Введение к работе
Актуальность темы
Система гемостаза является одной из важнейших систем организма, служащей для предотвращения кровопотери при нарушении целостности сосуда. Результатом работы этой системы является тромб, локализованный в месте повреждения сосуда и препятствующий выходу крови из него. Изучение этой системы является важной задачей для понимания принципов ее работы и предупреждения тромбозов и кровотечений в клинике. В настоящее время существует множество методов исследования свертывания. Тромбоцитарную часть системы гемостаза изучают, в основном, с помощью агрегометрии, микроскопии и проточной цитометрии. Для диагностики плазменного звена помимо исследования активности отдельных плазменных белков существуют так называемые интегральные тесты. Они призваны оценивать работу системы свертывания в целом. Самыми простыми из таких тестов являются времена свертывания, однако, на сегодняшний момент стало ясно, что они не дают достаточной информации о функционировании системы. В связи с этим развиваются новые интегральные тесты, более чувствительные к патологиям плазменного звена. Кроме того, активно исследуются возможности проводить эти тесты с участием тромбоцитов.
К современным интегральным тестам можно отнести тромбоэластографию, тест тромбодинамики и тест генерации тромбина (ТГТ), которому, в основном, и посвящена данная работа. Идея метода заключается в измерении кинетики производства и расходования тромбина в сворачивающейся крови или плазме крови с помощью предварительно добавленного в образец флюорогенного субстрата, специфичного к тромбину [Regnault, V., et al. 2004]. Как правило, в результате получают кривую зависимости концентрации тромбина от времени с одним максимумом. В данной работе впервые было показано, что при свертывании богатой тромбоцитами плазмы ингибиторы активации тромбоцитов способствуют образованию двух максимумов на кривой генерации тромбина. Был определен механизм этого явления и предложена новая модификация теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме, содержащей небольшую концентрацию ингибитора активации тромбоцитов.
Цель работы. Исследовать механизм образования двух максимумов на кривой генерации тромбина и оценить возможность применения этого эффекта для предсказания кровотечений у пациентов с тяжелой формой гемофилии А.
Задачи исследования.
1. Исследовать влияние малых концентраций ингибиторов активации
тромбоцитов на генерацию тромбина в богатой тромбоцитами плазме, показав
возможность образования двух максимумов на кривой генерации тромбина.
-
Исследовать влияние этих ингибиторов на секрецию -гранул и экспрессию фосфатидилсерина тромбоцитами с помощью проточного цитометра.
-
Разработать метод оценки параметров кривой генерации тромбина с двумя пиками.
4. Исследовать статус системы свертывания у пациентов с легким и тяжелым течениями тяжелой формы гемофилии А с помощью теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме и в присутствии небольшой концентрации ингибитора тромбоцитов, позволяющей получить два пика на кривой. Сравнить полученные результаты с данными других современных интегральных тестов.
Научная новизна. Впервые показано, что при добавлении в богатую
тромбоцитами плазму веществ, ингибирующих активацию тромбоцитов, на кривой
генерации тромбина образуются два пика. Определен механизм образования двух
максимумов на этой кривой. При добавлении ингибиторов активации тромбоцитов
скорость экспрессии фосфатидилсерина на них снижается. Вследствие этого
фосфолипидная поверхность, предоставляемая активированными тромбоцитами,
появляется в плазме позже, и пик производства тромбина разделяется на два. Первый
пик формируется, главным образом, за счет реакций свертывания на фосфолипидах
плазмы и секреции -гранулярных белков, на которые исследованные ингибиторы в
выбранных концентрациях влияния не оказывали. Второй пик на кривой генерации
тромбина формируется только за счет замедленного экспонирования
фосфатидилсерина тромбоцитами. Далее был разработан метод анализа параметров
двух пиков, базирующийся на аппроксимации кривой экстремальным
распределением первого типа (распределением Гумбеля). Предложена возможность создания новой модификации теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме, в основу которой положено явление образования двух пиков на кривой генерации тромбина при добавлении диметилсульфоксида. Было показано, что амплитуда второго пика и эндогенный тромбиновый потенциал в тесте генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме являются единственными параметрами, достоверно отличающимися между группами пациентов с разной тенденцией к кровоточивости.
Научно-практическое значение. В данной работе ингибиторы тромбоцитов использовали в концентрациях, близких к применяемым в лабораторно-диагностической и клинической практике. Появление двух пиков на кривой генерации тромбина может свидетельствовать о том, что тромбоциты донора демонстрируют замедленную скорость экспонирования фосфатидилсерина. Эта информация может быть полезной при выборе доз антиагрегантов и антикоагулянтов. Также в данной работе предложен новый метод, позволяющий отражать клиническое состояние больных тяжелой формой гемофилии А. Полученные результаты позволяют предполагать, что коррекция свертывания при легком течении тяжелой формы гемофилии связана, главным образом, с тромбоцитами, экспрессирующими фосфатидилсерин в процессе их активации.
Положения, выносимые на защиту:
-
Показано, что ингибиторы активации тромбоцитов вызывают формирование двух пиков на кривой генерации тромбина путем снижения скорости экспонирования фосфатидилсерина на мембранах тромбоцитов.
-
Разработан метод оценки параметров кривой генерации тромбина с двумя максимумами.
-
Предложена возможность создания новой модификации теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме, содержащей ингибитор активации тромбоцитов в малой концентрации.
-
Показано, что амплитуда второго пика на кривой генерации тромбина и эндогенный тромбиновый потенциал в богатой тромобцитами плазме являются единственными параметрами коагуляционных тестов, различающимися у людей с легким и тяжелым фенотипами гемофилии А.
Апробация работы состоялась 26 марта 2012 года на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.
Результаты диссертационной работы были представлены на 5-й Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», Москва, 3-5 февраля, 2011; 36th FEBS Congress, Torino, Italy, 25-30 июня 2011, XXIII Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Kyoto, Japan, 23-28 июля 2011, 58th Annual Meeting of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Liverpool, UK, 27 – 30 июня, 2012, XXIV Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Amsterdam, the Netherlands, 29 июня – 4 июля, 2013.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ. Статей в рецензируемых журналах – 2; публикаций в трудах конференций и съездов – 10.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 93 страницах
машинописного текста, состоит из введения, списка сокращений, четырех глав
(главы 1 – обзора литературы, главы 2 – описания материалов и методов, главы 3 –
описания экспериментальных результатов, главы 4 – обсуждения результатов),
выводов и библиографического указателя, включающего 253 источника. Работа
выполнена на базе Центра теоретических проблем физико-химической
фармакологии РАН в лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией проф. д. ф.-м. н. Пантелеев М. А.) и Гематологического научного центра Министерства здравоохранения РФ в лаборатории физической биохимии (зав. лабораторией проф. д. б. н. Атауллаханов Ф. И.).
