Введение к работе
Актуальность темы.
Основная задача системы свертывания крови - предотвратить кровопотерю при нарушении целостности сосудистого русла, «залепив» место повреждения плотным гемостатическим сгустком. Это достигается за счет локального перехода плазмы крови из жидкого в гелеобразное состояние в районе места повреждения. Любое повреждение сосудистого русла приводит к тому, что кровь вступает в контакт со специальным трансмембранным белком - тканевым фактором и запускает систему ферментативных реакций свертывания, приводящую к формированию непроницаемого для жидкости гемостатического сгустка. Система реакций свертывания состоит из нескольких десятков белков, взаимодействующих друг с другом во множестве реакций. Такое устройство системы необходимо для эффективного управления процессом образования фибринового сгустка. В норме сгусток фиксированного размера формируется только в месте повреждения, и свертывание крови не затрагивает другие области кровотока. Теоретические работы по модульной декомпозиции данной системы позволяют выделить три основные фазы процесса свертывания: фазу активации, фазу пространственного роста и фазу торможения роста сгустка. При этом в каждой фазе существенную роль играют разные биохимические реакции, а сами фазы выделены как во времени, сменяя друг друга, так и в пространстве, происходя в разных частях сгустка. Представления о фазах процесса свертывания и роли различных белков и реакций в каждой из фаз сформировались в основном в результате работ по математическому моделированию данной системы и лишь частично подтверждены экспериментально. Эффективным методом экспериментальной проверки гипотезы о многофазности процесса свертывания, который позволил бы получить количественные характеристики этих фаз, может служить метод исследования пространственной динамики свертывания in-vitro. Сущность метода заключается в локальной активации свертывания и регистрации светорассеяния от растущего фибринового сгустка в тонком слое неперемешиваемой плазмы крови. Однако качественной технической реализации данного экспериментального метода до сих пор предложено не было. Созданные ранее экспериментальные системы имели ряд существенных недостатков, приводящих к большим погрешностям при измерении параметров пространственной динамики свертывания. А использование культуры клеток (фибробластов) в качестве активатора свертывания делало метод трудоемким и снижало воспроизводимость результатов измерения.
Задача дифференцировки и количественной оценки фаз процесса свертывания становится особенно актуальной в свете представлений о том, что различные патологии по-разному влияют на активность отдельных компонент системы свертывания, приводя к выраженным изменениям в различных фазах процесса. Нарушения в механизмах свертывания клинически проявляются либо кровотечением, либо тромбозом, либо одновременно обоими этими явлениями и являются одной из ведущих причин смертности в мире. Во многом это обусловлено тем, что существующие методы диагностики нарушений свертывания далеки от совершенства. В основе большинства из них лежит принцип определения времени полного свертывания образца крови или плазмы при добавлении вещества-активатора и его полном перемешивании в пробирке. Однако в организме сгусток пространственно образуется не во всем объеме крови, а строго локально - только в небольшой зоне повреждения стенки кровеносного сосуда. При этом диффузия факторов свертывания играет важную роль в процессе пространственного роста сгустка и его локализации. Основным недостатком существующих методов является то, что они плохо отражают реальное состояние гемостаза in-vivo и мало чувствительны к гиперкоагуляционным состояниям системы свертывания. Эти методы не позволяют учесть пространственную неоднородность процесса свертывания: разделить фазы инициации, пространственного роста и остановки роста сгустка и тем более провести их количественную оценку.
Цель работы:
Экспериментальное исследование пространственной динамики роста фибринового сгустка in-vitro в условиях, близких к условиям свертывания крови in-vivo, и создание измерительного прибора для количественной оценки основных фаз процесса свертывания крови в норме и патологии.
Задачи исследования:
Разработать и создать измерительный прибор, способный регистрировать и количественно оценивать пространственную динамику свертывания плазмы крови in-vitro.
Проверить теоретические представления о существовании фазы активации и фазы пространственного роста фибринового сгустка.
Определить границы основных количественных характеристик фаз пространственного роста фибринового сгустка у здоровых лиц и показать чувствительность прибора к гипо- и гиперкоагуляционным состояниям в случае различных нарушений в системе гемостаза.
Научная новизна.
Разработан и создан новый измерительный прибор, позволяющий исследовать пространственную динамику роста фибринового сгустка в плазме крови in-vitro. Получено экспериментальное подтверждение существования основных фаз процесса свертывания и предложены способы их численной оценки. Показана высокая чувствительность прибора как к гипо-, так и гиперкоагуляционным состояниям, возникающим при различных патологиях (гемофилии, сепсис, онкологические заболевания). Показана возможность измерения прибором не только пространственных особенностей формирования конечного продукта работы системы свертывания - фибринового сгустка, но и возможность одновременного исследования кинетики образования главного фермента этой системы - тромбина, а также измерения эндогенного тромбинового потенциала - основного параметра, вычисляемого в тесте генерации тромбина.
Научно-практическое значение.
Разработанный прибор позволяет регистрировать нарушения в плазменной системе гемостаза, недоступные для существующих ныне подходов, и служит важным дополнением к существующим методам диагностики. Возможность in-vitro измерять все пространственно-динамические параметры образования фибринового сгустка в плазме конкретного человека - плотность сгустка, скорость его роста и др. - предоставило в руки врача инструмент огромной предсказательной силы. Использование данных приборов в клинической практике позволит коренным образом улучшить качество диагностики нарушений гемостаза и снизить смертность и инвалидность среди населения. Кроме того, прибор позволяет in-vitro изучать влияние лекарственных препаратов на систему свертывания в условиях, близких к физиологическим условиям, предоставляя важную информацию о механизмах их действия. Применение флуорогенных субстратов позволяет получать детальную информацию о пространственной кинетике отдельных факторов свертывания в процессе роста фибринового сгустка и тем самым верифицировать математические реакционно-диффузные модели процесса свертывания.
Положения, выносимые на защиту:
1. Проведено экспериментальное исследование пространственной динамики свертывания плазмы крови in-vitro в условиях, близких к условиям свертывания крови in-vivo. Подтверждена гипотеза о существовании фазы активации и фазы пространственного роста фибринового сгустка. Получены количественные характеристики фаз.
Сформулированы технические требования к прибору, позволяющему проводить диагностику нарушений свертывания при различных патологиях. Созданы опытные образцы приборов.
Показана высокая информативность результатов измерения параметров пространственной динамики свертывания при различных патологиях гемостаза и чувствительность прибора как к гипо-, так и к гиперкоагуляционным состояниям.
Прибор позволяет исследовать пространственную кинетику образования тромбина в процессе роста фибринового сгустка, а также измерять эндогенный тромбиновый потенциал исследуемого образца плазмы.
Апробация работы состоялась 09 ноября 2009 г. на заседании проблемной комиссии № 6 "Биохимия, биофизика и реология крови" в Гематологическом Научном Центре РАМН.
Материалы диссертации докладывались на 4th International Symposium on Computation Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Method Resources (Москва, сентябрь 2007), на международной конференции Modeling of Blood Diseases (Lyon, Франция, ноябрь 2007), на 1-м Международном Форуме по Нанотехнологиям (Москва, Декабрь 2008), на 53rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research (Wien, Австрия, февраль 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 тезисов в сборниках трудов 7 конференций и 1 статья. Подано 2 патентных заявки на изобретения РФ. Получено положительное заключение о выдаче патентов от 02.11.2009 и 03.12.2009.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов исследования, главы 3 — описания результатов исследования и главы 4 — обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 148 источников. Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (заведующий лабораторией - доктор биологических наук, профессор Атауллаханов Ф.И.).
