Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одним из широко распространенных методов терапии является ауто-трансфузия УФ-облученной крови (АУФОК). Ведущее место в лечебном эффекте АУФОК принадлежит перестройке иммунной системы организма. Объектами непосредственного воздействия УФ-света являются все компоненты крови, в том числе иммунокомпетентные клетки и гуморальные факторы иммунитета.
Для нормального протекания иммунного ответа в организме необходима сбалансированная активность взаимодействующих иммуннорегуляторных клеток. В большинстве случаев В-лимфоциты для обеспечения гуморального иммунного ответа нуждаются в помощи Т-лимфоцитов. Взаимосвязь и взаимная регуляция этих клеток опосредованы цитокинами, а также поверхностными к о стимулирующими и адгезионными молекулами (И.С. Фрейдлин, А.А. Тотолян, 2001).
Ключевым этапом функционирования иммунной системы является экспрессия поверхностных рецепторов, которые обеспечивают восприятие клеткой внешних сигналов. На поверхности мембран лимфоцитов в большом количестве экспрессируются молекулы рецепторных комплексов, принимающих участие в антигенраспознающей функции Т- (CD3-TCR, корецепторы CD4 и CD8) и В-лимфоцитов (костимулирующие молекулы BCR - CD 19, CD20 маркеры) (А.А. Ярилин, 1999; P.M. Хаитов, 2006). Под воздействием различных агентов клетки приспосабливаются и отвечают на это изменением экспрессии тех или иных мембранных и внутриклеточных маркеров.
Однако до настоящего времени остаются малоизученными многие аспекты физико-химических механизмов лечебного эффекта фотомодифициро-ванной крови. Предполагается, что передача вызванных светом изменений от фотомодифицированных клеток к интактным является следствием образования облученными лейкоцитами активных форм кислорода (АФК) и немедленной инициации каскада АФК-образующих реакций в объеме всей циркулирующей крови (В.И. Карандашов и др., 2001; Е.Е. Дубинина, 2001). Известно, что ключевым моментом в фотомодификации клеток УФ-излучением является индукция пероксидного фотоокисления липидов (ПФОЛ). Это приводит к изменению структуры мембран и нарушению их целостности (Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков, 1972).
Естественно, что изменения функционирования иммуноцитов не могут не иметь метаболической основы. Применение УФ-света как модулятора функциональной активности лимфоцитов ведет к изменению метаболизма клеток, переключая субстратные потоки с одного метаболического пути на другой, влияя на энергетические и синтетические процессы в них.
В настоящее время недостаточно изучено влияние УФ-облучения на катаболизм клеток, в частности лимфоцитов. С энергетическим метаболизмом тесно связана функциональная активность иммунокомпетентных клеток. Именно обеспеченность или недостаток энергии определяет дальнейшую
цепь регуляторных, метаболических и структурных изменений в организме (С.Н. Игнатьева, Р.В. Кубасов, 2009).
Сообщения о токсическом действии АФК (повышение уровня ПОЛ, инактивация ферментов) вызывают неоднозначное отношение к методу АУ-ФОК (A. Morita et al., 1997). К настоящему времени установлено, что УФ-свет является потенциальным индуктором апоптоза в клетках различных типов, в том числе и иммунокомпетентных (И.Ф. Донская и др., 1997). Известно, что апоптоз иммунокомпетентных клеток в условиях У Ф-В-излучения запускается CD95 (Ра8/Аро-1)-рецепторно/лигандной системой (R. Caricchio et al., 1998). Было выявлено (В.Г. Артюхов и др., 2011) образование фрагментов ДНК неодинакового размера при действии на лимфоциты УФ-света и АФК, что может быть связано с запуском различных путей апоптоза, осуществляемых с участием фактора AIF и транскрипционного факторар5Ъ.
В связи с вышеизложенным возникает необходимость проведения исследований, направленных на изучение молекулярно-клеточных механизмов, лежащих в основе изменений структурно-функциональных свойств и метаболизма лимфоцитов, УФ-облученных в терапевтическом диапазоне доз. Это позволит в дальнейшем модифицировать их функциональные свойства для достижения прогнозируемых эффектов коррекции иммунных расстройств.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение структурно-функционального состояния компонентов Т- и В-клеточного звена иммунитета человека, метаболических изменений и путей гибели лим-фоцитарных клеток после воздействия УФ-излучения при различных условиях инкубации.
В связи с вышесказанным перед нами были поставлены следующие задачи:
-
Изучить влияние УФ-света (240-390 нм) в дозах 151 и 755 Дж/м на популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов и уровень экспрессии основных мембранных маркеров рецепторного комплекса Т- и В-лимфоцитов.
-
Оценить уровень ПОЛ мембран фотомодифицированных лимфоци-тарных клеток, инкубированных в отсутствие и в присутствии антиоксидан-тов и аутологичной плазмы крови.
-
Рассмотреть действие УФ-света на активность ферментов дихотомического пути окисления глюкозы - лактатдегидрог еназы, сукцинатдегидро-геназы и цитохром с оксидазы, ответственных за энергообеспечение лимфоцитов крови человека.
2+
-
Изучить влияние УФ-света на активность Са -АТФазы плазматических мембран иммунокомпетентных клеток.
-
Оценить влияние УФ-света в широком диапазоне доз (151 - 3020 Дж/м ) на характер гибели лимфоцитов периферической крови доноров.
-
Изучить влияние аутологичной плазмы крови на метаболизм и структурно-функциональные свойства лимфоцитарных клеток.
Научная новизна. Работа представляет собой систематическое исследование структурно-функциональных изменений лимфоцитарных клеток человека после воздействия УФ-излучения.
Впервые исследованы изменения абсолютного количества иммуноцитов, их субпопуляционного состава и изменения уровня экспрессии CD3, CD4, CD8, CD 19, CD25, CD95 маркеров в условиях комплексного воздействия УФ-излучения (240-390 нм) в дозах 151 и 755 Дж/м и аутологичной плазмы крови.
Установлено, что УФ-свет в дозах 151 и 755 Дж/м вызывает снижение числа CD3 - и CD 19 -клеток в ходе суточной инкубации суспензии лимфоцитов в отсутствие аутологичной плазмы крови; в то время как в присутствии плазмы популяционный состав лимфоцитов достоверно не отличается от их исходного количества.
Выявлено, что УФ-свет в дозах 151 и 755 Дж/м повышает экспрессию CD3, CD 19, CD8, CD25 и CD95 рецепторов при одновременном снижении экспрессии CD4 маркеров. Увеличение уровня экспрессии тестируемых показателей обусловлено в основном синтезом данных рецепторов de novo.
Обнаружено, что в фотомодифицированных лимфоцитах наблюдается активация аэробного пути окисления глюкозы, что позволяет клеткам восстановить через сутки уровень внутриклеточного АТФ после его снижения через 4 часа после УФ-облучения.
Выявлено, что УФ-свет в дозах 151 и 755 Дж/м вызывает гибель клеток путем рецептор-опосредованного апоптоза. Использование высоких доз облучения (1510 и 3020 Дж/м ) приводит к массовой гибели клеток путем некроза.
Использование аутологичной плазмы при инкубации фотомодифицированных лимфоцитов позволяет снизить количество и апоптотических, и некротических клеток за счет содержащихся в плазме антиоксидантов и ростовых факторов.
Предложены схемы возможных процессов действия УФ-света на структурно-функциональное состояние и метаболизм лимфоцитов.
Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления о механизмах действия УФ-излучения на функционирование клеток иммунной системы.
Данные, полученные при исследовании влияния УФ-света на популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов и уровень экспрессии CD3, CD4, CD8, CD25 маркеров на поверхности Т-лимфоцитов и CD 19 рецепторов на поверхности В-клеток, необходимо учитывать при разработке способов регулирования межклеточных взаимодействий иммунных клеток организма человека.
Результаты изучения индуцированных УФ-светом изменений метаболизма, уровня энергообеспеченности и путей реализации клеточной гибели иммуноцитов важны для понимания тонких механизмов регуляции и функционирования компонентов иммунной системы в норме и при патологии.
Полученные экспериментальные данные могут способствовать разработке новых подходов к иммунокоррекции отдельных звеньев иммунного ответа при различных патологических состояниях организма.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 5 Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2009); 13ой Международной Пущинской школе-конференции «Биология - наука ХХІвека» (Пущино, 2009); 8ой Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010); Международной научной конференции «Современные проблемы радиобиологии» (Гомель, 2010); 21 Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); Международной научной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011); 4 Всероссийском с международным участием конгрессе «Симбиоз-Россия 2011» (Воронеж, 2011); 16ой Международной Пущинской школе-конференции «Биология - наука ХХІвека» (Пущино, 2012), а также на Научных отчетных конференциях преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2011, 2012).
Публикации. По теме диссертационной работы имеется 15 публикаций: 7 статей и 8 тезисов, в том числе 4 статьи в журналах из «Перечня ВАК РФ».
На защиту выносятся следующие положения:
-
УФ-свет (151-755 Дж/м ) вызывает активацию пероксидного окисления липидов, что приводит к изменению структурного состояния лимфо-цитарных мембран, уровня экспрессии молекул рецепторного комплекса Т-клеток (CD3, CD4, CD8, CD25) и В-лимфоцитов (CD19).
-
УФ-свет (151 - 755 Дж/м ) модулирует изменение энергетического метаболизма лимфоцитов.
-
УФ-свет (151 - 755 Дж/м ) активирует апоптотическую гибель лим-фоцитов, УФ-свет (1050 - 3020 Дж/м ) приводит к некрозу иммуноцитов.
-
Использование аутологичной плазмы крови при инкубации лимфоцитов способствует нормализации метаболических и структурных фотоинду-цированных изменений и предотвращает гибель иммунокомпетентных клеток.
5. Схемы возможных процессов действия УФ-света на структурно-
функциональное состояние и метаболизм лимфоцитов в отсутствие и присут
ствии аутологичной плазмы крови.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа включает 175 страницы машинописного текста; состоит из «Введения», 7 глав, «Заключения», «Выводов». Список литературы содержит 293 источника. Иллюстрационный материал включает 42 рисунка.
