниях вкусового нерва. Это дало основание предположить, что АТР может выполнять функцию афферентного нейротрансмиттера, которых, вообще говоря, может использоваться несколько с целью кодирования разных вкусовых модальностей. Далее было показано, что вкусовые клетки экспрессируют несколько изоформ метаботропных (P2Y) пуринорецепторов, которые сопряжены с мобилизацией внутриклеточного Са2+. Принципиально важные данные обеспечил нокаут двух генов, кодирующих Р2Х2 и Р2Хз. Оказалось, что у мышей с данной генетической модификацией была практически полностью нивелирована способность ощущать вещества всех базовых вкусовых модальностей, а именно, горькие, сладкие, умами (вкус глютамата и некоторых других аминокислот), соленые и кислые. Кроме того, было показано, что АТР высвобождается вкусовыми клетками мыши в ответ на стимуляцию. Таким образом, АТР с одной стороны является ключевой сигнальной молекулой в афферентной передаче первичной вкусовой информации, а с другой - пуринергическая сигнальная система обеспечивает ларакршшые регуляции в периферическом вкусовом органе.
Сигнальные системы вкусовой почки физиологически исследовались преимущественно на уровне изолированных вкусовых клеток. Между тем, в таких условиях определенные физиологические функции могли быть утеряны в силу
разрушения естественных связей между клетками вкусовой почки. По-всей видимости, функциональные свойства вкусовой почки не есть аддитивная сумма свойств индивидуальных вкусовых клеток, и их следует реконструировать на более интегральном уровне, например, используя физиологически активные срезы вкусовых сосочков или регистрацию активности вкусового нерва, т.е. препараты, в которых сигнальные связи между клетками в значительной степени или полностью сохранены. Очевидная трудность физиологических исследований таких интегральных систем состоит в том, что вклад отдельной системы в физиологический ответ невозможно однозначно установить, если не использовать селективные агонисты и антагонисты соответствующих рецепторов или селективные ингибиторы сопряженных с ними эффекторкых сигнальных белков.
Одним из возможных подходов является изучение физиологических процессов на срезах вкусовых сосочков в условиях точечной интервенции в межклеточные коммуникации, протекающие при участии данной сигнальной системы. Поэтому в качестве промежуточной задачи, в настоящей работе исследовались возможные мишени для такой точечной интервенции, а именно, потенциал-зависимые Са2+-каналы вкусовых клеток типа III, ответственные за секрецию серотонина и, возможно, некоторых других нейромедиаторов, а также Р2Х2 и Р2Х3 рецепторы, обеспечивающие восприятие вкусовым нервом сенсорной информации в виде квантов внеклеточного АТР. В процессе решения этих задач, нами были освоены методы молекулярного клонирования и методы реконструкции ионных каналов в экспрессионной системе.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы явилось функциональное исследование ионных каналов, вовлеченных в межклеточные коммуникации, включая афферентную неиропередачу вкусовой информации, во вкусовой почке мыши.
В рамках сформулированной цели решались следующие задачи:
Исследовать ПЗ Са2+-каналы, функционирующие во вкусовых клетках типа III.
Охарактеризовать неселективные ионные каналы вкусовых клеток типа II.
Исследовать свойства ионотропных пуринорецепторов, функционирующих во вкусовой почке мыши.
Научная новизна работы.
Методами микрофотометрии и используя Са2+ зонды, показано, что в физиологических условиях потенциал-зависимые Са2+-каналы функциональны более чем в 90% популяции клеток типа III, формирующих классический Са2+-зависимый химический синапс. Методами электрофизиологии и молекулярной биологии показано, что потенциал-зависимая Са2+ проницаемость этих клеток обеспечивается преимущественно Са +-каналами типа Cavl.2.
Установлено, что во вкусовых клетках типа II функционируют неселективные ионные каналы, проницаемые для крупных органических катионов и анионов, включая АТФ. Эти каналы могут обеспечивать основной путь высвобождения афферентного нейротрансмиттера АТФ вкусовыми клетками типа И, что полностью согласуется с отсутствием Са2+-зависимого везикулярного секреторного механизма в клетках этого типа.
Установлено, что пептидные токсины из яда пауков потенциируют высокоаффинную десенситизацию Р2Х3 рецепторов. Благодаря этому свойству, пептидные токсины способны оказывать ингибирующие эффекты на Р2Х3
рецепторы на фоне 10-100 нМ внеклеточного ЛТФ in vivo, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных аналгетиков.
Научно-практическая значимость исследования.
Проведенные исследования вносят заметный вклад в существующие представления о ионных каналах, функционирующих во вкусовых клетках, и о их возможной физиологической функции. Полученные клеточные линии с функциональными К -каналами и иопотрошшми Р2Х пурииорецепторами могут иметь практическое применение для прикладных исследований, в том числе для тестирования компонентов лекарственных препаратов.
Апробация результатов диссертации.
Научные результаты и выводы докладывались на на 12-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2008г.), Международном научно-практическом семинаре «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем» (Санкт-Петербург, 2008), 13-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2009), 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пушино, 2010г.).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 3 тезиса.
