Введение к работе
Более 50 лет тому назад, вскоре после изобретения лазеров возникла и стала развиваться новая медицинская технология лечения широкого круга различных заболеваний - лазерная терапия, однако молекулярные механизмы стимулирующего действия лазеров до сих пор до конца не были изучены. В частности оставались недоказанными предположения о фотореактивации супероксиддисмутазы и об активации дыхательной цепи митохондрий под действием лазерного и светодиодного облучения. Цель исследования
Целью данной работы было изучение молекулярных механизмов биостимулирующего действия лазерного и светодиодного облучения на активность СОД, на функцию изолированных митохондрий, а также разработка методики сравнения фотосенсибилизаторов для их использования в лазеротерапии. Задачи исследования
-
Разработать новую методику определения активности СОД и апробировать её при работе в модельных системах (водные растворы СОД и миметиков СОД) и в работе с образцами биологических жидкостей (плазма, гемолизат эритроцитов и суспензия митохондрий).
-
Осуществить проверку литературных данных об инактивации Cu-Zn супероксиддисмутазы (СОД) в кислой среде, а также в присутствии пероксида водорода, и ее фотореактивации под действием красного света с использованием разработанного и уже известных методов анализа активности СОД.
-
Изучить влияние лазерного и светодиодного облучения на функцию изолированных митохондрий (скорость дыхания при окислительном фосфорилировании, коэффициент дыхательного контроля и мембранный потенциал).
-
Изучить влияние оксида азота (N0) и последующего лазерного и светодиодного облучения на функцию изолированных митохондрий.
-
Изучить влияние N0 и лазерного и светодиодного облучения на скорости переноса электронов во И-Ш и IV комплексах дыхательной цепи митохондрий.
-
Разработать методику оценки активности новых сенсибилизаторов для лазеротерапии, основанную на эффективности фотосенсибилизированной пероксидации липидов в биологических (митохондриальных) мембранах.
Научная новизна
При проведении данного исследования была разработана новая методика определения активности СОД, а также миметиков СОД. Изучено действие новых миметиков СОД (медной модели СОД и комплексных соединений N-ацетил-L- цистеина с ионом Со(И), Со(Ш) и Zn(II)), как в модельной системе, так и в ткани. Впервые проведено сравнение действия НИЛИ разных участков оптического спектра на функцию интактных митохондрий в одинаковом интервале доз. Исследовано действие облучения на митохондрии, дыхательная цепь которых ингибирована низкими концентрациями оксида азота. Установлено, что действие синего света разрушает нитрозильные комплексы цитохром с оксидазы в митохондриях (при физиологических концентрациях оксида азота). Предложена методика сравнения активности фотосенсибилизаторов по их способности вызывать перекисное окисление липидов в митохондриях. Практическая значимость
Результаты исследований действия лазерного и светодиодного облучения на митохондрии вносят вклад в фундаментальную науку; полученные закономерности вошли в программу обучения студентов Факультета Фундаментальной медицины МГУ и Медико-биологического факультета РГМУ. Разработанная методика определения активности супероксиддисмутазы может существенно снизить стоимость анализов в экспериментальных и
клинических исследованиях. При создании новых сенсибилизаторов для фотодинамической терапии может быть использована разработанная в диссертации методика оценки их активности. Положения, выносимые на защиту
-
Предположение о том, что при закислении окружающей среды до рН 5,9-6,0 происходит фотоинактивация Си -Zn-СОД, а под действием красного света лазеров происходит фотореактивация (Горбатенкова, Е.А., Азизова и сотр. Биофизика, 1988), в наших опытах не подтвердилось. Нами была разработана методика определения активности СОД и миметиков СОД в системе кобальт/пероксид водорода/люцигенин; с использованием этого, а также других методов было показано, что инактивация Cu,Zn-COfl происходит только при рН, ниже 4, и также при инкубации с пероксидом водорода, но при этом воздействие облучения с диной волны 650 нм не приводило к восстановлению активности СОД.
-
Было показано, что наряду с повреждающими действием интенсивного света в синей, красной и зеленой области спектра, которое особенно выражено при высоких дозах облучения, имеет место стимулирующее действие света на перенос электронов в дыхательной цепи митохондрий при действии синего света (7-12%).
-
Важным механизмом биостимулирующего действия лазерного облучения служит фотолиз NO-комплексов переносчиков электрона в дыхательной цепи. Под действием синего света, происходит возрастание скорости переноса электронов в митохондриях, дыхательная цепь которых была ингибирована низкими концентрациями оксида азота (300 нм).
-
Основной мишенью интенсивного света служит, по нашим данным, комплекс N0 с цитохром с оксидазой. В отсутствие NO в среде, ни в одном случае не происходило изменений скорости переноса электронов 11—111 и IV комплексом дыхательной цепи под действием зеленого и красного света, напротив, скорость восстановления цитохрома с на участке 11-Ш
комплексов дыхательной цепи под действие синего света снижалась (на 30% при дозах 3-31 Дж/см2). В то же время активность IV комплекса, ингибированного на 50% оксидом азота, восстанавливалась под действием света (на 30% при длине волны 442 нм и дозе 3 Дж/см2). 5. Разработана методика оценки активности ФС для фотодинамической терапии, основанная на способности фотосенсибилизаторов (ФС) вызывать перекисное окисление липидов в биологических (митохондриальных) мембранах. При этом активность ФС убывает в ряду фотодитазин, темопорфин, фотолон. Внедрение результатов исследования
Результаты исследования (а именно: методика определения СОД, фотолиз нитрозильных комплексов цитохром с оксидазы в митохондриях, сравнение активности фотосенсибилизаторов) являются составной частью лекционных курсов кафедры медицинской биофизики ГУНУ ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры медицинской биофизики медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России. Апробация
Основные результаты диссертации были представлены в устных, а также тезисах 5 конференций, среди которых: 15-ый международный конгресс «Лазер Хельсинки-2010» (Хельсинки, 2010); Пироговская студенческая научная медицинская конференция (Москва, 2011); 9-я Международная специализированная выставка по аналитической химии «Аналитика Экспо» (Москва, 2011); 35-ая Международная научно-практическая конференция «Применение лазеров в медицине и биологии (Харьков, 2011); 7-ая национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2011).
Диссертационная работа апробировала 11 ноября 2011 г. на совместном
заседании кафедры медицинской биофизики ГУНУ ФФМ МГУ имени
М.В. Ломоносова и кафедры и отдела медицинской биофизики МБФ ГБОУ
ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России.
Публикации
В ходе выполнения диссертационной работы по материалам исследований
были опубликованы 5 статей (в том числе 3 в международной печати), а также
5 тезисов конференций.
Объем и структура работы
