Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди веществ, присутствующих в любом организме, включая человека, вода преобладает. При этом необходимо ее постоянное поступление и обновление. Вода в биологических объектах представляет собой сложную систему, содержащую растворенные в ней атмосферные газы, различные ионы и другие компоненты, среди которых важная роль принадлежит активным формам кислорода (АФК). По современным представлениям, АФК в биологических системах являются как повреждающими, так и сигнальными агентами. При этом биологические объекты являются вторичными сенсорами образования АФК в водной среде. Вероятно, именно вода является основным первичным сенсором, а АФК - первичными медиаторами при воздействии на организм различных физических факторов. В настоящее время обстоятельно изучено образование АФК в воде при воздействии на нее таких физических факторов, как ионизирующие и ультрафиолетовое излучения. Увеличение внутриклеточной концентрации АФК выше уровня антиоксидантной защиты вызывает «окислительный стресс», который сопровождается негативными для жизнедеятельности клеток процессами, такими как перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков и нуклеиновых кислот [Зенков и др., 2001]. Окислительные повреждения ДНК связаны с такими процессами, как мутагенез [Cheng et al., 1992], канцерогенез [Olinski et al., 2002], старение и ряд связанных с ним болезней пожилого возраста [Beckman and Ames, 1997]. Значительная часть (60-80 %) повреждений ДНК, вызванных радиацией, формируется за счет АФК, образованных при радиолизе воды [Газиев, 1999]. Повреждения молекул ДНК являются одной из основных причин пострадиационной гибели животных [Ярмоненко, Вайсон, 2004]. С другой стороны, АФК играют в организме млекопитающих важную сигнально- регуляторную роль [Saalu, 2010]. Установлено, что клетки млекопитающих обладают по крайней мере одним О2*--сенсором и двумя типами Н2О2-сенсоров, направленных на адаптацию организма к окислительному стрессу [Hernandez-Garcia et al., 2010]. Инициация и развитие окислительного стресса в основном изучены для радиационно- индуцированных процессов, ряда болезней и патологических состояний. Однако первичные мишени и физико-химические механизмы генерации АФК под действием многих физических факторов, возможность инициации окислительного стресса низкоинтенсивными физическими факторами, а также их вклад в поддержание уже развившегося окислительного стресса остаются малоизученными. Выяснение фундаментальных физико-химических механизмов возникновения окислительного стресса под действием физических факторов позволит разработать новые методы его коррекции и предотвращения патологических последствий в организме животных и человека. В связи с этим, исследование физико-химических механизмов лежащих в основе окислительного стресса, а также изучение возможности его коррекции, представляют собой новую актуальную научную проблему.
Цель и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении физико- химических механизмов генерации АФК в воде и водных растворах при воздействии таких физических факторов, как тепло, видимый свет, лазерные и рентгеновское излучения.
В соответствии с целью были поставлены основные задачи:
1. Установить физико-химические механизмы образования активных форм кислорода в воде и водных растворах при воздействии тепла, видимого света, лазерных излучений (632,8; 1264 нм). Оценить способность влияния ряда биологически значимых анионов на этот процесс.
-
Исследовать возможность образования окислительных повреждений ДНК под действием тепла, видимого света и лазерных излучений (632,8; 1264 нм) в полосах поглощения молекулярного кислорода.
-
Исследовать процессы люминесценции воды после воздействия на нее ряда неионизирующих излучений.
-
Исследовать образование долгоживущих радикалов белка под действием ионизирующего излучения и образование активных форм кислорода в водных растворах при воздействии долгоживущих радикалов белка и аминокислот.
-
Исследовать развитие окислительного стресса в организме экспериментальных животных при воздействии долгоживущих радикалов белка, индуцированных рентгеновским излучением.
-
Исследовать антирадикальные свойства гидратированного фуллерена С60 и ряда природных пуриновых соединений.
Положения, выносимые на защиту. 1). Физико-химический механизм образования активных форм кислорода в воде и водных растворах под действием тепла, света, лазерных излучений (632,8; 1264 нм). 2). При воздействии на водные растворы белков иоинзирующего излучения происходит образование долгоживущих радикалов белков с временами полужизни несколько часов, способных повреждать структуру ДНК и приводить к генерации активных форм кислорода. 3). Тепло, видимый свет и лазерные излучения (632,8; 1264 нм) низких интенсивностей могут приводить к развитию ряда повреждений биомакромолекул, сходных с повреждениями, образующимися при окислительном стрессе. 4). Гидратированный фуллерен С60, ряд природных пуриновых нуклеозидов и их производных проявляют существенные антирадикальные свойства in vitro и препятствуют развитию последствий радиационно-индуцированных повреждений в организме млекопитающих.
Научная новизна. Установлено, что при воздействии ряда неионизирующих физических факторов (тепла, света, видимых и инфракрасных лазерных излучений, а также электромагнитного излучения крайне высоких частот с большой пиковой мощностью) в воде, насыщенной атмосферным воздухом, происходит образование АФК. Показано, что образование АФК в воде под действием видимого и инфракрасного излучений происходит только при воздействии излучения c длинами волн, cоответcтвующими максимумам поглощения молекулярного кислорода. Интенсивность образования наиболее долгоживущей АФК - перекиси водорода - в воде при воздействии исследуемых физических факторов зависит от рН и концентрации растворенного кислорода. Выявлен физико-химический механизм образования АФК в воде под действием тепла, света, лазерных излучений (632,8; 1264 нм). Пусковым этапом для этого процесса является переход кислорода из триплетного в синглетное состояние. Синглетный кислород восстанавливается до супероксид-анион радикала, протонированная форма которого дисмутирует с образованим перекиси водорода. Выявлено влияние биологически значимых анионов как доноров электронов в процессе образования перекиси водорода и гидроксильных радикалов под действием тепла. Воздействия на воду исследуемых неионизирующих излучений индуцируют в ней возникновение люминесценции. Выделены три фазы процесса люминесценции водных растворов: период индукции, период возникновения и нарастания свечения раствора, период колебательных изменений свечения воды с периодами 5 и 19 мин. Запуск автоколебаний люминесценции связан с возбуждением растворенного в воде молекулярного кислорода. Установлено, что перекись водорода, СОД, каталаза и азид натрия в существенной мере влияют на процесс люминесценции воды. При воздействии тепла, видимого света, лазерных излучений (632,8; 1264 нм) на растворы ДНК in vitro происходит образование повреждений ДНК.
Предложен новый подход, позволяющий регистрировать возникновение долгоживущих радикалов белка при воздействии ионизирующей радиации в дозах не более 20 Гр. Показано, что при действии на белковый раствор ионизирующей радиации образуется два типа радикалов: с периодом полужизни в диапазоне нескольких десятков минут и с периодом полужизни несколько часов. Показано, что долгоживущие радикалы белков и аминокислот способны к генерации перекиси водорода в водных растворах. Установлен физико-химический механизм образования перекиси водорода в растворе под воздействием долгоживущих радикалов белка. Показано, что долгоживущие радикалы белков способны приводить к окислительному повреждению ДНК in vitro и in vivo. Впервые показаны возможные проявления генотоксических свойств долгоживущих радикалов белка in vivo при нахождении их в кровяном русле и желудочно-кишечном тракте млекопитающих.
Впервые установлено, что гидратированные фуллерены значительно уменьшают радиационно-химический выход гидроксильных радикалов in vitro. Показан нестехиометрический характер антирадикальных свойств фуллерена. Данный препарат фуллеренов in vitro и in vivo эффективно предотвращает радиационно-индуцированное образование повреждений ДНК. Показано, что гидратированные фуллерены проявляют радиопротекторные свойства при введении их самцам мышей за 1 ч до тотального облучения рентгеновским излучением в летальной дозе. Установлено, что гидратированные фуллерены уменьшают тяжесть радиационно-индуцированных повреждений сосудов в легких, перикардии и тонком кишечнике.
Установлено, что ряд пуриновых соединений являются эффективными природными антиоксидантами. Они, особенно гуанозин и инозин, значительно уменьшают количество АФК, образующихся при воздействии ионизирующей радиации и тепла in vitro. Показано, что природные пуриновые соединения in vitro и in vivo эффективно предотвращают образование повреждений ДНК под воздействием ионизирующих излучений. Установлено, что данные соединения способны эффективно элиминировать радиационно-индуцированные долгоживущие радикалы белков. Природные пуриновые соединения проявляют радиационно-модифицирующие свойства при воздействии летальных и сублетальных доз ионизирующего излучения, причем наиболее существенный эффект наблюдается при введении их животным вскоре после облучения. Модифицирующий эффект природных пуриновых соединений при введении животным после воздействия ионизирующей радиации проявляется в результате их цитопротекторного действия и сопровождается снижением тяжести радиационно-индуцированной лейко-, тромбопении, нормализацией эритропоэза и более быстрым восстановлением повреждений ДНК.
Научно-практическая ценность. Впервые установлено, что первичной мишенью при воздействии тепла, видимого света, лазерных излучений (632,8; 1264 нм) и электромагнитного излучения крайне высоких частот с большой пиковой мощностью является растворенный в водной фазе кислород. Установлены физико-химические механизмы и закономерности генерации АФК под действием перечисленных выше физических факторов. Пусковым механизмом образования активных форм кислорода в воде и водных растворах при воздействии тепла, видимого света, лазерных излучений (632,8; 1264 нм) является переход кислорода из триплетного в синглетное состояние. Синглетный кислород в свою очередь может восстанавливаться до супероксид-анион радикала, протонированная форма которого дисмутирует с образованием перекиси водорода. Впервые установлен феномен люминеценции воды после воздействия на нее перечисленных выше физических факторов. Полученные результаты восполняют пробел в понимании физико-химических механизмов лежащих в основе воздействия различных физических факторов, применяемых при физиотерапевтических
процедурах, широко используемых в практической медицине. Полученные данные можно использовать в курсах лекций, посвященных образованию активных форм кислорода, окислительного стресса и воздействию неионизирующих излучений на биологические объекты. Полученные результаты открывают новые перспективы для дальнейших фундаментальных исследований в области радиационной биофизики и исследований свободно-радикальных состояний в биологии.
Разработан ряд способов модификации повреждающих последствий окислительного стресса. Полученные результаты могут быть использованы для оптимизации условий при терапии лучевой болезни, при радиотерапии онкологическиx заболеваний, для защиты профессионалов, имеющих дело с повышенными радиационными нагрузками, в ситуациях устранения радиационных аварий, для экипажей современных авиалайнеров, летающих на больших высотах (в условиях повышенного радиационного фона), для предотвращения патологических последствий воздействия ионизирующего излучения для населения при медицинских обследованиях с использованием рентгеновского излучения, а также в случае проведения террористических актов с использованием радиоактивных материалов. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 6-14-й конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002-2011), на VI-IX Международных симпозиумах «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2004, 2006, 2008, 2010), на Международной конференции «Высокоинтенсивные физические факторы в биологии, медицине, сельском хозяйстве и экологии» (Саров, 2004), на Международной научно-технической конференции «Медэлектроника. Средства медицинской электроники и новые медицинские технологии» (Минск, 2004), на III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2004), на Съездах по радиационным исследованиям (Москва, 2006, 2010), на Всероссийских конференциях «Биоантиоксидант» (Москва, 2006, 2010), конференции «Медицинская биоинженерия - 2007» (Пущино, 2007), на Международной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2008, 2011), на Международной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2008), на Международной конференции «Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии» (Днепропетровск, 2008), на XI-X международных конференциях «Человек и Космос» (Днепропетровск, 2009-2010), на VIII-IX Конференциях, посвященных дню космонавтики (Москва, 2009-2010), на V Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2009), на международной конференции «Rusnanotech'09» (Москва, 2009), на конференции «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2009-2011), на международной конференции «Нанобиофизика: Фундаментальные и прикладные аспекты» (Харьков, 2009), на III Всероссийском конгрессе «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010), на III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010» (Москва, 2010), на Международной научной конференции «Психофизиологические и висцеральные функции в норме и патологии» (Киев, 2010), на Международной конференции «Современные проблемы радиобиологии» (Гомель, 2010-2011).
Материалы конференций опубликованы в виде тезисов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 100 работ, из них 2 монографии; 19 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ; 8 рецензируемых статей сборниках и 71 тезис докладов.
Финансовая поддержка. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Минобразования (РФ Е00-6.0-293), РФФИ (00-04-48124, 03-04-49210-а, 04-04-97283- р2004-наукоград_а, 07-04-00406-а, 10-04-00800-а, 10-04-00949-а), Фонда содействия отечественной науке (2005), «Фундаментальные науки - медицине» (2004), Президента РФ (МК-104.2010.4.), Гос. контракт (№ 24.431.10.0.).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 270 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (3 главы), методической части, изложения полученных результатов и их обсуждения (4 главы), заключения, выводов, списка цитируемой литературы (737 источников). Работа иллюстрирована 77 рисунками и содержит 23 таблицы.
