Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Методы изучения ионных каналов 11
1.1. Экспериментальные методы измерения ионной проводимости каналов 14
1.1.1. Фиксация потенциала (voltage clamp) 14
1.1.2. Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp) 17
1.2. Математическое моделирование ионных каналов 23
1.2.1. Методы молекулярной динамики 25
1.2.2. Методы броуновской динамики 30
1.2.3. Уравнение Пуассона–Нернста–Планка 34
1.2.4. Методы квантовой химии 37
Глава 2. Построение модели ионной поры на мембране 47
2.1. Вне- и внутриклеточные компартменты (I, III) 48
2.2. Ионный канал в бислое (II)
2.2.1. Описание ионного канала 50
2.2.2. Учет липидного состава 57
2.3. Используемые допущения и ограничения применимости модели 61
Глава 3. Диффузионная модель 63
3.1. Создание разностной схемы 63
3.1.1. Коэффициент трения 69
3.2. Диффузия простых ионов 73
3.2.1. Диффузия при бесконечном разбавлении 73
3.2.2. Самодиффузия 76
3.2.3. Трассерная диффузия ионов 78
3.3. Диффузия ионов в синаптической щели. Влияние поверхностно го заряда мембраны 80
3.3.1. Теория двойного электрического слоя 83
3.4. Выводы 88
Глава 4. Упрощенные методы молекулярной динамики 89
4.1. Автокорреляционные функции скорости и силы 89
4.2. Диффузия сложных ионов и нейромедиаторов 92
Глава 5. Моделирование ионной проводимости каналов P2X2, P2X4 и P2X7 типа 95
5.1. Пуринергические рецепторы 95
5.1.1. Общие сведения и классификация 95
5.2. Построение модели ионной поры на мембране 98
5.2.1. Модель P2X2 рецептора 98
5.2.2. Модель P2X4 и P2X7 рецептора 105
5.2.3. Моделирование ионной проводимости каналов 107
5.2.4. Вольт-амперные характеристики P2X2 и P2X7 каналов 112
5.2.5. Избирательность P2X2 112
5.3. Выводы 114
Глава 6. Программный пакет PCS 115
6.1. Общие характеристики 115
Приложение А. Корреляция двух сумм независимых величин 121
Приложение Б. Вывод аналитического выражения для разност ных схем общего вида 122
Приложение В. Характеристики разностных схем 126
Список литературы
- Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp)
- Описание ионного канала
- Диффузия при бесконечном разбавлении
- Диффузия сложных ионов и нейромедиаторов
Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp)
Данная идея была впервые предложена Ричардом Лейчтагом (R. Leuchtag) [32, 33, 38], а позже была развита В. Быстровым [39] и постепенно превратилась в модель на основе сегнетоэлектрических жидких кристаллов [33, 39–41] для ионных каналов возбудимых биологических мембран.
С точки зрения макроскопических измерений, такие потенциал-зависимые ионные каналы, сильно различаются друг от друга по характеру упорядоченной последовательности ионов, которые они пропускают (избирательность пропускания ионов или селективная последовательность ионов), по временным константам кинетики процесса прохождения ионов, их реакции на различные фармакологические вещества (токсичность, в том числе наличие или отсутствие инактивации), спонтанный переход в «закрытое» состояние во время длительного деполяризующего импульса, и т. д. Благодаря селективности ионных каналов, они пропускают только определенные типы из присутствующих в данной водной среде ионов. Особый интерес представляют Na+, K+ и Ca2+ каналы, которые являются членами больших семейств потенциал-активируемых ионных каналов [42–47]. Здесь следует отметить, что существует также класс ионных каналов, которые активируются другими способами: например, механо-акти-вируемые каналы [48, 49], семейство лиганд-зависимых рецепторов [50], фактически являющиеся химически-активируемыми ионными каналами. Все эти ионные каналы играют ключевую роль в формировании и прохождении потенциала действия по нервному волокну (нервного импульса) в нейронах (нервных клетках), а также участвуют во всех процессах сигнализации внутри и между клетками, в процессах мышечного сокращения и других.
Исследование структуры и функций этих различных ионных каналов, а также процессов, происходящих в них, требует привлечения различных современных и во многом междисциплинарных научных дисциплин, методов и подходов. В этой связи отметим, что еще в [51] было указано на то, что, например, физика конденсированных состояний и нелинейных явлений может дать ответы на вопросы молекулярной биологии. Здесь важно создать общий язык и надежный мост между биологами, физиками и математиками. В частности, развитие нового физически мотивированного подхода, необходимо на разных уровнях – феноменологическом (макроскопическом), микроскопическом и молекулярном. На феноменологическом уровне мы имеем в виду, во-первых, измерения на площади мембраны, содержащей большое число каналов, создающий на выходе гладкий ответный сигнал. Во-вторых, применение теорий основанных на феноменологическом подходе, таких как например, теория Ландау–Гинзбурга–Девоншира [36, 37], описывающая широкий спектр нелинейных явлений при изменении (скачке) упорядочения в системе, в том числе и сегнетоэлек-трических, сегнетоактивных и родственных системах, в которых поляризация является параметром порядка системы. Именно такой подход и применил впервые Р. Лейчтаг, который развил классическую электродиффузионную модель с постоянным значением диэлектрической проницаемости, введя в нее нелинейную зависимостью величины диэлектрической проницаемости от электрического поля [52, 53], что приводит в итоге к ее характерному изменению по закону Кюри–Вейсса в окрестности точки фазового перехода. Это и привело к созданию сегнетоэлектрической модели ионного канала [32, 33, 38, 53], а также модели кинка для прохождения возбуждения (нервного импульса) вдоль нервного волокна [54, 55].
Микроскопический уровень имеет дело, как правило, с измерениями малого числа каналов, так что открытие и закрытие индивидуального канала может быть зарегистрировано методами классической техники patch-clamp (подробнее об этом в разделе «Фиксация потенциала»). Во-вторых, сейчас развиваются современные подходы, основанные на методах и технике атомно-силовой и пьезо-силовой микроскопии [56–60], которые могут позволить зафиксировать смещение мембраны и отдельных компонент макромолекулы ионного канала
При этом на молекулярном уровне мы имеем дело с событиями, происходящими на отдельной молекуле: конформационные изменения, формирование и разрыв связей, движение ионов от сайта к сайту, межмолекулярные силы и поля. Важно, что все эти характеристики и их параметры в настоящее время возможно исследовать с применением современных методов компьютерного моделирования: ab initio методы квантовой химии [61, 62], методы комбинированной молекулярной динамики, основанной на разумном сочетании классической и квантовой механики [63–74]. Отметим, что исследования подобных систем, состоящих из огромного числа атомов и электронов, стали возможными только в последнее время благодаря развитию компьютерных технологий и созданию специальных вычислительных кластеров, систем на графических процессорах и суперкомпьютеров.
Таким образом, данный обзор призван ознакомить читателя с актуальными на сегодняшний день методами изучения ионных каналов и оценить перспективные направления дальнейших исследований для решения насущных фундаментальных и прикладных проблем в различных областях биологии и медицины.
Описание ионного канала
На протяжении развития химии было создано множество концепций эмпирических параметров: валентность, кратность связи, электроотрицательность, энергия ионизации, родство к электрону, химическая активность. С появлением квантовой механики они стали находить свое уточнение и переформулировку в виде тех или иных особенностей решения уравнения Шредингера. Попутно разрабатывались упрощенные подходы для понимания происходящего в атомах и молекулах на квантовом уровне: понятие атомной орбитали, гибридизация, связывающие и разрыхляющие молекулярные орбитали.
Теоретически, с написанием уравнения Шредингера в химии практически не осталось явлений, которые бы не могли бы быть объяснены его решением. Однако вычислительная сложность его аналитического решения слишком высока. Методы же численного решения уравнения совершенствовались, но на сегодняшний день точное аналитическое решение возможно лишь для самых простых систем. Однако применение определенных упрощений приводит к удовлетворительному описанию систем с большим числом атомов, вплоть до белковых систем. Речь идет о теории функционала плотности [209] (DFT), в которой преодолевается избыточность волновой функции, зависящей от координат всех электронов, и вводится понятие электронной плотности – скалярного поля, которое варьируется для минимизации энергии модельной системы, в том числе и вместе с координатами ядер для получения энергетически выгодной геометрии и электронной плотности. В разных вариантах DFT является одним из наиболее широко используемых методов вычислительной квантовой химии и применяется как для расчета отдельных молекул, так и для периодических систем в физике конденсированного состояния.
Аналогично методам Хартри–Фока, в DFТ проводится антисимметризация волновой функции, однако в силу особого учета кинетической энергии трактовка полученных собственных значений, аналогичных энергиям и орбиталям Хартри, немного отличается.
Несмотря на успехи, имеются проблемы при описании межмолекулярных сил, а также трудности при расчете запрещенной зоны в полупроводниках. Важным фактом является и то, что на сегодняшний день невозможно оценить даже погрешность методов, не сравнивая полученные значения с результатами других экспериментов. Согласие с экспериментом критично для всех теорий, но тут речь именно об отсутствии возможности оценить априорную ошибку. Отдельной слабостью теории является поиск переходных состояний, в силу того, что теоретические допущения работают вблизи основного состояния, а переходное является седловой точкой между локальными минимумами.
В целом, с момента создания в 1970-х, теория, первоначально считавшаяся довольно неточной, к 1990-м достигла успеха в решении проблем с обменной и корреляционной энергией. Одним из корней проблем, несмотря на абсолютную теоретическую точность обменно-корреляционного функционала, является его заведомая сложность и чудовищная неаналитичность, ставящая под вопрос все текущие его аналитические параметризации с множеством поправок.
В рамках теории конденсированного состояния DFT применяется успешно в локальном приближении, в базисе плоских волн. Делокализованные электроны обеспечивают применимость такого подхода. Множество программ работает в базисе плоских волн, включая коммерческий CASTEP, открытые ABINIT, Quantum ESPRESSO, а также пакеты с академической лицензией CPMD [210].
Для непериодических систем и органических молекул применяются базисы атомных орбиталей, как численные, так и аналитические гауссовы. Реализованы в пакетах PC GAMESS, GAUSSIAN, SIESTA [211], HyperChem [212] и многих других. Для описания возбужденных состояний разрабатывается временно-зависимая теория функционала плотности, TDDFT, реализованная в программе OCTOPUS [213].
Приближение неподвижных ядер (приближение Борна-Оппенгеймера) является отправной точкой. Его обоснованием служит разница масс электрона и нуклона, которая позволяет считать, что электронное облако, обладая намного меньшей инерцией, успевает подстраиваться под движение ядер. Точность такого приближения составляет порядка 1%.
Концептуальный предшественник DFT - модель Томаса-Ферми, рассчитавших в приближении Борна-Оппенгеймера энергию атома как сумму его кинетической и потенциальных энергий взаимодействия электронов с ядром и друг с другом, впервые используя выражение для энергии в виде функционала электронной плотности:
Тут речь идет о невырожденных состояниях, что является почти всегда уместным, так как вырождение можно снять сколь угодно малой добавкой ассимет-рии.
Оператор Н содержит три слагаемых: Т - оператор кинетической энергии, Vext - оператор потенциальной энергии набора частиц во внешнем потенциале, и U - оператор взаимодействия электронов друг с другом. Именно из-за того, что в U переменные разных частиц не разделены, систему нельзя свести к одночастичным уравнениям.
Первая теорема Хоэнберга-Кона гласит, что внешний потенциал, определенный с точностью до константы, Vext, является функционалом электронной плотности основного состояния. Вывод часто формулируется как: энергия основного состояния является функционалом электронной плотности основного состояния. Однако ясно, что вывод следует гораздо шире. Внешний потенциал определяет гамильтониан целиком, со всеми возбужденными состояниями. Поэтому на самом деле энергетический спектр целиком является функционалом электронной плотности основного состояния, а не только энергия основного состояния.
Диффузия при бесконечном разбавлении
В свою очередь, оценка величины потоков через соответствующие ионные каналы позволяет говорить о внесении дополнительной неоднородной плотности распределения при удалении от мембраны [276]. Все перечисленные моменты приводят к значительному изменению как микровязкости и диэлектрической проницаемости, так и коэффициентов диффузии в примембранной области (более 20%), что необходимо учитывать при использовании макроскопических диффузионных приближений для оценки систем такого типа. Однако говорить о величине корреляции флуктуаций коэффициентов диффузии и си-наптической проводимости, в данной диффузионной модели, без рассмотрения непосредственных механизмов ионной проводимости при генерации ТПСП и ВПСП не представляется возможным.
Установлено, что значение среднего квадрата скорости и перемещения броуновской частицы для разностных схем Эйлера и Хейна зависит от размера шага, что приводит к отклонениям от температуры термостата и изменению коэффициента диффузии. Область применимости существующих на данный момент основных разностных схем численного интегрирования уравнения Ланжевена лежит в диапазоне 1.
Показано, что для концентраций электролита в растворе 0.5 М/л в классической модели Ланжевена необходимо учитывать изменения диэлектрической проницаемости и вязкости раствора.
Установлено, что при размере частиц радиусом 1.5 A необходимо вводить поправки к закону Стокса на диэлектричекое трение.
Предложена новая разностная схема численного интегрирования уравнения Ланжевена в пространстве координат и скоростей с учетом скоррели-рованности стохастических приращений на каждом итерационном шаге, не имеющая ограничений на шаг интегрирования, с асимптотическими значениями среднего квадрата скорости и перемещения, соответствующими точному решению.
Использование методов броуновской динамики для задач биологического моделирования параметризуется выбором усредненного действия растворителя на частицу В классической модели Ланжевена (1.13) таким параметром раствора является коэффициент трения , вид которого зависит от используемого приближения. Так, для непрерывной вязкой жидкости и больших размеров частиц используется приближение Стокса, учет диэлектрической природы растворителя дает теория Адельмана, Онзагера [245], в газах при малых числах Кнудсена следует вводить поправки Каннингема [277], и т.д.
Однако если в случае простых частиц (таких, как ионы Na+, К+, С1 ) подобные приближения могут дать приемлемый результат, то в случае многоатомных молекул (NH+, SO ) ситуация заметно усложняется. Это связано с неоднозначностью выбора аппроксимирующей геометрии, распределения заряда для данных теорий. Поэтому единственной возможностью определить коэффициент диффузии D и трения ( таких сложных частиц—это использование прямого МД моделирования. Далее рассмотрим методы, используемые в данной работе.
В отличие от упрощенного уравнения Ланжевена (1.13), здесь введена функция памяти к(т), что позволяет обойти [174] существующее ограничение уравнения (1.13): в любой момент времени жидкость должна мгновенно восстанавливать свое равновесное состояние, соответствующее данной скорости — отсутствует эффект памяти прежней динамики частицы, что существенно для малых t. В стационарном состоянии, достигаемом при t — оо, учитывая свойства стохастической силы, можно записать: Fe = (V) / к(т) іт o
Рассмотренные методы расширяют применимость броуновской динамики на молекулы произвольной сложности, устраняя существующие недостатки приближенных теорий, связанные с геометрической аппроксимацией и сложностью расчета коэффициентов трения.
Для описания диффузии частиц со сложной геометрией были использованы прямые расчеты методами упрощенной молекулярной динамики, описанными ранее (см. Главу 2). Моделирование проводилось при нормальных условиях. На одну исследуемую частицу приходилось 512 молекул воды, что соответствовало плотности в 0.998 г/см3. Один эксперимент состоял из 100 повторностей, шаг моделирования At = 0.1 фс, число шагов п = 1000. Электростатические параметры моделируемых частиц вычислялись на основе метода DFT, конкретные параметры расчетов были аналогичны вычислениям, проведенным ранее для молекул фосфолипидов в модели растворителя COSMO (См. 2.2.2) .
В ходе эксперимента снимались автокорреляционные функции скорости (VACF) (Рис. 4.2) и силы (FACF). Коэффициенты диффузии D и трения ( броуновской частицы определялись на основе подходов, подробно изложенных выше.
Диффузия сложных ионов и нейромедиаторов
Поскольку для P2X7 конфигурация селективного фильтра получена моделированием по гомологии, то вопрос о его пространственной организации остается открытым, в связи с чем были рассмотрены все 7 различных конфигураций фильтра, образованного остатками Ser339, Ser342 и Asp352. Анализ аминокислотной последовательности ТМ2 P2X2 рецептора выявил возможное участие остатков Thr339, Ser345 и Asp349 в формировании 7 различных конфигураций. Для P2X4 было рассмотрено 2 конфигурации - в присутствии и отсутствии Asp357.
Трансмембранный домен P2X7 рецептора в открытом состоянии (вид из внутриклеточной части). Структура разрешена [301] использованием алгоритма Phyre2. Полярные Ser339, Ser342 и заряженный Asp352 формируют область селективного фильтра канала.
Учитывая, что «patch clamp» измерения проводились на реальных биологических тканях, состав фосфолипидного бислоя, используемый в моделировании соответствовал фосфолипидному составу тела нейрона крысы: PC 28 %, PE 20%, SPH 4%, PI 6% и PS 4 %, что соответствует поверхностной плотности заряда на внутренней стороне мембраны и 40 мКл/м2.
Состав компартментов I и III соответствовал «patch clamp» протоколам измерений одиночных каналов данного типа. Для P2X4: [NaCl]j = 147, [NaCl]jjj = 5, [NaF]jjj = 140 (мМ/л), внешний потенциал —150 мВ. P2X2: [NaCl]j = 145, [NaF]jjj = 5, внешний потенциал —100 мВ. P2X7: [CSCQHUOJ]J = 150, [CSCQHUOJ]JJJ = 150, внешний потенциал —110 мВ. Параметры моделирования системы были: размер ячейки 300A, температура 298 K, шаг броуновской динамики tBD = 0.1 нс, шаг молекулярной динамики tMD = 1 пс, время моделирования 1 мкс.
Зная число ионов, прошедших через ионный канал за время моделирования системы, легко определить величины проводимости G и амплитуды тока /. Для чистоты модельного эксперимента концентрации растворенных веществ в компартментах I и III были фиксированы: после прохождения через канал ион заново помещался в свой стартовый компартмент со случайными координатами. В Таблице 5.4 представлены результаты численного моделирования проводимости ионных каналов P2X2, P2X4 и P2X7 типа при различных конфигурациях селективных фильтров. Как видно, конфигурация P2X4 канала, при которой ни один заряженный или полярный аминокислотный остаток не повернут в область ионной поры («без фильтра», БФ) наилучшим образом (9.0 пСм) согласуется с экспериментальными данными («patch clamp» измерениями и PDB структурой), тогда как наличие остатка аспарагиновой кислоты Asp357 увеличивает величину проводимости канала почти в два раза (16.3 пСм). Согласно структуре P2X7 канала, предсказанной моделированием по гомологии, селективный фильтр формируют только два остатка серина Serззэ и Ser342, обращенных в область ионной поры. Однако, величина проводимости для данной конфигурации (14.3 пСм), полученным на основе нашей модели, будет значительно отличаться от экспериментальных данных (8.3 пСм), тогда как конфигурация
БФ находится в согласии с данными. Отсюда мы делаем вывод о возможном отличии реальной пространственной организации P2X7 канала от предсказанной поворотом ТМ2 домена на угол в 15-25 по часовой стрелки, во избежание наличия остатков данных аминокислот в области ионной поры. Моделирование P2X2 рецептора позволило объяснить его высокий уровень проводимости (32 пСм) наличием остатка аспарагиновой кислоты Asp349 в области ионной поры.
Поскольку атомистическая структура P2X2 и P2X7 рецепторов на настоящий момент отсутствует, для проверки нашей гипотезы были использованы их вольт-амперные характеристики. Моделирование проводилось с шагом внешнего потенциала в 20 мВ в диапазоне -20-120 мВ для P2X7 и -20-100 мВ для P2X2 канала при различных конфигурациях селективных фильтров. Параметры моделирования не менялись. Как видно (Рис. 5.12) наилучшим образом экспериментальные зависимости описывают состояния «без фильтра» для P2X7 и Asp349 для P2X2, что согласуется с нашими предположениями.
Исследование избирательности (селективности) канала к отдельным ионам позволяет охарактеризовать его механизм проводимости. Для этих целей мы провели моделирование P2X2 с Asp349 конфигурацией селективного фильтра при внешнем потенциале в -120 мВ для случая различных электролитов одинаковой концентрации (120 мМ/л) в I и III компартментах: KCl, NaCl, LiCl, RbCl и CsCl. Полученные величины ионных токов и проводимости представлены в Таблице 5.5.
Как видно, величины проводимости данных ионов возрастают согласно коэффициентам их свободной диффузии: + + + + + [12]. Это свидетельствует о том, что ярко выраженной селективности к катионам у данного канала нет, а отношение уровней проводимости для отдельных катио 113
