Введение к работе
Актуальность темы. Семи-трансмембранные (7-ТМ) рецепторы играют первостепенную роль в межклеточных коммуникациях, автокринных и паракринных регуляциях клеточных функций, а также в процессах подвижности и адгезии клеток (Wettschureck and Offermanns, 2005). В этой связи, исследование данных белков всегда было одним из основных направлений клеточной физиологии, биофизики и фармакологии. Помимо чисто академического интереса, экспериментальный и теоретический анализ 7-ТМ рецепторов имеет важное прикладное значение. Достаточно сказать, что как минимум половина известных лекарственных средств являются лигандами этих белков (Congreve and Marshall, 2010; Bosier and Hermans, 2007).
Долгое время считалось, что переход рецептора в активное состояние является прямым следствием его взаимодействия с агонистом. Тем не менее, в существующих представлениях о деталях механизма активации этих белков все еще много неясного (Kenakin, 1995; Kenakin and Onaran, 2002). В последнее время стало известно, что этим белкам свойственно выраженное динамическое поведение, благодаря их способности принимать различные конформации in vivo (Kobilka and Deupi, 2007). При этом, находясь в различных подсостояниях, рецептор осуществляет сигнализацию по разным сигнальным каскадам. В этой связи, совершенно необходимо понимание того, какие именно конформации рецептора соответствуют его истинно активному подсостоянию и каким именно путем в конформационом пространстве "движется" рецептор, для достижения этого состояния. В настоящее время для качественного описания функционального поведения мембранных рецепторов существует концепция популяционного сдвига, основанная на модели Моно, Ваймена и Шанже (МВШ) (Canals et al., 2012). Согласно этой концепции для этих белков характерно существование ансамбля структурно-близких подсостояний (конформеров), а так же их непрерывный перебор. При этом, любое внешнее воздействие приводит к стабилизации специфической конформации рецептора, повышая её статистический вес, относительно исходного апо ансамбля. Таким образом, динамическое поведение рецептора является естественным свойством его пространственной архитектуры (Henzler-Wildman and Kern, 2007). Подобное функциональное поведение, получившее название "функциональной избирательности", опосредует ряд физиологических явлений гормон-активируемых рецепторов (Kenakin, 2002, 2011). Например, определенная доля конститутивной (лиганд-независимой) активности этих белков связана с возможностью их активации в отсутствии агонистов (Milligan, 2003; Costa and Cotecchia, 2005). Экспериментально было показано, что подобное спонтанное поведение может иметь функциональное значение для одних рецепторов, и в тоже же время являться нежелательным фактором для других. Тем не менее, в настоящее время отсутствуют какие-либо представления о структурных особенностях этого явления, а так же до конца остается неясным его функциональное значение.
В настоящее время исследование мембранных рецепторов современными экспериментальными методами связано с рядом методических трудностей (Caffrey, 2003). С другой стороны, существенный прорыв в области расшифровки новых пространственных структур 7-ТМ рецепторов и значительное увеличение вычислительных мощностей, являются убедительными предпосылками для проведения вычислительных экспериментов в среде in silico. В настоящее время, использование методов молекулярного моделирования и структурной биоинформатики позволяет исследовать самые разнообразные функциональные аспекты в белках, связанные с их конформационной подвижностью. Таким образом, полученные данные могут пролить свет на ключевые аспекты динамического поведения 7-ТМ рецепторов, как в фундаментальном, так и в прикладном плане, способствуя разработке новых лекарственных препаратов.
Целью настоящей работы является исследование спонтанной активации
(конститутивной активности) родопсин-подобных рецепторов и взаимосвязи этого процесса с их конформационной подвижностью. Для выполнения поставленной цели были сформулированы и выполнены следующие задачи:
-
Провести апробацию метода главных компонент для исследования функционально значимых движений а-спиралей в белках. Исследовать конформационную подвижность двух водорастворимых белков (кальций-связывающего белка кальмодулина, а так же фермента SRC-тирозин киназы), используя их выборки кристаллографических структур.
-
Исследовать структурную подвижность фоторецептора родопсина млекопитающих, а так же трёх гормон-активируемых рецепторов (двух классов P- адренергических, а так же аденозинового А2а рецептора) методом главных компонент, используя выборки пространственных структур этих белков. Провести сравнительный анализ особенностей конформационной подвижности гормон- активируемых рецепторов, относительно контрольной выборки фоторецептора родопсина.
-
Методом молекулярной динамики исследовать структурную подвижность апо формы аденозинового А2а рецептора в окружении СС14-вода. Установить корреляцию между наиболее конформационно подвижными областями рецептора, а так же его функциональными особенностями. Методом главных компонент сравнить конформационную подвижность аденозинового рецептора, наблюдаемую на траектории МД, с характером распределения его экспериментальных структур.
-
Методами молекулярной динамики и структурной биоинформатики исследовать конформационную подвижность апо формы аденозинового рецептора в окружении липиды-вода. Установить взаимосвязь между конформационной подвижностью рецептора и его конститутивной активностью. Изучить корреляцию между крупномасштабными конформационными движениями рецептора, а так же локальной динамикой его отдельных высоко-консервативных остатков.
5. Методом молекулярной динамики исследовать влияние внешних факторов на конформационную подвижность P-2-адренорецептора. Провести сравнение проекций траекторий МД, рассчитанных для исследуемого белка в комплексе с различными лигандами (полным и обратным агонистом), а так же его апо формы.
Научная новизна. В рамках проведенного исследования, используя комплексный подход из методов структурной биоинформатики и молекулярного моделирования, впервые были получены детальные представления о конформационной подвижности родопсин- подобных рецепторов. Было установлено, что динамическое поведение этих белков является естественным свойством их пространственной архитектуры. Методом главных компонент, впервые были выделены функционально-значимые движения из траекторий молекулярной динамики, а так же выборки кристаллографических структур лиганд- активируемых рецепторов. Это позволило напрямую сравнить общую картину конформационной подвижности этих белков, наблюдаемую как на рассчитанной траектории, так и в распределениях известных экспериментальных структур. В результате впервые были установлены общие закономерности структурных движений, наблюдаемые как на траектории МД исследованных рецепторов, так и при сравнении их экспериментальных структур. Кроме того в ходе моделирования лиганд-активированных рецепторов методом молекулярной динамики впервые удалось наблюдать спонтанное движение этих белков, по направлению к их активным подсостояниям, наблюдаемым в кристалле. С другой стороны, на примере P-2-адренорецептора впервые удалось исследовать влияние различных внешних факторов на конформационную динамику этого белка. Таким образом, были подобраны параметры и режимы компьютерной симуляции, позволяющие на относительно непродолжительных траекториях исследовать функционально-значимые движения в 7-ТМ рецепторах.
Практическая значимость. В настоящее время исследования активации родопсин- подобных рецепторов обладают приоритетным значением, благодаря ключевой роли этих белков в области фармакологии. Достаточно сказать, что как минимум половина известных лекарственных препаратов являются лигандами 7-ТМ рецепторов. В этой связи, полученная информация о функционально-значимой конформационной подвижности этих белков может быть использована для разработки новых лекарств или проверки функциональных свойств уже существующих соединений. При этом, анализ конформационных движений рецепторов-мишеней по выделенным степеням свободы может быть особенно полезен, при моделировании комплексов этих белков с различными функциональными классами лигандов. Таким образом, полученные в настоящей работе результаты обладают как фундаментальным, так и прикладным значением.
Личный вклад автора состоит в обзоре имеющихся данных литературы относительно структурно-функциональных особенностей мембранных рецепторов, моделировании пространственных структур этих белков, проведении расчетов методами молекулярной динамики и структурной биоинформатики, обработке, анализе и систематизации результатов, написании статей, а так же докладов на конференциях.
Апробация работы. Результаты работы были представлены в виде устных докладов на IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012 г.), конференции молодых ученых "Экспериментальная и теоретическая биофизика 2012", а так же на 15, 16 и 17 научных конференциях молодых ученых "Биология XXI века", проводимых в г. Пущино. Работа также докладывалась на внутренних семинарах лаборатории клеточной физиологии ИБК РАН, лаборатории молекулярной динамики института математических проблем биологии, а так же на семинарах кафедры биоинженерии и биоинформатики Биологического факультета МГУ.
Научные публикации. По материалам диссертации было опубликовано 10 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ - 4, тезисов докладов и материалов конференций - 6.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа (150 страниц) состоит из введения, литературного обзора, описания используемых методов, а так же четырёх глав собственных результатов автора, выводов и списка литературы (214 ссылок). Работа иллюстрирована 57 рисунками и содержит 4 таблицы.
