Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Гранзимы — протеазы, содержащиеся в гранулах цитотоксических лимфоцитов 11
1.2. Активация прокаспаз 14
1.3. Ингибиторы апоптоза 17
1.4. Разрушение апоптотических мишеней 19
2. Математическая модель динамики активации апоптоза гранзимом 22
2.1. Схема биохимических реакций апоптоза, индуцированного гранзимом В 22
2.2. Система уравнений, описывающих динамику активации апоптоза гранзимом В, и начальные условия 26
2.3. Начальные (фоновые) концентрации белков системы апоптоза 36
2.4. Кинетические константы биохимических реакций апоптоза 41
3. Математическая модель фонового состояния системы апоптоза 47
3.1. Система уравнений, описывающих устойчивость фонового состояния апоптотической системы 47
3.2. Условие устойчивости фонового состояния системы апоптоза 51
3.3. Показатель устойчивости 53
4. Исследование динамики апоптоза, индуцированного гранзимом в и каспазой -8 58
4.1. Влияние концентрации гранзима В на динамику апоптотической клеточной смерти 60
4.2. Влияние дефицита прокаспаз на динамику активации апоптоза гранзимом 69
4.3. Динамика ограниченного протеолиза некоторых апоптотических мишеней 7 6
4.4. Влияние концентрации ингибитора ХІАР на динамику клеточной смерти 81
4.5. Влияние величины показателя устойчивости на резистентность злокачественной клетки к действию малой концентрации инициаторной каспазы-8 87
Заключение 97
Библиографический список использованной литературы .100
Приложение
- Разрушение апоптотических мишеней
- Система уравнений, описывающих динамику активации апоптоза гранзимом В, и начальные условия
- Условие устойчивости фонового состояния системы апоптоза
- Влияние дефицита прокаспаз на динамику активации апоптоза гранзимом
Введение к работе
Актуальность темы. В последние время явление апоптоза, или запрограммированной клеточной смерти, привлекает растущее внимание исследователей. Это связано в первую очередь с возможностью использования индукции апоптоза в малигнизированных клетках как эффективного метода лечения онкологических заболеваний. Предлагаемая работа посвящена исследованию динамики активации апоптоза. В работе применён метод исследования, основанный на математическом моделировании. Полученные результаты вносят определённый вклад в понимание функционирования системы апоптотических белков и, следовательно, способствуют созданию новых методов лечения онкологических заболеваний путём индукции апоптоза в малигнизированных клетках.
Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование методом математического моделирования динамического поведения системы апоптотических белков в ответ на действие естественного индуктора гранзима В, а также устойчивости этой системы в отсутствие гранзима В. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: разработать математическую модель динамики активации
апоптоза гранзимом В; исследовать устойчивость фонового состояния системы
апоптоза (т.е. состояния этой системы в отсутствие
внешнего активирующего воздействия); исследовать влияние дефицитов прокаспаз и концентрации
ингибитора ХІАР на динамику апоптотической клеточной
смерти; исследовать динамику ограниченного протеолиза
апоптотических мишеней при активации апоптоза
гранзимом В; выяснить условия, нарушение которых ведёт к потере
злокачественной клеткой резистентности к активации
апоптоза инициаторной каспазы-8.
Научная новизна работы. С помощью проведённого исследования удалось не только подтвердить ранее полученные экспериментальные результаты, но и установить новые. К последним можно отнести следующие результаты: найдено условие, при выполнении которого обеспечивается
устойчивость фонового состояния системы апоптоза; показано, что устойчивость фонового состояния системы
апоптоза различных линий злокачественных клеток
обеспечивается с существенным запасом;
убиквитин-лигазная активность ингибитора XIAP, приводящая к необратимому ингибированию исполнительных каспаз, играет не менее важную роль в обеспечении устойчивости апоптотической системы по сравнению с осуществляемым тем же белком прямым ингибированием исполнительных каспаз, носящим обратимый характер; ингибирование протеасомы также может привести к потере устойчивости фонового состояния апоптотической системы;
Практическая значимость полученных результатов
заключается в том, что они позволяют предсказать наличие противоопухолевых свойств у широкого класса соединений, таких как ингибиторы протеасомы и ингибиторы убиквитин-лигазной активности белков семейства IAP, до проведения экспериментальных проверок. Кроме того, полученные результаты будут способствовать развитию исследований, направленных на создание нового метода лечения онкологических заболеваний, основанных на индукции апоптоза гранзимом В в малигнизированных клетках.
Положения, выносимые на защиту. Методом математического моделирования установлена высокая эффективность гранзима В в качестве индуктора апоптоза: практически полная фрагментация хроматина достигается уже при проникновении в клетку всего нескольких молекул гранзима В. Показано, что появление резистентных к индукции апоптоза гранзимом В клонов маловероятно, т.к. отсутствие любой из прокаспаз не приводит к блокированию активации апоптоза. Установлено, что устойчивость фонового состояния апоптотической системы обеспечивается, в частности, необратимым ингибированием протеазной активности каспаз 3 и б . Установлен механизм терапевтического действия таких противоопухолевых препаратов как бортезомиб, NPJ-0052, карфилзомиб, проходящих или уже прошедших клинические испытания, связанный с понижением показателя устойчивости апоптотической системы опухолевой клетки. Этот эффект обусловлен ингибированием протеасомы.
Апробация результатов исследования . Материалы
диссертации докладывались:
на научном семинаре в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН;
в отделе исследования рака, клиника Мэйо, (г. Рочестер,
штат Миннесота, США); на межлабораторном семинаре ЦТП ФХФ РАН.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, заключения, списка литературы, содержащего 141 источник, и приложения, в котором указано используемое программное обеспечение. Текст диссертации включает 23 рисунка и 8 таблиц.
Публикации. По теме диссертации опубликовано три работы.
Разрушение апоптотических мишеней
Следующим после активации прокаспаз этапом апоптоза, индуцированного гранзимом В, является разрушение исполнительными каспазами и непосредственно самим гранзимом В ряда апоптотических мишений, важнейшей из которых является ингибитор ICAD ядерной нуклеазы CAD [85,86]. В неапоптотической клетке CAD и ICAD существуют в виде стабильного неактивного комплекса DFF. Освободившаяся после протеолиза ICAD нуклеаза CAD осуществляет межнуклеосомную фрагментацию хроматина на нуклеосомные фрагменты величиной около 180 пар оснований, появление которых является широко используемым и легко детектируемым биохимическим маркёром апоптотических клеток [87].
Одновременно с ICAD гранзим В и исполнительные каспазы, действуя совместно, либо обособленно, разрушают следующие мишени: 1) белки системы репарации ДНК: а) поли (АДФ-рибоза)полимеразу-1 (ПАРП-1), б) ДНК-протеинкиназу, в) малый ядерный рибонуклеопротеиновый комплекс [71 [41,85,88-90]; 2) протеины, обеспечивающие белковый синтез и его регуляцию: а) ремодулирующую хроматин АТФазу Mi-2, б) комплекс полимиозит-склеродерма PM-Scl (ядерную экзосому), в) РНК-полимеразу I, г) протеин блокировки роста Gas-2; д) фибрилларин е) ядерный фосфопротеин La, ж) аминоацил-тРНК-синтетазы [89]; 3) протеины, обеспечивающие деление клетки: а) ДНК-топоизомеразу I, б) белки постмейотической сегрегации PMS1 и PMS2, в) белок ядерного митотического аппарата NuMA; г) ядерный протеин пролиферации Ki-61, д) центромерный протеин CENP-B [41,89]; 4) белки, выполняющие прочие функции: а) киназу фокальной адгезии FAK, а) убиквитиыирующий протеин UFD2, б) транспортный протеин гольджин-160 [48,90,91].
Разрушение внутриклеточных белков и ДНК сопровождается появлением на поверхности клетки фосфатидилсерина и, зачастую, дроблением клетки на заполненные внутриклеточным содержимым апоптотические тельца. Экспозиция фосфатидилсерина индуцирует фагоцитоз клетки, либо образовавшихся апоптотических телец макрофагами или окружающими нормальными клетками [92].
На протяжении последних десяти лет проводятся интенсивные исследования методом математического моделирования апоптоза, индуцированного лигандамисмерти [93-101]. Недостатком этих работ является то, что существенная часть параметров рассматриваемых в них математических моделей была выбрана произвольно, либо варьировалась. В работе [102], посвященной математическому моделированию апоптоза, индуцированному гранзимом В, неизвестные параметры оценивались оптимизационным методом с использованием критерия минимального потребления белков апоптотическои системой. Оценка численного значения параметров рассматриваемой здесь математической модели основана на результатах биохимических исследований системы апоптоза.
Система уравнений, описывающих динамику активации апоптоза гранзимом В, и начальные условия
В присутствие перфорина гранзим В способен проникнать как в цитоплазму, так и в ядро клетки. Время полупроникновения гранзима В в ядро существенно меньше длительности апоптоза и составляет примерно 2 мин [104]. Следовательно, с хорошим приближением можно считать внутриклеточное распределение гранзима В равномерным. Таким образом, изменение концентрации гранзима В в клетке-мишени обуславливается в основном общей деградацией протеина: где [GrB] — концентрация гранзима В, кв — константа скорости деградации гранзима В. Решением уравнения (1) является экспонента. Протеасомная деградация прокаспаз и ингибиторов каспаз в неапоптотической клетке, очевидно, уравновешивается их синтезом. В таблице 1 приведены периоды полураспада некоторых апоптотических протеинов, характеризующие время жизни белка в клетке. Как видно из таблицы 1, времена жизни постоянно присутствующих в неапоптотической клетке апоптотических протеинов, каковыми являются прокаспазы, существенно больше времён жизни протео- или нуклеолитически активных молекул, к которым относятся каспазы и CAD. Стабильность постоянно присутствующих в клетке молекул, очевидно, является следствием экономии энергетических ресурсов клетки. В самом деле, большие скорости деградации прокаспаз и ингибиторов каспаз потребовали бы пропорционального увеличения затрат на их синтез, в то время как каспазы в неапоптотической клетке не синтезируются вообще и, следовательно, могут иметь любые скорости деградации, определяемые в рассматриваемом случае лишь длительностью апоптоза. Принимая это соображение во внимание, в модели полагается, что хотя после индукции апоптоза компенсация синтеза прокаспаз и ингибиторов каспаз их протеасомной деградацией может оказаться уже неполной, сами скорости синтеза и деградации этих белков пренебрежимо малы по сравнению со скоростями других реакций апоптоза. Во многих клеточных линиях установлена пониженная экспрессия прокаспазы-10 [105-108]. Пренебрегая действием каспазы-10 по сравнению с каспазой-8, кинетику активации прокаспаз в клетках I типа (см. рис. 1) можно записать в следующем виде: где \РС±\ и [с±] — концентрации прокаспазы-i и каспазы-i, kf и к{ — кинетические константы протеолиза прокаспазы-i гранзимом В и каспазой-j, соответственно. Во всех лротеолитических реакциях пренебрегается концентрацией субстрата по сравнению с соответствующей константой Михаелиса. Например, константа Михаелиса реакции протеолиза прокасапазы-7 гранзимом В равна 55 мкМ [40], в то время как начальная концентрация прокаспазы-7 составляет 0,8 мкМ (см. табл. 2) и по мере развития апоптотического процесса снижается до нуля. Таким образом, погрешность вычисления первого члена уравнения (5) не превышает 1,5 %, что существенно меньше точности измерения констант биохимических реакций и концентраций протеинов. Другие опубликованные значения констант Михаелиса рассматриваемых протеолитических реакций больше 55 мкМ1 [109], а начальные концентрации субстратов не превышают 2 мкМ (см. табл. 2). Уравнения кинетики каспаз получаются из соответствующих уравнений кинетики прокаспаз (1-4) путём изменения знака правой части, а также добавлением членов, описывающих деградацию протеинов. Помимо этого, необходимо ввести члены, описывающие обратимое ингибирование каспаз 3 и 7 (см. рис. 1): Константа Михаелиса протеолиза каспазой-3 мишени ПАРП-1 равна 56 мкМ, а белок Gas-2 разрушается этой каспазой с где Jci — константа скорости деградации каспазы-i; k3 и &7 — константы скорости образования каспазами 3 и 7 комплексов с ингибитором XIAP; к3 и к — константы скорости распада этих комплексов; [с3-ХТАР] и [c7XJAP] — концентрации комплексов каспаз 3 и 7 с ингибитором XIAP; [XIAP] — концентрация свободного XIAP. В уравнениях (6) и (8) пренебрегается действием прочих ингибиторов семейства IAP по сравнению с XIAP вследствие пониженной экспрессии этих белков во многих клеточных линиях и тканях [63,67,110-113]. Следующие уравнения описывают кинетику свободного и связанного с каспазами XIAP: константой Михаелиса, превышающей 2 000 мкМ. И, наконец, последние три уравнения описывают протеолиз гранзимом В и каспазами ингибитора ICAD ядерной нуклеазы CADf входящего вместе с самой нуклеазой в состав неактивного комплекса DFF, высвобождение активной CAD из этого комплекса и последующую межнуклесомную фрагментацию ДНК: где [DFF] И [CAD] — концентрации комплекса DFF и ядерной нуклеазы CAD, [DNA] — удвоенная концентрация интактных нуклеосом в ядерном хроматине (подробное объяснение смысла этой переменной дано в конце абзаца), к%, к; и к]- — кинетические константы протеолиза ингибитора ICAD гранзимом В и каспазами 3 и 7, соответственно, кп — константа скорости деградации ядерной нуклеазы CAD, kfcat и Кт — каталитическая константа и константа Михаелиса фрагментации хроматина нуклеазой CAD. Во избежание недоразумений, необходимо отметить следующее. Так как нуклеаза CAD разрезает ДНК на нуклеосомные фрагменты размером около 180 пар оснований, работа нуклеазы останавливается, когда гидролизовано только 100% — = 0,56 % связей между нуклеотидами, что в 180 рассматриваемом случае должно соответствовать полностью фрагментированному хроматину ([іЖ&] = 0) . Таким образом, переменную [DNA] необходимо соотнести с числом возможных реакций гидролиза ДНК нуклеазой CAD. Из этих соображений вытекает следующее определение: под концентрацией хроматина ([DMA]) понимается удвоенное (ввиду того, что ДНК состоит из двух спиралей) количество (в молях) интактных нуклеосом в ядерном хроматине в одном литре клеточного содержимого. Уравнения (1-15) представляют систему апоптоза в клетках I типа и часть системы апоптоза в клетках II типа, т.е. не учитывают действие каспазы-9 [103]. Так как начальные концентрации апоптотических протеинов могут различаться на несколько порядков (см. 2.3), то для более наглядного представления результатов удобнее представить каждую входящую в уравнения (1-15) концентрацию в виде произведения не зависящей от времени начальной концентрации и безразмерной концентрации по следующей схеме
Условие устойчивости фонового состояния системы апоптоза
Необходимым и достаточным условием асимптотической устойчивости линейной системы дифференциальных уравнений первого порядка является отрицательность вещественной части всех корней характеристического уравнения А - ЛЕ[ = О, где Е — единичная матрица, X — корень характеристического уравнения. Характеристическое уравнение системы (17) имеет вид: необходимым и достаточным условием отрицательности частей вещественных всех корней алгебраического уравнения с вещественными коэффициентами ]Г а±Хп 1 = 0, причём условие Дл 0 эквивалентно условию ап 0. Используя критерий Рауса-Гурвица и учитывая положительность констант деградации и неотрицательность концентраций и прочих кинетических констант, получаем необходимое и достаточное условие асимптотической устойчивости системы уравнений (17) в виде: (18) В полученное условие асимптотической устойчивости входят параметры, относящиеся лишь к взаимодействию каспаз 3 и 6, а также каспазы-3 с ингибитором XIAP. Такой вид условия устойчивости (18) не является неожиданным, если учесть, что каспазы 3 и б составляют положительную обратную связь системы апоптотических протеинов: каспаза-3 активирует прокаспазу-б, а образующаяся вследствие этого каспаза-б активирует, в свою очередь, прокаспазу-3 (см- рис. 1) . Приближённо условие (18) можно выразить следующим образом: произведение скоростей взаимной активации, каспаз 3 и б, составляющих положительную обратную связь системы апоптотических протеинов, должно быть меньше произведения скоростей убыли этих протеаз за счёт деградации. Следует также отметить, что этот результат не зависит от параметров, относящихся к гранзиму В.
Он останется справедливым и в том случае, если возмущение системы апоптотических протеинов вызвано другими индукторами апоптоза. Представляется целесообразным ввести понятие показателя устойчивости, который является количественной мерой асимптотической устойчивости фонового состояния системы апоптоза: В отличие от условия (18), величина показателя устойчивости (19) говорит не только о наличии (9 0) или отсутствии (6 0) устойчивости, но и даёт информацию об имеющемся запасе устойчивости, что, как будет показано в 4.5, имеет принципиальное значение при терапии рака. В частности, речь идет о терапии рака такими лекарственными средствами, как бортезомиб (Велкейд), МРХ-0052 (салиноспорамид А) , карфилзомиб и AEG3515 6. На рисунке 2 приведена зависимость показателя устойчивости от фоновой концентрации ингибитора ХІАР. При снижении фоновой концентрации ингибитора ХІАР апоптотическая система становиться неустойчивой вплоть до значения 0 = -0,2 при [ХГАР]0 = 0. Критическим (9 = 0) является значение [Х1АР]0 = 0,7 нМ, что почти на два порядка ниже начальной концентрации ингибитора ХІАР, используемой в расчётах (см. табл. 4) . Снижение скоростей деградации каспаз сказывается на показателе устойчивости более заметным образом. На рисунке 3 приведена зависимость показателя устойчивости от скоростей деградации каспаз. Критической точке соответствует понижение скоростей деградации каспаз до 0,06 х 10_3 с-1, что составляет 15 % от величин, используемых в расчётах (см. табл. 6) . При дальнейшем понижении скоростей деградации показатель устойчивости неограниченно падает (см. рис. 3). В таблице 7 приведена оценка показателя устойчивости для клеток шестидесяти злокачественных линий, полученная по формуле (19) на основе данных измерений величин фоновых концентраций прокаспаз 3 и б, опубликованных в работе [119]1. Как и следовало ожидать, во всех рассмотренных линиях злокачественных клеток фоновое состояние системы апоптоза является устойчивым (0 0) . Данные таблицы 7 расположены в порядке возрастания 8. Можно заметить, что большая часть линий клеток, относщихся к типу почечных карцином и рака лёгкихг находится в верхней части таблицы 1, т е. для этих линий характерна низкая величина показателя устойчивости (9 1,5). Наименее стабильной из этих злокачественных линий оказалась линия рака лёгких NCI-Н226 со средним показателем устойчивости 0,6. Средний показатель устойчивости (1,5 9 2) имеют лейкемии и рак простаты. Высокий же показатель устойчивости (9 2) часто наблюдается у клеток рака молочной железы.
Влияние дефицита прокаспаз на динамику активации апоптоза гранзимом
Проникнув в клетку-мишень, гранзим В непосредственно активирует исполнительные прокаспазы 3 и 7, а также высвобождает ядерную нуклеазу CAD (см. 1.2) . Инициаторные каспазы, необходимые при активации апоптоза лигандами рецепторов смерти, играют в индуцированном гранзимом В апоптозе лишь вспомогательную роль. На рисунке 10 приведена динамика активации каспаз и фрагментации хроматина в отсутствие инициаторной прокаспазы-8. Максимальная концентрация существенно снизилась только для каспазы-3 (примерно в три раза), то время как динамика фрагментации ДНК практически не изменилась по сравнению с нормой (ср. рис. 4, б и 10) .
При дефицитах прокаспазы-3 (см. рис 11) и прокаспазы-7 (см. рис. 12) также не наблюдается заметного изменения динамики фрагментации хроматина по сравнению с нормой. Падение уровня каспаз при этом даже менее значительное,- чем при дефиците прокаспазы-8, за исключением полного отсутствия активной каспазы-б в случае дефицита прокаспазы-3 (см. рис 11) . Отсутствие каспазы-б в этом случае объясняется отсутствием её единственного активатора — каспазы-3 (см. рис. 1). Отсюда с очевидностью следует, что дефицит прокаспазы-б приводит к менее заметным последствиям, чем дефицит прокаспазы-3, эквивалентный одновременному дефициту прокаспаз 3 и б. Таким образом, появление резистентных к индукции апоптоза гранзимом В клонов маловероятно, т.к. отсутствие любой из прокаспаз не приводит к неэффективности гранзима В как индуктора апоптоза.
Попутно стоит отметить следующее. В 2.4 уже указывалось, что сведения о величинах кинетических констант активации прокаспаз 3 и 7 гранзимом В противоречивы, что бросает тень на достоверность определения остальных кинетических констант активации прокаспаз. Однако при таком отклике рассматриваемой системы на дефицит прокаспаз вариация любой из констант активации прокаспаз в пределах от 0 до 1 мкМ_1с_1 не отражается существенным образом на поведении системы, и практически, не влияет на динамику фрагментацию ДНК. В еще меньшей степени на поведении рассматриваемой системы отражаются параметры, относящиеся к обратимому ингибированию каспаз 3 и 7. Собственно, на динамике фрагментации хроматина заметным образом отражается лишь вариация констант фрагментации хроматина. Установлено, что пониженная чувствительность биохимической системы к вариации констант биохимических реакций и начальных концентраций, имеющая место и в рассматриваемой системе, является неотъемлемым свойством биохимических систем, которое часто используется для определения неизвестных параметров системы [128] .
Динамическая картина апоптоза радикально меняется при одновременном дефиците прокаспаз 3 и 7 (см. рис. 13). В этом случае остаётся прежней только динамика активации инициаторной каспазы-8, занимающей более высокую позицию в каскаде биохимических реакций апоптоза по отношению к исполнительным каспазам. Комплекс же DFF распадается теперь только на четверть, вследствие чего на порядок падает уровень активадии CAD, количество которого хватает только на фрагментацию одной трети хроматина (ср. рис. 4 и 13) . В "свете представленных на рисунке 13 данных становится понятной малая чувствительность апоптотической системы к дефицитам прокаспаз 3 и 7, взятым по отдельности: параллельная активация этих каспаз в апоптозе приводит к тому, что оставшаяся каспаза берёт на себя функции отсутствующей.
Необходимо также отметить, что в отсутствие прокаспаз 3 и 7, каспаза-8 не выполняет никаких функций в рассматриваемых здесь клетках I типа, а прокаспаза-б, как уже указывалось выше, не активируется (см. рис. 1). Приняв эти соображения во внимание, данные рисунка 13 можно интерпретировать как исключительное действие физиологической концентрации гранзима В (без участия каспаз) на динамику фрагментации ДНК. Сравнение динамических кривых рисунков 4 и 13 позволяет придти к выводу, что каспазный каскад выполняет функцию повышения эффективности гранзима В в качестве индуктора апоптоза. Помимо этого исполнительные каспазы осуществляют ограниченный протеолиз огромного числа цитоплазматических и ядерных мишеней, часть которых не является одновременно мишенями гранзима В. О мишенях апоптотических протеаз пойдёт речь в следующем параграфе.
