Введение к работе
Актуальность темы
Одним из важных фундаментальных открытий последних десятилетий является обнаружение влияния растворов биологически активных веществ (БАВ) в низких (включая пикомолярные) и сверхнизких (фемтомолярные и ниже) концентрациях на биологические процессы. Эффекты сверхмалых доз (СМД) были зарегистрированы в экспериментах с веществами различной химической природы и биологического действия: гормонами, антиоксидантами, противоопухолевыми агентами, иммуномодуляторами и др. (Бурлакова, 1986; Ашмарин, 1992; Зайцев, 1993; Bonavida, 1991; Doutremepuich, 1991; Benveniste, 1988; Ямсков, 1999) на системах с различным уровнем биологической организации - от макромолекул и клеточных структур, до целых организмов и популяций. Однако, несмотря на большой объем накопленных за десятилетия экспериментальных данных, до сих пор не создано единой теории, способной объяснить подобные явления. Тем не менее, был выявлен ряд общих закономерностей, характерных для эффектов разнообразных БАВ с СМД (РХЖ, 1999). Наличие подобных закономерностей, возможно, связано с общностью критических мишеней действия БАВ. В качестве последних могут выступать плазматические мембраны клеток (ПМ), поскольку в них сосредоточены важнейшие регуляторные системы, отвечающие за функционирование клетки: системы вторичных посредников (циклических нуклеотидов и фосфоинозитидного цикла), обладающие свойствами каскадного усиления сигнала при проведении его в клетку (Nishizuka, 1984; Yoshimasa, 1987; Taylor, 1986) и система регуляции пероксидного окисления липидов (ПОЛ), определяющая состояние липидного бислоя (Владимиров, 1972; Бурлакова, 1967). В силу своей общей локализации данные регуляторные системы влияют друг на друга (Yoshimasa, 1987; Bouvier, 1990; Mal'tseva, 1997), поэтому вещества, модифицирующие состояние одной из них, могут индуцировать изменения и в других.
Ранее было зафиксировано влияние СМД таких БАВ, как природный антиоксидант а-токоферол, пептид тиролиберин и форболовые эфиры, на основные параметры системы ПОЛ, в частности структуру мембран, и сделаны предположения о механизмах действия этих агентов в СМД (Жерновков, 2007; Белов 2011; Пальмина, 1992). Все эти вещества природного происхождения, т.е. в норме входят в состав биологических систем в физиологических концентрациях. Для ответа на вопрос о том, насколько общими являются механизмы действия разнообразных БАВ в СМД, целесообразно проведение аналогичных исследований с синтетическими веществами, например с синтетическим антиоксидантом. В качестве такого БАВ нами был выбран фенозан калия (3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил пропионат калия), обладающий широким спектром биологического действия, в том числе и в СМД.
Целью данной работы являлось выяснение возможных механизмов действия фенозана калия (ФК) в интервале концентраций 10" -10" М на плазматические мембраны клеток печени мышей in vitro посредством изучения закономерностей действия данного вещества на структуру различных липидных регионов и термодинамические характеристики мембраносвязанных белков, а также на структурно-динамическое состояние, размеры и форму липосом, приготовленных из суммарных липидов ПМ.
Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
-
Изучить влияние ФК в концентрациях 10-10" М на микровязкость глубоколежащих областей (-20-22 А) и параметр упорядоченности поверхностных областей (~8 А) липидного бислоя ПМ и липосом, приготовленных из суммарных липидов ПМ, при постоянной температуре 20С методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), с использованием в качестве зондов стабильных свободных радикалов 16- и 5-доксилстеариновых кислот, обозначаемых соответственно С16 и С5, нитроксильные фрагменты которых локализуются в указанных липидных областях. Получить зависимости доза-эффект.
-
Исследовать влияние отдельных концентраций ФК, оказавших наибольший эффект на структурно-динамические параметры липидов при 20С, на положение, ширину и эффективную энергию активации термоиндуцированных структурных переходов в различных областях липидного бислоя мембран и липосом в диапазоне температур 12-42С методом ЭПР.
-
Определить изменения термодинамических характеристик суммарных белков, входящих в состав ПМ, индуцированные ФК в концентрациях, оказавших максимальное и нулевое влияние на липидную компоненту мембран методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).
-
Изучить действие ФК в концентрациях 10-10" М на размеры и форму липосом, приготовленных из липидных экстрактов ПМ, методами динамического светорассеяния (ДРС) и атомно-силовой микроскопии (АСМ).
-
Провести корреляцию между изменениями структурных характеристик ПМ, индуцированных растворами ФК и физико-химическими свойствами этих растворов.
Научная новизна В данной работе впервые показано, что синтетический антиоксидант ФК в экспериментах in vitro в широком диапазоне концентраций, включающем сверхмалые (10" -10" М), существенно модифицирует структурно-динамические параметры различных липидных регионов ПМ, выделенных из печени мышей, и липосом, приготовленных из липидных экстрактов ПМ. Зависимость эффекта от дозы ФК имеет бимодальный характер с максимумами в интервале «физиологических»
концентраций (10" -10" М) и СМД, разделенными «мертвыми зонами», где эффект отсутствует. Принципиально дозовые зависимости для ФК не отличаются от таковых, полученных для веществ природного происхождения, в частности а-ТФ (Белов, 2011), за исключением того, что максимумы эффектов ФК в СМД в поверхностных и глубоколежащих областях липидов ПМ наблюдаются при действии разных концентраций препарата: (10"13-10"15М) - в поверхностных; (10"18-10"19 М) - в глубоколежащих.
Впервые обнаружено, что ФК в концентрациях, вызывающих максимальные изменения в параметрах микровязкости и упорядоченности липидной компоненты, индуцирует появление дополнительного термоиндуцированного структурного перехода липидов в области физиологических температур (40-42С).
Впервые показано, что эффект СМД ФК сохраняется при полном отсутствии белков в системе. Закономерности, наблюдаемые при действии СМД ФК на ПМ и липосомы, приготовленные из липидньгх экстрактов ПМ, полностью совпадают. Эти результаты позволяют полагать, что первичной мишенью действия ФК в СМД являются именно липиды и механизм данного феномена не обусловлен взаимодействием с рецепторными белками.
Впервые установлено, что эффект ФК в области СМД обусловлен физико-химическими свойствами «наноассопиатов», образованных из молекул ФК и воды. Основные положения, выносимые на защиту
1. ФК способен модифицировать структурно-динамическое состояние гидрофильных
с 1-і
и гидрофобных липидньгх регионов ПМ как в «физиологических» дозах (10-10"' М), так и в СМД (10"13-10"15 М, 10"18-10"19 М, соответственно). Концентрационная зависимость эффекта имеет бимодальный характер, свойственный веществам, проявляющим активность в СМД.
-
ФК в широком диапазоне концентраций, включающем СМД, способен оказывать влияние на температуры и энтальпии переходов в белках ПМ. Наибольшее воздействие наблюдается для доз 10" М и 10"1S М, что соответствует наибольшим изменениям в микровязкости глубоколежащих областей липидов ПМ (-20-22 А).
-
ФК способен модифицировать структурно-динамическое состояние гидрофильных и гидрофобных липидньгх регионов липосом, приготовленных из суммарных липидов ПМ, подобно влиянию на мембраны. Эффекты СМД ФК (10" -10" М, 10"
-10" М) сохраняются в отсутствии белковой фракции, следовательно, первичной мишенью действия препарата являются липиды.
4. Изменения, индуцируемые в липосомах ФК в концентрациях 10-10"' М и 10-10"
М приводят к увеличению их гидродинамического диаметра и изменению формы от шарообразной к палочкообразной.
5. Корреляция между структурно-динамическими изменениями, индуцированными СМД ФК в ПМ и липосомах, и дозовыми зависимостями физико-химических свойств разбавленных водных растворов ФК позволяет сделать вывод о ключевой роли «наноассоциатов», состоящих из молекул ФК и воды, в механизме действия СМД.
Личный вклад автора Личный вклад автора состоял в подготовке образцов, проведении биофизических экспериментов, обработке и анализе полученных данных, формулировании положений и выводов, подготовке статей к опубликованию и участии в конференциях. Все изложенные в диссертации новые результаты получены автором лично или при ее непосредственном участии в подготовке и проведении экспериментов.
Научно-прикладное значение работы Данная работа является составной частью комплекса научных исследований проблемы действия БАВ в СМД. Полученные в работе выводы и используемые методологические подходы могут быть применены в её решении. В частности, изменение структурно-динамических характеристик биомембран и липосом может быть использовано в качестве чувствительной модели для скрининга БАВ, действующих в ультранизких концентрациях; снижения терапевтических доз препаратов, активных в СМД, при сохранении их эффективности и уменьшении вероятности побочных эффектов. Результаты о влиянии ФК в СМД на структуру и форму липосом могут быть полезны для разработки методов стабилизации липидных оболочек лекарственных препаратов.
Работа выполнена в лаборатории физико-химических основ регуляции биологических систем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук (ФГБУН ИБХФ РАН) в соответствии с научным направлением «Изучение механизмов и эффектов действия химических и физических факторов (в т.ч. в сверхмалых дозах и при низких интенсивностях излучения) на биологические системы различной степени сложности с целью создания новых протекторных средств и лекарственных препаратов». Работа поддержана Программой ОХНМ РАН «Химия и физико-химия супрамолекулярных систем и атомных кластеров».
Апробация диссертационной работы Материалы работы были представлены в России на: ежегодных молодежных конференциях ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, ноябрь 2007-2010; Ежегодной конференции МФТИ, Долгопрудный, 2007; VII Международной конференции «Биооксидант», Москва, октябрь 2010; I международной конференции МФТИ БФК «Северный», Москва, май 2011; Всероссийской конференции с
международным участием «Спектроскопия и томография электронного парамагнитного резонанса в химии и биологии», Москва, октябрь 2011; Всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики», Черноголовка, июнь 2011; VI Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, июль 2012; Международной конференции «Структура воды: физические и биологические аспекты», Санкт-Петербург, сентябрь 2013.
Результаты были представлены на зарубежных конференциях: 50-th International Conference on the Bioscience of Lipid, Regensburg, Germany, August 2009; FEBS Advanced Course "Lipid Signaling and Disease", Ortona, Italy, September 2009; Issfal Conference. Maastricht, The Netherlands, May 2010; 8-th Euro Fed Lipid Congress, Munich, October 2010; 9-th Euro Fed Lipid Congress, Rotterdam 2011; 52-nd International Conference on the Bioscience of Lipids, Warsaw, Poland, August 2011; VI Conference on the Physics, Chemistry and Biology of Water, Vermont, USA, October 2011; International Workshop «Lipids: from Lipidomics to Disease and Green Energy», Spetses, Greece, August 2012; 10-th Euro Fed Lipid Congress, Cracow, Poland, September 2012.
Публикации в рецензируемых журналах
Основные положения диссертационной работы опубликованы в 16 печатных работах, из которых 4 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень Высшей аттестационной комиссии, 12 публикаций в сборниках научных трудов и тезисов докладов на российских и международных конференциях.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, 4 глав, основных выводов и списка литературы. Работа изложена на 160 страницах, иллюстрирована 42 рисунками и 10 таблицами. Библиография включает список из 257 работ.
