Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Молекулярная биофизика и ДНК-нанотехнология 11
1.2. Нанотехнология и конструирование новых фармацевтических препаратов для адресной доставки лекарств 21
1.3. Воздействие магнитного поля на живые организмы и его применение в медицине 28
1.4. Макрофаги как носители в адресной доставке фармацевтических препаратов 33
1.5. Действие ионизирующей радиации на злокачественную опухоль 36
1.6. Нейтрон-захватывающая терапия и ее применение в медицине 42
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
2.1. Объекты исследования 52
2.2. Методы исследования 53
2.2.1. Изучение ДНК и ее фрагментов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле 53
2.2.2. Образование ХЖКД двуцепочечной ДНК по методу Ю.М. Евдокимова 55
2.2.3. Метод атомно-силовой микроскопии 55
2.2.4. Рентгенографический анализ ХЖКД [ДНК-Gd] 57
2.2.5. Нейтронно-активационный анализ образцов ХЖКД [ДНК-Gd] 58
2.2.6. Измерение магнитных свойств гадолиния в составе комплексов ХЖКД [ДНК-Gd] 59
2.2.7. Атомно-эмиссионный анализ ХЖКД комплексов [ДНК-Gd] 60
2.2.8. Метод оптического кругового дихроизма 61
2.2.9. Методика выделения макрофагов 63
2.2.10. Исследование макрофагов с помощью флуоресцентной наноскопии 63
2.2.11. Радикальная полимеризация метакрилатного гидрогеля 67
2.2.12. Статистическая обработка результатов экспериментов 67
Глава 3. Результаты и обсуждение 68
3.1. Формирование комплексов ХЖКД двуцепочечной ДНК 68
3.2. Формирование комплекса ХЖКД с гадолинием 73
3.3. Исследование взаимодействия двухцепочечной линейной ДНК с ионами Gd3+ 75
3.4. Визуализация наночастиц ХЖКД комплексов [ДНК-Gd] 81
3.5. Рентгенографические спектры фаз ХЖКД комплекса [ДНК-Gd] 88
3.6. Определение концентрации гадолиния в ХЖКД комплекса [ДНК- Gd] с помощью магнитометрического метода 92
3.7. Определение концентрации гадолиния в ХЖКД [ДНК-Gd] методом нейтрон-активационного анализа 98
3.8. Определение стабильности наночастиц ХЖКД [ДНК-Gd] 103
3.9. Оценка цитотоксичности наночастиц ХЖКД [ДНК-Gd] 105
3.10. Моделирование диффузии магнитных наночастиц ХЖКД [ДНК-Gd] в капиллярах опухоли 106
3.11. Иммобилизация наночастиц на мембранах макрофагов 110
3.12. Моделирование НЗТ с помощью наночастиц, иммобилизованных на макрофагах 113
3.13. Разработка методики стандартизации и контроля качества комплекса ХЖКД [ДНК-Gd] с помощью оптических методов 116
3.14. Разработка способа получения наночастиц на основе ДНК и гадолиния 118
3.15. Методика определения пространственной упаковки комплекса ХЖКД [ДНК-Gd] методом КД 120
Заключение 122
Выводы 124
Список литературы 126
- Молекулярная биофизика и ДНК-нанотехнология
- Нейтрон-захватывающая терапия и ее применение в медицине
- Исследование взаимодействия двухцепочечной линейной ДНК с ионами Gd3+
- Методика определения пространственной упаковки комплекса ХЖКД [ДНК-Gd] методом КД
Введение к работе
Актуальность проблемы. Важнейшей задачей молекулярной биофизики и фармации является поиск новых эффективных лекарственных препаратов комбинированного действия, содержащих в своем составе фрагменты с различными видами терапевтической и биологической активности. В настоящее время особую значимость приобретают исследования молекулярных механизмов адресной доставки лекарств, позволяющих добиться повышения эффективности лечения с использованием уже существующих средств в клинической терапии. Одним из наиболее используемых методов лечения опухоли является лучевая терапия, вызывающая дегенерацию опухолевой ткани или подавление роста злокачественных клеток. Однако применение ионизирующих излучений может привести к негативным побочным воздействиям на здоровые ткани и системы органов человека в виде локальных и отдаленных последствий. Есть основания полагать, что применение нейтрон-захватывающей терапии (НЗТ) позволит решить многие проблемы клинической радиотерапии и повысит процент выживаемости онкологических больных.
Гадолиний-157 обладает высоким градиентом накопления вещества в опухоли и максимальным сечением захвата тепловых нейтронов — 255 000 барн. Но непосредственное применение гадолинийсодержащих фармацевтических препаратов в НЗТ затруднено из-за высокой токсичности ионов гадолиния и значительности воздействия вторичного у-излучения на здоровые ткани, окружающие опухоль.
Идеи применения магнитных наночастиц для повышения клинической эффективности лекарств основаны на том, что вещества, созданные с помощью нанотехнологических подходов, отличаются по своим физико-химическим свойствам от соединений, полученных в традиционной лекарственной форме. Магнитные наночастицы можно позиционировать с помощью магнитного поля, а также бесконтактно управлять их перемещением в органах и тканях за счет воздействия внешнего магнитного поля. Клетки транспортируют магнитные наночастицы в «мишени», а
магнитное поле дополнительно фокусирует и . локализует зону терапевтического воздействия.
До настоящего времени остаются недостаточно изученными модельные системы, имитирующие адресную доставку ионов гадолиния в очаг поражения при злокачественных новообразованиях. Не исследованы особенности процесса формирования комплексов гадолиния с холестерической жидкокристаллической дисперсией (ХЖКД) ДНК и возможности адресной транспортировки ионов гадолиния с помощью магнитных наночастиц и макрофагов в злокачественные опухоли.
Цель настоящей работы состояла в создании методов получения и исследования свойств наночастиц - носителей ионов Gd3+ как агентов адресной доставки противоопухолевых средств.
Задачи исследования:
1. Разработать модельные системы, имитирующие адресную доставку
гадолиния в составе частиц ХЖКД комплекса [ДНК-Gd] к клеткам мишени.
2. Показать принципиальную возможность использования частиц
ХЖКД [ДНК-Gd] для НЗТ в качестве системы адресной доставки 157Gd в
опухоль.
-
Разработать способ получения стандартного образца частиц ХЖКД [ДНК-Gd] и обосновать методы оценки качества получаемой системы.
-
Предложить и обосновать возможный механизм появления новых свойств полученных частиц ХЖКД [ДНК-Gd].
Научная новизна. Разработан способ получения ХЖКД ДНК с заданными характеристиками. Впервые получены наноскопические частицы ХЖКД ДНК, содержащие ионы редкоземельных элементов. Стратегия данного подхода принципиально отличается от классических способов создания подобных препаратов (на основе гадопентетовой кислоты и наночастиц на основе хитозана и др.). Частицы ХЖКД комплекса [ДНК-Gd] сохраняют свои свойства в течение длительного времени (более 200 суток).
В результате выполнения данной работы был разработан новый стабильный биоматериал. Комбинация размера наночастиц при максимально
известной на сегодняшний день локальной концентрации гадолиния в частицах (400 мг/мл) и их стабильности открывает путь к практическому применению этого нового биоматериала в качестве основы для Gd-H3T.
Научная и практическая значимость работы. Получен достаточно стабильный, не обладающий цитотоксичностыо, комплекс [ДНК-Gd] с максимальной локальной концентрацией гадолиния. Свойства этого комплекса заметно отличаются от свойств классических холестериков ДНК. Локальная концентрация гадолиния в частице может достигать 400 мг/мл (т.е. до 30% от массы частицы), что делает ее уникальной по сравнению с существующими на сегодняшний день препаратами. Жидкокристаллические свойства наночастиц комплекса дают возможность доставлять гадолиний в ткань опухоли, а их магнитные свойства позволяют осуществлять активную диффузию Gd и удерживать его необходимое время с помощью сильного магнитного поля. Вследствие высокой локальной концентрации гадолиния его воздействие происходит точечно (радиус воздействия —100 мкм вокруг частицы), что максимально сохраняет здоровые ткали организма.
Концентрация гадолиния легко контролируется простыми оптическими методами. Эффективность применения данной наносистемы адресной доставки лекарственного вещества заметно превосходит эффективность препаратов с 10В и других препаратов на основе гадолиния.
Положения, выносимые на защиту:
-
Способ получения наночастиц ХЖКД комплекса [ДНК-Gd] на основе молекул нуклеиновых кислот и ионов гадолиния Gd +, связанного в составе частиц с заданными стабильными физико-химическими свойствами.
-
Стандартизация и контроль качества комплекса ХЖКД [ДНК-Gd] с помощью оптических методов.
-
Обоснование возможности использования комплекса ХЖКД [ДНК-Gd] в качестве инструмента для НЗТ как системы адресной доставки гадолиния в ткань опухоли.
4. Возможность адресной доставки комплекса ХЖКД [ДНК-Gd], используя магнитное поле или клетки-переносчики.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005); И-ом Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2005» (Москва, 2005); 4-ой Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование - 2010. Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе в журналах, входящих в список ВАК РФ, - 7.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из Перечня использованных сокращений, Введения, трех глав (Обзора литературы, Экспериментальной части и Обсуждения результатов), Заключения, Выводов, Списка литературы (244 источника). Иллюстрационный материал включает 20 рисунков, 6 таблиц и одну блок-схему.
Молекулярная биофизика и ДНК-нанотехнология
В последнее время внимание исследователей направлено на поиск таких агентов, которые, связываясь со строго определенными участками нуклеиновых кислот, позволяли бы управлять функциональной активностью определенных генов, контролировать их экспрессию, влиять на синтез тех или иных белков. Конечной целью подобных проектов является создание диагностических и генно-инженерных фармацевтических препаратов, которые можно применять в клинической практике при лечении бактериальных и вирусных инфекций, наследственных болезней и онкологических заболеваний [7].
Одной из основных проблем медикаментозного лечения злокачественных новообразований являются побочные эффекты химиотерапии, вызываемые противоопухолевыми препаратами (цитостатиками). В результате их системного введения лишь менее 1 % лекарственного соединения достигает цели - раковых клеток, тогда как основная его часть поражает здоровые ткани организма [8]. Существенное отличие новых типов лекарственных форм от стандартных состоит в возможности реализации на их основе технологий более точной адресной доставки к определенным тканям, клеткам и даже к внутриклеточным органеллам. Идея применения наночастиц для повышения эффективности воздействия фармакологических средств основана на том факте, что вещества, созданные с помощью нанотехнологии, имеют свойства, отличающиеся по физико-химическим параметрам и клиническим характеристикам от фармацевтических препаратов, полученных в макродисперсной форме [9].
Адресная (целевая) доставка лекарств - особый процесс введения фармацевтического препарата для достижения терапевтического эффекта, при котором лекарство концентрируется в определенной области организма -мишени. Направленный транспорт фармацевтических препаратов в очаг развития патологического процесса позволяет добиться повышения эффективности лечения с использованием уже существующих средств лекарственной терапии [10].
Концепция адресной доставки включает в себя наличие лекарственного вещества, имеющего единственную «мишень» в организме (например, злокачественную опухоль), и избирательное высвобождение его в этой «мишени» за контролируемый отрезок времени [11]. Такие лекарственные вещества в составе наночастиц, в том числе и магнитных, липосом, наносом и др., изготавливают и применяют для улучшения фармакокинетических и фармакодинамических свойств. Например, магнитные наночастицы, транспортирующие лекарства, можно позиционировать в организме пациента с помощью магнитного поля. Основное их достоинство — это возможность бесконтактного управления их перемещением в организме с применением внешнего магнитного поля [12]. Магнитные наночастицы, покрытые иммуноспецифическими агентами, могут быстро связываться с эритроцитами, бактериями или злокачественными клетками. Технология адресной доставки состоит в добавлении суспензии магнитных наночастиц с иммобилизованными антителами к клеткам-переносчикам (например, макрофагам, выделенным из организма) in vitro с последующим возвращением этих клеток в собственный организм. Клетки приносят эти частицы к «мишени», а магнитное поле дополнительно фокусирует и локализует зону терапевтического воздействия [13] . В настоящее время особую значимость приобретают исследования комплексов молекул ДНК с различными интеркаляторами природного и синтетического происхождения, например, с ионами редкоземельных элементов. Комплексы между белками и нуклеиновыми кислотами отличаются по структурной организации и выполняют in vivo очень важные биологические функции (эухроматин, рибосомы, структура вирусов). В нуклеопротеидных комплексах нуклеиновые кислоты находятся в различных состояниях. Нуклеосома эухроматина содержит 45% белка, причем одна молекула ДНК взаимодействует с 3 молекулами полипептидов. Белки, входящие в состав нуклеопротеидных комплексов, связываются с определенными участками нуклеиновых кислот, что приводит к изменениям физико-химических характеристик и белков и нуклеиновых кислот [14, 15].
В лаборатории датского профессора P.E.Nielsen (1991) была синтезирована пептидно-нуклеиновая кислота (ПНК) как аналог олигонуклеотидов, способных связываться с двойной спиралью ДНК [16]. Мономером ее основной цепи является Ы-(2-аминоэтил)-глициновое звено, соединенное с тем или иным азотистым основанием через метилен-карбонильные связи. ПНК имеет от 6 до 15 мономерных звеньев с произвольной последовательностью оснований, причем они могут образовываться как с однонитевой ДНК, так и с РНК. Большинство исследований связано не с одиночным олиго-ПНК, а с биспиральными комплексами. Они представляют собой две нити ПНК, соединенные между собой водорастворимым линкером (шпильки-ПНК) и обеспечивающие образование более сложных комплексов.
Перспективы использования комплекса ДНК и РНК с полимерами и неорганическими веществами в генной терапии обсуждаются в ряде работ [17-20].
Одним из направлений генной терапии является применение ген-направленных или антисмысловых агентов, способных тормозить или полностью прекращать действие определенного гена, вызывающего наследственные болезни. При этом прекращается синтез определенных белков, что важно в случае индуцированных наследственных и онкологических заболеваний. Ген-направленные агенты могут ингибировать экспрессию гена на стадии транскрипции, связываясь с соответствующим промотором. Антисмысловые агенты генной терапии действуют на стадии трансляции [21-24]. В качестве таких агентов могут применяться олигонуклеотиды, комплементарные определенным участкам ДНК и РНК. Однако более эффективным для этой цели оказываются ПНК, обладающие высокой стабильностью и специфичностью [25, 26].
Нуклеиновые кислоты были открыты в 1869 г. Ф.Мишером при исследовании химического состава ядер гнойных клеток. В 1891 г. немецкий биохимик А.Кессель впервые указал на существование двух типов нуклеиновых кислот - ДНК и РНК. К началу 40-х годов XX столетия были получены прямые доказательства участия нуклеиновых кислот в передаче генетической информации у всех эукариот, прокариот и вирусов [27, 28].
Нуклеиновые кислоты представляют собой полимеры нуклеотидов. Нуклеотиды соединены друг с другом фосфодиэфирными связями, при этом фосфатная группа 5 -углеродного атома одного нуклеотида связана с З -ОН-группой дезоксирибозы соседнего нуклеотида. На одном конце полинуклеотидной цепи находится З -ОН-группа (З -конец), а на другом - 5 -фосфатная группа (5 -конец) [29]. Первичная структура ДНК определяется последовательностью азотистых оснований. Нуклеиновые кислоты оптически активны (вращают плоскость поляризованного света вправо): рибоза и дезоксирибоза содержат асимметрические атомы углерода, т.к. хиральные центры представлены чистыми антиподами. Присоединение фосфатных групп между СЗ- и С5" -положениями придает цепочке направленность. В молекуле нуклеиновой кислоты содержится одна заряженная фосфатная группа на каждый нуклеотидный остаток.
Нейтрон-захватывающая терапия и ее применение в медицине
Несмотря на большую эффективность нейтронов в лучевой терапии, этот метод имеет один серьезный недостаток - ослабление поглощенной дозы с глубиной в ткани. Из-за этого самая большая доза создается вблизи поверхности, повреждая здоровые клетки, если опухоль находится в глубине ткани. Чтобы обеспечить в злокачественном новообразовании дозу большую, чем в здоровой ткани, необходимо усилить действие нейтронов непосредственно в месте ее расположения. Этого можно добиться с помощью нейтрон-захватывающей терапии (НЗТ). Сущность метода НЗТ заключается в том, что препарат, содержащий стабильный изотоп 1 В, вводится в артерию, питающую злокачественную опухоль. За счет интенсификации обменных процессов при канцерогенезе раковые клетки более активно, чем клетки окружающих тканей, поглощают атомы бора [144]. При облучении злокачественной опухоли потоком тепловых нейтронов внутри поврежденной ткани происходят ядерные реакции: 10В— ПВ— 7Li. Они сопровождаются испусканием а-частиц с энергией 2,8 МэВ и у-квантов с энергией 0,48 МэВ, селективно уничтожающих раковые клетки. Эти вторичные излучения быстро тормозятся, так как имеют малую длину пробега в облучаемых тканях: ядро лития - 5 мкм, а-частицы - 7 мкм. Поскольку размер клетки примерно 10 мкм, то 80% энергии, выделяемой при ядерной реакции, расходуется именно в той клетке, которая содержала ядро бора и поглотила нейтрон. Такая технология позволяет избирательно поражать опухоль, практически не нанося вреда здоровым тканям. Так как для проведения сеансов НЗТ требуются тепловые нейтроны, лечение онкологических больных целесообразно проводить на исследовательских ядерных реакторах [145].
Метод НЗТ основан на взаимодействии двух компонент, каждая из которых в отдельности не оказывает сильного воздействия на клетки. Первая компонента - это стабильный изотоп элемента с высоким сечением захвата тепловых нейтронов, который необходимо сконцентрировать в опухолевых клетках. Вторая - тепловые нейтроны низкой энергии, при поглощении которых нейтрон-захватывающим веществом возникает вторичное излучение. Когда эти оба компонента оказываются в области локализации опухоли, вторичное внутреннее излучение значительно усиливается и избирательно поражает злокачественные клетки [146, 147].
R. F. Barth и соавт. [148, 149] отмечают, что НЗТ особенно актуальна для лечения опухолей головного мозга, где любые другие методы практически неэффективны. Первоначально из-за большого сечения поглощения тепловых нейтронов, значительной энергии реакции и, самое главное, малой длины пробега возникающих в результате реакции частиц, 10В был выделен как наилучший элемент для НЗТ. Все исследования по НЗТ злокачественных опухолей были главным образом направлены на использование этого радионуклида [150-154]. Однако применение В в НЗТ имеет ряд затруднений, связанных со сложностью его накопления и удержания необходимой концентрации в опухоли, а также с определением концентрации в пораженном органе [155-157].
В Японии получены положительные результаты при лечении онкологических больных бор-захватывающей терапией [158, 159]. Вместе с тем, для оптимизации спектра нейтронного излучения разработка НЗТ была связана с применением других элементов, а также с поиском элементов, обладающих большим сечением захвата тепловых нейтронов [160].
В табл. 1.2 приведены сечения взаимодействия тепловых нейтронов с самыми распространенными нуклидами биологических тканей человека. Видно, что с тканями человека тепловые нейтроны практически не взаимодействуют. Очевидна и разница во взаимодействии тепловых нейтронов с тканями человека и с нуклидами, которые могут быть использованы для НЗТ [161, 162]. Можно ожидать, что применение НЗТ для лечения онкологических больных обладает большей безопасностью по сравнению с другими методами лучевой терапии.
A.A.Burlon с соавт. [163] и L.M. Rendina [164] для оптимизации спектра нейтронного пучка добавляли разное количество нуклидов Li к В в зависимости от чувствительности облучаемых клеток. Y.Maruyama и соавт. [165] использовали изотопы калифорния-252 в бор-захватывающей терапии для изменения спектра нейтронного излучения, a R.C. Martin и соавт. [166, 167] предложили Cf в качестве высокоэффективного источника нейтронов для нейтрон-захватывающей брахиотерапии в виде металлокерамических нановолокон из оксида калифорния СґгОз в палладиевом матриксе.
J.G.Weirzbicki с соавт. [168] применяли для НЗТ 151Еи. Его вторичное излучение характеризуется присутствием у-квантов с суммарной энергией 6,26 МэВ, электронов внутренней конверсии и электронов Оже. В результате захвата тепловых нейтронов возникает нуклид 5 Ей, который может перейти в метастабильное состояние, а затем, с последующим -распадом (вероятность 76%), превратиться в гадолиний или с захватом электрона (вероятность 24%) перейти в самарий. Это может значительно увеличить поглощенную в опухоли дозу.
Sm также может быть использован при лечении злокачественных новообразований. Большое накопление самария наблюдается как в здоровой кости, так и в остеогенной саркоме. Метастазы этой опухоли в других органах, возможно, могут сохранять такую же особенность. В этом случае НЗТ может применяться при лечении метастаз остеогенной саркомы легких и других органов. При НЗТ с самарием возникает у-излучение. Лекарственное вещество, содержащее Sm, может быть введено в злокачественное новообразование локально [169].
Впервые гадолиний как элемент для НЗТ предложен в работе G.Locher [170]. Она считается первой публикацией по НЗТ. Сечение захвата тепловых нейтронов 157Gd в 64 раза больше, чем у 10В, и он успешно применяется в диагностике в качестве контрастного вещества для магнитно-резонансной томографии [171, 172]. A.Matsumura и соавт. [173] и S.Geninatii-Crich и соавт. [174] комплексно использовали бор и гадолиний в НЗТ для создания кумулятивного эффекта при облучении. HJ.Weinmman и соавт. [175] в качестве контрастного вещества для ЯМР-диагностики предложено комплексное соединение на основе гадопентетовой кислоты, а позже и другие фармацевтические препараты с гадолинием, способные с большим градиентом накапливаться в опухоли.
Исследование взаимодействия двухцепочечной линейной ДНК с ионами Gd3+
Для выявления механизмов образования комплексов ХЖКД [ДНК- Gd] исследовали процессы взаимодействия ионов гадолиния с двухцепочечнои ДІЖ в различных концентрациях. При комнатной температуре инкубировали водно-солевой раствор (3-Ю"7 М NaCl) нативной ДНК с различными концентрациями хлорида гадолиния в течение одной минуты. На рис. 3.5 изображены спектры КД для растворов линейной ДНК, инкубированных с а амплитуда отрицательной полосы увеличивается, причем ее максимум смещается в красную область спектра. Аналогичные искажения формы спектров КД наблюдали при взаимодействии ионов других редкоземельных металлов (La, Nb, Sm, Tb, Eu, Yb) с молекулами ДНК (рис.3.6).
Обработка экспериментальных данных спектров КД линейных двухцепочечных молекул ДНК в отсутствие и в присутствии GdCb (координаты Аотн - гобщ, где гобщ - отношение молярной концентрации GdCl3 к молярной концентрации оснований ДНК в растворе), показала: при взаимодействии ионов редкоземельных металлов, а также серебра, меди, платины, за счет интеркаляции иона металла в пары азотистых оснований ДНК, происходит изменение заряда тех полинуклеотидных участков ДНК, которые связались с многозарядными ионами. Имеет место и увеличение числа положительных зарядов в биспиральной молекуле. Изменение зарядовых свойств приводит к нарушению конформации двухцепочечной ДНК и сопровождается изменениями формы спектра кругового дихроизма. Причем оно происходит при относительной концентрации GdCb, (гобщ), равной 0,6-0,7, которая сопоставима с концентрацией оснований ДНК.
На рис.3.7 представлены данные, учитывающие значения максимумов поглощения при 260 и 280 нм, деленные на максимальную амплитуду спектра КД. Анализ параметров спектров КД позволяет получить информацию о нарушении вторичной структуры ДНК при воздействии редкоземельных элементов. Результаты экспериментальных исследований позволяют заключить, что изменения спектров КД линейных двухцепочечных молекул ДНК в присутствии ионов Gd могут быть вызваны нарушением параметров вторичной структуры молекулы ДНК. При этом возможно образование ионных связей гадолиния и фосфатных групп нуклеиновой кислоты, поскольку остаток фосфорной кислоты ДНК имеет очень высокое сродство к солям редкоземельных металлов.
Представленные результаты показывают, что при взаимодействии линейной двуцепочечной ДНК с GdCb имеет место переход из В-формы ДНК в её Z-форму. Последняя представляет собой левовращающую двойную спираль. Сахарофосфатный же остов молекулы принимает зигзагообразную конформацию. Эти процессы могут быть обусловлены возникновением кластеров положительных зарядов внешнего остова ДНК вследствие образования комплекса с гадолинием, которое сопровождается изменением растворимости ДНК.
Для исследования процессов образования жидких кристаллов двухцепочечной ДНК, обработанной GdCb, смешивали в присутствии ПЭГ 0,9 мл ДНК с 0,1 мл GdCb- Конечная концентрация ионов гадолиния в 1 мл раствора составляла 1-Ю"5; 2-Ю"5; 3-Ю"5; 4-Ю"5; 5-Ю"5 и 6-Ю"5 М. Затем добавляли 1мл раствора ПЭГ (9,5 10"5 М) и интенсивно перемешивали миксером 3 мин. Полученную смесь инкубировали в течение часа для образования ХЖКД. Каждые 5 мин. записывали спектр КД. На рис. 3.8 приведены спектры кругового дихроизма для ХЖКД, сформированной из молекул ДНК, предварительно обработанных GdCb. Анализ этих данных позволяет заключить, что формирование ХЖКД из линейных молекул ДНК, обработанных GdCb, сопровождается исчезновением в спектре кругового дихроизма аномальной отрицательной полосы {Хмакс = 270 нм), характерной для ХЖКД из необработанных гадолинием молекул ДНК.
Таким образом, если сформировать ХЖКД ДНК и добавить хлорид гадолиния, то происходит вторичная амплификация аномальной оптической активности. При формировании ХЖКД из ДНК, уже обработанной гадолинием, образуются частицы, лишенные холестерической структуры. При регистрации спектров поглощения ХЖКД [ДНК-Gd] в области X = 240-600 нм установлено, что при концентрации GdCl3 в ПО"3 М имеет место поглощение в области спектра (Я 350 нм), где ни ДНК, ни ПЭГ квантов света не поглощают.
Сохранение «кажущейся оптической плотности» свидетельствует о том, что частицы комплексов ДНК-Gd присутствуют в растворе в аморфном состоянии. Их жидкокристаллический характер исчезает, и раствор уже не обладает той оптической активностью, которая свойственна жидким кристаллам. По данным Ю.М. Евдокимова и соавт. [213-215], нарушение регулярного характера вторичной структуры в результате действия химических реагентов само по себе не оказывает воздействия на способность молекул ДНК к образованию частиц дисперсии. Однако эта способность ДНК к образованию частиц дисперсии существенным образом сказывается на взаимодействии между соседними молекулами «модифицированной» ДНК в момент их сближения при фазовом исключении. Нарушение характера взаимодействия может приводить, главным образом, к пространственному упорядочению соседних модифицированных молекул, препятствуя их холестерической упаковке.
Результаты наших экспериментов позволяют сделать вывод, что образование комплексов Gd с парами оснований ДНК не влияет на способность молекул ДНК к образованию частиц дисперсии. Однако оно нарушает характер «узнавания» соседних комплексов [ДНК-Gd] при их пространственном сближении в результате фазового исключения: образуется частица, которая лишена упорядоченности, свойственной жидким кристаллам, и она не может быть отнесена к разряду наночастиц.
В зависимости от того, каким способом получены наночастицы, возникает их внутренняя структура - холестерическая или аморфная. Полученные наночастицы на основе ХЖКД ДНК и содержащие ионы гадолиния открывают перспективу применения их в НЗТ онкологических заболеваний. Положительный заряд на поверхности частиц обусловлен связыванием мультизарядных ионов и препятствует их слипанию в единую фазу. Холестерическая природа и аномальная оптическая активность наночастиц могут служить важным показателем для определения их физико-химических характеристик в НЗТ.
Методика определения пространственной упаковки комплекса ХЖКД [ДНК-Gd] методом КД
С целью гармонизации требований к качеству полученного комплекса ХЖКД [ДНК-Gd] целесообразно разработать унифицированные методы контроля качества, подлинности и стандартизации наночастиц, полученных на основе композитной дисперсии.
Спектрофотометрические методы широко применяются для анализа многокомпонентных систем, так как позволяют провести количественное определение компонентов без их предварительного разделения. Спектры КД содержат информацию о состоянии микроокружения молекулы и возможных образованиях надмолекулярного порядка. Для двухцепочечных молекул ДНК в спектрах КД наблюдается значительное поглощение в области 255-260 нм, обусловленное 7Г-7Г - переходами кольцевых структур азотистых оснований.
Дополнительное усиление коэффициента экстинкции может быть связано с вторичной структурой ДНК и является отражением состояния полинуклеотидного каркаса молекулы.
Для определения структурных параметров молекул ДНК, используемых для конструирования ХЖКД-комплексов, мы рекомендуем пременение гипохромного эффекта. Это явление заключается в том, что экстинкция пуринов и пиримидинов в области X - 260 нм в двухцепочечной спирализированной молекуле ДНК на 34% ниже, чем в аморфном состоянии.
Причина гипохромного эффекта состоит в образовании большого числа водородных связей между ориентированными в одной плоскости комплементарными азотистыми основаниями.
Изменения дипольных моментов перехода комплементарных пуринов и пиримидинов приводит к возникновению электростатических взаимодействий в соседних парах азотистых оснований биспиральной молекулы ДНК и уменьшению интенсивности поглощения света. Гипохромный эффект может служить в первом приближении мерой степени упорядоченности вторичной структуры ДНК. Для оценки образования надмолекулярных комплексов с различными лигандами и определения качества ДНК для получения ХЖКД - наночастиц, являющихся перспективными носителями гадолиния для НЗТ, - можно рекомендовать спектры КД стандартизированной биспиральной молекулы ДНК.
