Введение к работе
Актуальность проблемы. Нарушения в системе свёртывания крови являются причиной более чем трети смертей при различных патологических состояниях: сердечнососудистых заболеваниях, травмах различной природы и хирургических операциях, сепсисе, ожогах, онкологических заболеваниях, заболеваниях, связанных с патологией гемостаза, и т.п. Возникающие при этом гиперкоагуляционные состояния способны приводить к тромбозам - патологическому свёртыванию крови различной локализации. Изменения, происходящие при функционировании стенок сосудов и в системе свёртывания крови и приводящие к тромбозам, не до конца изучены, однако понимание этих процессов необходимо для разработки и усовершенствования антитромботических средств.
В качестве основных направлений воздействия на систему гемостаза для предупреждения и лечения тромбозов можно выделить: применение ингибиторов сериновых протеиназ системы свёртывания; применение антагонистов витамина К, снижающих синтез печенью предшественников прокоагулянтных факторов системы свертывания; применение антитромбоцитарных препаратов, снижающих активацию и агрегацию тромбоцитов и препятствующих дальнейшему тромбообразованию; применение фибринолитических агентов.
В настоящее время в клинике используются, в основном, три антитромботических препарата: нефракционированный гепарин или его аналоги низкого молекулярного веса, оральный антикоагулянт варфарин (антагонист витамина К) и ингибитор активации тромбоцитов - аспирин. Эти лекарства имеют ограничения в применении и побочные эффекты, что лимитирует их использование и побуждает к поиску и разработке новых препаратов, не менее эффективных, но свободных от недостатков стандартных средств. Современные представления о гемостазе и тромбозе и опыт использования антитромботических средств (антикоагулянтов, тромболитических и антитромбоцитарных агентов) говорят о том, что перспективной является разработка синтетических низкомолекулярных прямых ингибиторов тромбина, так как именно этот фермент является ключевым в системе свёртывания крови, а его повышенная активность способна приводить к тромбозам. Синтетические низкомолекулярные ингибиторы тромбина имеют целый ряд преимуществ перед антикоагулянтами, используемыми в клинике в настоящее время: это быстрота наступления действия, высокая эффективность, предсказуемая фармакокинетика, отсутствие необходимости постоянного мониторинга состояния гемостаза. На сегодняшний день в мире клинически используются только два таких ингибитора - вводимый внутривенно аргатробан и пероральный антикоагулянт
(пролекарство) дабигатран этексилат. Ни один из них не лицензирован в России. Однако эти препараты также имеют ряд недостатков: аргатробан обладает низкой стабильностью и коротким временем жизни в плазме, что требует его частых инфузий для поддержания терапевтических концентраций; дабигатран этексилат может быть использован перорально, однако пока только для ограниченного числа патологий, кроме того, он имеет низкий процент биодоступности. Таким образом, поиск новых, эффективных и безопасных низкомолекулярных синтетических ингибиторов тромбина является весьма актуальной задачей современной фундаментальной науки и клинической медицины.
Цель работы. Ранее, в результате совместной работы нескольких институтов и лабораторий (ЦТПФХФ РАН, Лаборатории физической биохимии ФГБУ Гематологический научный центр МЗСР РФ, Научно-исследовательского вычислительного центра МГУ им. М. В. Ломоносова, Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН), был осуществлен компьютерный дизайн и синтез нового ряда синтетических низкомолекулярных ингибиторов тромбина. Цель настоящей работы состояла в исследовании функциональных свойств одного из новых ингибиторов (HC-019s-IOC), его способности оказывать антикоагуляционное действие как in vitro, так и in vivo.
Для достижения цели решались следующие задачи:
Определить тип механизма ингибирования и параметры ингибирования тромбина под действием исследуемого соединения в чистой буферной системе (по влиянию на скорость гидролиза хромогенного субстрата).
Определить параметры антикоагулянтного действия данного соединения в плазме in vitro (в стандартных временах свертывания, а также в тестах генерации тромбина и тромбодинамики).
Оценить стабильность растворов исследуемого соединения при стерилизации автоклавированием и последующем длительном хранении.
Определить острую токсичность HC-019s-IOC (при внутрибрюшинном введении на мышах).
Исследовать антикоагулянтные свойства ингибитора в опытах in vivo при внутривенном введении кроликам и в модели гемодилюции при кровопотере у крыс.
Научная новизна. В работе впервые подробно экспериментально исследованы свойства нового низкомолекулярного синтетического прямого ингибитора тромбина HC-019s-IOC. Доказан конкурентный тип ингибирования и определена константа
ингибирования тромбина в чистой системе. Показано, что данное соединение может являться эффективным антикоагулянтом в плазме как in vitro, так и в опытах in vivo.
Впервые разработана модель для изучения изменений свертывания при умеренной гемодилюции в ходе восполнения кровопотери (на крысах). С помощью этой модели показано, что умеренная гемодилюция in vivo физиологическим раствором вызывает состояние гиперкоагуляции, которое может быть успешно преодолено путем добавления в стандартный плазмозамещающий раствор ингибитора тромбина.
Все полученные результаты показывают, что исследованный новый ингибитор тромбина является перспективным для клинического применения, т.к. он более эффективен и стабилен, а также не более токсичен, чем применяемый в клинике аргатробан.
Научно-практическое значение. Научное значение данной работы состоит в разработке методики испытаний препаратов с целью исследования их возможного антитромботического действия. Кроме того, впервые показано, что умеренная гемодилюция in vivo стандартным плазмозамещающим раствором (ПЗР) может являться риск-фактором для развития гиперкоагуляции, и что этого можно избежать, добавляя в стандартные ПЗР ингибитор тромбина.
Практическое значение работы состоит в разработке отечественного препарата для лечения тромботических осложнений на основе нового ингибитора тромбина НС-019s-IOC. Доклинические испытания показали, что данный ингибитор является перспективным для клинического применения и превосходит по своим параметрам применяемый в мировой практике аргатробан.
Положения, выносимые на защиту:
Исследуемое вещество - HC-019s-IOC - является высокоэффективным конкурентным ингибитором тромбина в буферной системе и практически не ингибирует фактор Ха.
HC-019s-IOC является эффективным антикоагулянтом в плазме in vitro: он удлиняет стандартные времена свертывания, снижает эндогенный тромбиновый потенциал и скорость пространственного роста сгустка пропорционально концентрации добавленного в плазму ингибитора.
Новый ингибитор имеет приемлемую острую токсичность.
Водные растворы ингибитора (в микромолярных концентрациях) способны переносить стерилизацию автоклавированием и оставаться стабильными при длительных временах хранения как при +4С, так и при комнатной температуре.
Внутривенное введение HC-019s-IOC кроликам оказывает антикоагулянтное действие (снижает эндогенный тромбиновый потенциал плазмы).
Восполнение умеренной (23%) кровопотери физиологическим раствором приводит к гиперкоагуляции у крыс; восполнение кровопотери физиологическим раствором, дополнительно содержащим HC-019s-IOC, отменяет возникновение этой гиперкоагуляции.
Апробация работы состоялась 28.03.2011 г. на совместном заседании проблемной комиссии № 2 «Биохимия, биофизика и реология крови» ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития России и Ученого Совета ЦТПФХФ РАН.
Материалы диссертации были представлены на ряде российских и международных научных конференций: 54rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research, Ntirnberg, February 24-27, 2010; XXXIII World Congress of the International Society of Hematology, Jerusalem, Israel, October 10-13, 2010; а также на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине" в 2009 и 2010 гг.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах и 5 тезисов в сборниках трудов отечественных и международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из следующих основных разделов: введение; литературный обзор; материалы и методы; результаты; обсуждение; выводы и список цитированной литературы. Материал иллюстрирован 1 таблицей и 22 рисунками. Список литературы включает 202 источника.
Похожие диссертации на Новый синтетический низкомолекулярный ингибитор тромбина HC-019s-IOC. Исследование свойств in vitro и in vivo
