Введение к работе
Актуальность исследования. Сердечно-сосудистые заболевания наравне с онкологическими заболеваниями и диабетом прочно удерживают первенство среди самых распространенных и опасных заболеваний XX и XXI веков.
Патологический тромбоз, связанный с усиленной активностью тромбоцитов и повышенным внутрисосудистым свертыванием крови, - частая и непосредственная причина смерти при ряде сердечно-сосудистых заболеваний (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда и т.д.). Исходя из чрезвычайно важной роли, которую выполняют тромбоциты в процессе тромбообразования, существует острая необходимость в создании антитромбоцитарного препарата генерализованного типа действия, т.е. средства, которое угнетало бы все виды функциональной активности тромбоцитов независимо от природы агониста.
В последнее время резко возрос интерес к ковалентным (необратимым) ингибиторам тромбоцитов. Эти ингибиторы подавляют функции тромбоцитов путем химической модификации молекулярных мишеней клеток. По сравнению с другими ингибиторами, действие которых связано с обратимым связыванием с мишенью, эффективность ковалентных ингибиторов определяется их двумя основными свойствами. Одно из них заключается в перманентном угнетении функций тромбоцита на весь срок его жизни. Второе свойство - кумулятивность небольших доз ингибитора в организме, что обеспечивает снижение побочного действия. К категории ковалентных ингибиторов относятся ацетилсалициловая кислота (аспирин) и тиенопиридины (тиклопидин, клопидогрел, прасугрел). Аспирин - давно признанное и высокоэффективное противотромбоцитарное средство (Awtry et al., 2000; Wu, 2003; Undas et al., 2007), необратимо блокирует циклооксигеназу I (синтазу простагландина H2 - 1), ацетилируя гидроксильную группу 530 серина (Patrono et al., 2009). Тиенопиридины ингибируют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов (Guerra et al., 2009). Механизм их действия заключается в необратимом блокировании связывания АДФ с тромбоцитарным рецептором P2Y12. Активными блокаторами этих рецепторов являются не сами тиенопиридины, а их метаболиты, образующиеся в печени (Clutton et al., 2001; Pereillo et al., 2002).
В качестве перспективного средства для борьбы с тромбозами также предложены хлораминовые производные биогенных соединений, главным образом аминокислот и таурина. Аминокислотные хлорамины являются природными веществами; они образуются в организме в активированных нейтрофилах при взаимодействии аминокислот с гипохлоритом, синтезируемым в реакции, катализируемой миелопероксидазой (Slivka et al., 1980; Thomas et al., 1979, 1995). Хлораминовые производные аминокислот обладают выраженной способностью угнетать функции тромбоцитов, в первую очередь их агрегацию (Мурина и др., 1998, 2004, 2006; Рощупкин и др. 1995, 2007). Поэтому возможно создание на их основе нового ингибитора тромбоцитов для предупреждения артериального тромбообразования (Мурина и др, 1998, 2010). Однако хлораминовые производные аминокислот - внутренне нестабильные соединения, что ограничивает возможность использование их в качестве лекарственного средства. Производные хлорамина таурина более стабильные соединения. Можно полагать, что они могут стать основой получения новых лекарственных соединений с антиагрегационным действием.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение физико- химических свойств и молекулярно-клеточных механизмов антиагрегантного действия стабильных хлораминовых производных аминокислот и таурина.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
-
Изучить связь констант скоростей распада хлораминовых производных ряда аминокислот с их структурой.
-
Провести компьютерный квантово-механический расчет характеристик хлораминовых производных аминокислот, прежде всего, парциальных зарядов атомов, как показателей их устойчивости.
-
Исследовать антиагрегантные свойства хлораминовых производных аминокислот и таурина, выяснить изменения их активности под влиянием сывороточного альбумина.
-
Исследовать механизм модификации серосодержащих атомных групп при действии хлораминовых производных аминокислот.
Научная новизна исследования. Определены константы скоростей распада хлораминовых производных ряда моноаминовых а-аминокислот.
Спектрофотометрическим методом выявлено несколько аминокислотных хлораминов с повышенной устойчивостью. К ним относятся N-хлорглицин, N-хлорвалин, N- хлортреонин и N-хлоризолейцин. Молекулам этих хлораминов свойственна структурная особенность в P-положении. В случае хлорамина глицина отсутствует атом углерода в указанном положении, а производные остальных трех аминокислот имеют разветвление структуры. У менее устойчивых хлораминов (N-хлорсерин, N-хлорлейцин, N- хлорнорлейцин, N-хлораланин и N-хлорфенилаланин) замещен лишь один атом водорода. Выходит, устойчивость хлораминов аминокислот в значительной степени можно отнести на счет свойств атома углерода в (3-положении. Это заключение подкрепляется результатами расчета парциальных зарядов атомов.
Проведен компьютерный расчет парциальных атомных зарядов Уанга-Форда хлораминов а-аминокислот параметрическим квантово-механическим методом АМ1. Показано, что хлорамины с повышенной устойчивостью отличаются высокими положительными суммами зарядов трех атомов: углерода в а- и (3-положениях и атома углерода карбоксильной группы. Высокий парциальный заряд получен и для одного атома углерода в (3-положении. Эти расчетные величины можно использовать для предсказания устойчивости новых хлораминов. Одно из предсказаний свидетельствует, что наиболее высокие атомные заряды и устойчивость характерны для хлораминовых соединений аминокислотного ряда, у которых все атомы водорода в (3-положении замещены углеводородными цепями или гидроксильными группами.
Исследована закономерность угнетения хлориминовыми и хлораминовыми ингибиторами начальной агрегации изолированных тромбоцитов в присутствии сывороточного альбумина быка (БСА). Обнаружено, что в суспензии тромбоцитов с сывороточным альбумином антиагрегационное действие исследуемых соединений усиливалось. Согласно спектрофотометрическим измерениям, сывороточный альбумин способен связывать хлорамины (показано на примере К,К-дихлортаурина), что влечет за собой изменение конформации белка. Можно предполагать, что повышенная антиагрегантная эффективность хлораминов таурина в присутствии сывороточного альбумина есть результат особого взаимодействия с тромбоцитами белково- хлораминового комплекса.
Спектрофотометрическим методом изучены возможные механизмы модификации серосодержащих атомных групп (на примере дитиотреитола) под действием хлораминовых производных аминокислот, а также гипохлорита (хлорноватистой кислоты). Установлено, что в этом процессе происходит окисление серосодержащих групп с образованием циклического дисульфида (1,2-дитиан-4,5-диола). Действие гипохлорита или хлорамина на 1,2-дитиан-4,5-диол в умеренно кислой среде (рН около 3) приводит к образованию S-оксида (тиосульфината). Получено, что хлорамины способны модифицировать дисульфидные мостики тромбоцитов по пути образования S-оксидов.
Практическое значение работы. Обнаруженные нами закономерности антиагрегационного действия хлораминовых производных таурина на тромбоциты могут быть использованы для разработки нового лекарственного средства для борьбы с внутрисосудистым тромбообразованием. Кроме того, хлораминовые производные аминокислот являются вторичными продуктами миелопероксидазной реакции, протекающей в нейтрофилах, поэтому изучение функциональной активности клеток под действием хлораминов представляет интерес.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на национальной научно- практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2007, 2009, 2011); на крымском симпозиуме «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, 2008, 2009, 2010); на международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем" (Минск, 2008, 2010); на научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины» (Москва, 2008).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 124 страницах, содержит 43 рисунка, 2 таблицы и 5 схем, состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение» и выводов. Список литературы включает 136 наименований.
