Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Гликозидгидррлазы
1.1 Современная классификация гликозидгидролаз 16
1.2 Каталитические механизмы действия гликозидгидролаз 17
1.3 Гликозидгидролазы 27 семейства, а-галактозидазы 21
1.4 Р-Галактозидазы 24
ГЛАВА 2. Методы рентгено структурного анализа макромолекул
2.1 Кристаллизация белка 26
2.2 Синхротронное рентгеновское излучение 31
2.3 Приборы и методы сбора данных в кристаллографии макромолекул 34
2.4 Методы решения фазовой проблемы для макромолекул 39
2.5 Недостатки метода изоморфного замещения: метод быстрой криодериватизации 46
2.6 Краткий обзор компьютерных программ, применяемых в работе 47
ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования
3.1 Очистка и кристаллизация а-галактозидазы из мицелярного гриба Trichoderma reesei 51
3.2 Окислительная активация а-галактозидазы 54
3.3 Очистка и кристаллизация р-галактозидазы из гриба Penicillium sp 55
3.4 Получение тяжелоатомных производных кристаллов белков и сбор дифракционных данных 57
3.5 Решение фазовой проблемы и построение кристаллографической модели а-галактозидазы и ее комплекса с D-галактозой 60
3.6 Решение структуры Р-галактозидазы и ее комплекса с D-галактозой 68
ГЛАВА 4. Кристаллографические модели и механизм действия изучаемых ферментов
4.1 Качество модели и описание структуры а-галактозидазы из T.reesei 71
4.2 Сравнение структур а-галактозидазы и других гликозидгидролаз 76
4.3 Связывание ингибитора и строение активного центра а-галактозидазы ..77
4.4 Каталитический механизм действия а-галактозидазы из T.reesei 82
4.5 Описание структуры Р-галактозидазы из Penicillium sp 87
4.6 Сравнение структур Р-галактозидаз из Penicillium sp., Е.coli и Т.thermophilus 93
4.7 Активный центр Р-галактозидазы 96
Заключение 98
Список литературы 103
- Каталитические механизмы действия гликозидгидролаз
- Приборы и методы сбора данных в кристаллографии макромолекул
- Получение тяжелоатомных производных кристаллов белков и сбор дифракционных данных
- Связывание ингибитора и строение активного центра а-галактозидазы
Введение к работе
Актуальность проблемы
Развитие'биотехнологии сегодня является приоритетной задачей не
только для повышения эффективности технологии, но, не в последнюю очередь, для решения экологических проблем. В отличие от химического производства, сопровождаемого вредными и опасными выбросами, биотехнологические процессы используют, как правило, биологические катализаторы химических реакций - ферменты. Это направление предполагает применение, как природных ферментов, так и их аналогов, свойства которых могут быть изменены в нужном направлении при помощи методов белковой инженерии.
В современной биотехнологической промышленности используются различные ферменты, в том числе гидролазы, обеспечивающие реакции расщепления различных субстратов до мономеров. Среди гидролаз, гликозидгидролазы (гликозидазы, К.Ф. 3.2.1.), катализирующие расщепление гликозидных связей, относятся к одной из самых широко применяемых и изучаемых групп ферментов. Достаточно упомянуть, что ни одно современное целлюлозно-бумажное производство не обходится без применения гликозидгидролаз. Помимо этого, гликозидазы оказались чрезвычайно эффективным инструментом энзиматического синтеза многих соединений, используемых в фармацевтике и медицине. Такое их
применение основано на способности, при определенных условиях, обращать
реакции гидролиза и катализировать реакцию
трансгликозилирования - образования новых гликозидных связей. На сегодняшний день описано более сотни различных экзо-гликозидаз (действующих на концевые углеводные остатки олиго- и полисахаридов), выделенных из широкого круга организмов и успешно примененных в ферментативном синтезе новых биологически активных веществ.
Энзиматический гидролиз и синтез имеют значительные преимущества перед традиционными методами органической химии, так. как позволяют получать необходимые соединения практически в одну стадию. Кроме того, при использовании реакций ферментативного синтеза удается получать строго определенные стереоизомеры с высоким выходом продуктов. Совокупность знаний о конкретном ферменте позволяет целенаправленно изменять его структуру и свойства в соответствие с научными или производственными задачами. Эффективное применение гликозидаз требует тщательного изучения их свойств, а также знаний пространственной трехмерной структуры их активного центра. Часто, информация о структуре белка и его комплекса с ингибиторами является необходимым условием для создания новых биологических препаратов и лекарств. Такой подход, от знания структуры белка —к созданию новых медицинских препаратов, названный рациональным конструированием лекарств (rational drug design), в последнее десятилетие послужил мощным стимулом для развития структурной биофизики.
Основным методом изучения трехмерной пространственной структуры ферментов и их активных центров является рентгеноструктурный анализ. Банк данных известных на сегодня белковых структур (Protein Data Bank) содержит около 12000 файлов с координатами атомов трехмерных структур белков й их комплексов с лигандами. Из них около 80% всех белковых структур получены методом дифракции рентгеновского излучения и только около 20% - методом ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Рентгеноструктурный анализ белка включает ряд необходимых стадий.
Первым этапом определения структуры является получение чистого препарата, выращивание кристаллов исследуемого белка и получение дифракционной картины рентгеновского рассеяния на кристаллах. Второй этап представляет собой поиск распределения электронной плотности в кристалле по дифракционной картине с применением разнообразных компьютерных математических методов. Конечный этап - это построение и уточнение кристаллографической атомной модели исследуемой структуры.
Интенсивность каждого отдельного дифракционного рефлекса пропорциональна квадрату модуля структурного фактора. Поэтому, измерив интенсивности рефлексов, можно получить значения модулей структурных факторов, но не фаз, необходимых для расчета электронной плотности. Принципиальная невозможность определения фаз из эксперимента является центральной проблемой в рентгеноструктурном анализе, как белков, так и малых молекул с неизвестной пространственной структурой. Основными
методами решения фазовой проблемы для макромолекул в настоящее время являются:
Метод множественного изоморфного замещения (Perutz, 1956; Blow & Crick, 1959)
Метод молекулярного замещения (Rossmann, 1972)
Метод мультиволновой аномальной дифракции (Hendrickson, 1991)
Все три метода активно используются по отдельности или в комбинации
одного с другим. Заметим, что метод молекулярного замещения требует
наличия 3-х мерной структуры, гомологичного белка или, по-другому,
поисковой модели структурно гомологичной исследуемому белку, причем,
среднее расстояние между соответствующими атомами двух белков не
должно быть большим. Метод мультиволновой аномальной дифракции
требует съемки с изменением длины волны падающего рентгеновского
излучения и введения в кристалл аномально рассеивающих атомов, что не
всегда выполнимо.
Метод изоморфного замещения является в настоящее время основным
для решения неизвестных белковых структур. Процесс расшифровки
включает сбор дифракционных данных не только от кристалла нативной
молекулы, но также от одного или нескольких кристаллов ее тяжелоатомных
изоморфных производных. Кристаллы производных должны принадлежать
той же пространственной группе, что и кристалл исходной белковой
молекулы, а параметры элементарной ячейки не должны сильно различаться.
В случае успеха, положения тяжелых атомов в полученных кристаллах могут
быть определены, и фазовая проблема может быть решена из сравнения
интенсивностей рефлексов от нативного кристалла и одной или нескольких
тяжелоатомных производных. Часто, даже после получения белковых
кристаллов, введение в кристалл тяжелых атомов является сложной
проблемой из-за нарушения изоморфизма кристалла нативного белка и
кристалла его тяжелоатомной производной. По сути, большинство
используемых тяжелых атомов (Pt, Hg, U, Au и др.) при низкой концентрации
и длительной экспозиции присоединяются к тем или иным реакционным
группам белка и, таким образом, модифицируют исследуемую молекулу
(Blundell & Jonson, 1976).
Метод быстрой криодериватизации (fast cryosoaking), предложенный
Дотером (Dauter et al., 2000), использует явление замещения молекул
кристаллизационной воды на галоген (I, Вг) при непродолжительной
экспозиции белкового кристалла в маточной жидкости с концентрированной
солью галогена и криопротектором, препятствующим кристаллизации воды
(например, глицерином). В таких условиях, кристалл насыщается тяжелыми
атомами галогенов, но реакция присоединения в белке пройти не успевает, а
наличие криопротектора позволяет немедленно заморозить кристалл в токе
холодного азота и использовать для сбора данных. При этом, если
использовать рентгеновское излучение с длиной волны близкой к границе
поглощения тяжелого атома, когда возможна регистрация аномального
сигнала, то использование современных компьютерных методов позволяет
локализовать до 50 (!) позиций связывания тяжелых атомов в макромолекуле.
Метод не свободен от недостатков, однако, значительно упрощает и ускоряет получение тяжелоатомных производных. В представленной работе модифицированный метод быстрой криодериватизации являлся основным средством, благодаря которому были решены две неизвестные структуры гликозидгидролаз из низших грибов T.reesei и Penicilium sp.
Цели и задачи исследования
Современная классификация всех гликозидгидролаз в 94 семейства,
выполненная Хенриссатом (Henrissat, 1991) на основании гомологии их
последовательностей и стереохимии катализируемой реакции оказалась
весьма продуктивной. Дело в том, что ферменты из одного семейства, даже с
разными каталитическими свойствами, оказались структурно
гомологичными, то есть имеющими идентичный тип укладки'полипептидной
цепи, что было показано на примере нескольких близкородственных
гликозидгидролаз, для которых известна трехмерная структура. Тем не
менее, таблица Хенриссата все еще содержит много "белых пятен" в
отношении структуры и детального каталитического механизма действия
ферментов из отдельных семейств. Перед началом данной работы,
отсутствовали данные о трехмерных структурах представителей 27-го и 35-го
семейств гликозидгидролаз. Настоящая работа посвящена решению
трехмерных структур а-галактозид азы из Trichoderma reesei (GHF 27) и р-
галактозидазы из Penicillium sp. (GHF 35), а также их комплексов с
ингибиторами. Цель такого исследования - выяснение механизма работы
этих ферментов на молекулярном уровне с перспективой последующей модификации их свойств методами белковой инженерии. Интересный феномен окислительной активации, обнаруженный в а-галактозидазе из T.reesei, когда каталитическая активность фермента возрастала в 12 раз при химическом окислении, также мог быть объяснен только на основании решения трехмерной структуры.
Очевидно, что единственным методом, отвечающим на поставленные вопросы, является рентгено структурный анализ. Отсюда вытекают конкретные задачи данного исследования:
Получить кристаллы а-галактозидазы из Т. reesei и Р-галактозидазы из Penicillium sp., а также комплексы ферментов с ингибиторами.
Решить трехмерные пространственные структуры и на основании полученных данных выявить строение активных центров и объяснить механизм действия ферментов.
Прояснить механизм окислительной активации а-галактозидазы из Trichoderma reesei.
Сравнить структуры а- и (3-галактозидаз для выяснения аномерной специфичности этих ферментов.
Изучить углеводную компоненту рассматриваемых ферментов.
Получить информацию для последующей модификации ферментов методами сайт-направленного мутагенеза для белковой инженерии.
Научная новизна полученных результатов
Впервые решены трехмерные пространственные структуры представителей 27-го и 35-го семейств гликозидгидролаз -а-галактозидазы из T.reesei и |3-галактозидазы из Penicillium sp., а также структуры комплексов двух изучаемых ферментов с ингибиторами.
Все полученные трехмерные структуры депонированы в Белковый Банк Данных (Protein Data Bank).
На основании построенных кристаллографических моделей объяснен молекулярный механизм, катализа двух ферментов.
Определены причины интересного феномена - окислительной активации а-галактозидазы из T.reesei.
В процессе решения структур двух описываемых ферментов успешно применен модифицированный метод быстрой криодериватизации с использованием эффекта аномального рассеяния для решения фазовой проблемы, впервые предложенный Дотером (Dauter et al., 2000)
Впервые структура белка - а-галактозидазы из T.reesei - была решена комбинацией метода быстрой криодериватизации и метода SIRAS, используюшего всего одной катионную (Cs1+) тяжелоатомную производную.
Впервые методом быстрой криодериватизации была решена фазовая проблема для структуры белка с массой более 120000 Да-Р-галактозидазы из Penicillium sp.
Качество рентгеноструктурных данных' позволило изучить структуру углеводной компоненты двух исследуемых гликопротеинрв.
На основании рентгеноструктурных данных показаны причины аномерной селективности двух гликозидаз.
Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание особенностей структуры и механизма действия гликозидгидролаз.
Апробация работы
Материалы работы были представлены, на следующих международных семинарах и конференциях:
V Congresso Ibero-Americano de Biofisica, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, 12 a 15 de outubro de 2003.
XVI Reuniao da SBCr, Campus da USP/Sao Carlos, 16 a 19 de marco 2003
VI Semenario Brasileiro de Tecnologia Enzimatica, ENZITEC 2004, Rio de Janeiro, 5 a 7 de abril de 2004.
1st Latin American Protein Society Meeting, Angra dos Reis, RJ, November 8-12,2004.
По теме диссертации опубликовано 9 статей в рецензируемых научных журналах.
Основные положения, выносимые на защиту
Основные положения, выносимые на защиту, приведены в разделе
«Заключение».
Благодарност и
Я хочу выразить признательность и огромную благодарность своему научному руководителю, профессору Владимиру Петровичу Плахтию, одному из инициаторов рентгеноструктурных' исследований протеинов в ПИЯФ РАН, за постоянную поддержку и помощь в подготовке данной работы.
Я выражаю благодарность всем сотрудникам лабораторий энзимологии и биофизики макромолекул Отделения молекулярной и . радиационной биофизики, а также сотрудникам лаборатории физики кристаллов Отделения нейтронных исследований ПИЯФ РАН за многолетнее плодотворное сотрудничество, дружескую поддержку и помощь в работе.
Отдельно хочу выразить особую благодарность моему трагически погибшему коллеге Кириллу Николаевичу Неустроеву и отметить его участие в работе.
Я приношу благодарность нашим заграничным коллегам профессору Игорю Владимировичу Поликарпову за сотрудничество и организацию работ в Бразильском центре синхротронного излучения, доктору Рональдо Наженю и сеньоре Адриане Рохас, (Институт физики Сан-Карлос, Университет Сан-Паулу, Бразилия), а также профессору Майклу Аранду (Институт токсикологии, Вюрцбургский Университет, Германия) за плодотворное сотрудничество по теме данной работы.
Работа выполнена при финансовой поддержке
Программы фундаментальных исследований «Физико-химическая биология» Президиума РАН,
Российского фонда фундаментальных исследований - РФФИ (проекты 03-04-48756 и 03-04-49741),
Национального совета по научному и технологическому развитию (Бразилия) - CNPq (Conselho Nacional de Desenvolmento Cientifico e Tecnologico), гранты 302125/02-7 и 300220/96-0,
Фонда поддержки исследованиям в штате Сан-Паулу (Бразилия) -FAPESP (Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo), гранты 99/03387-4, 02/14208-8 и 01/07014-0.
Каталитические механизмы действия гликозидгидролаз
К гликозидгидролаз ам относят ферменты, проявляющие каталитическую активность в отношении гликозидной связи - ковалентной химической связи углеводного остатка с другой химической группой. Традиционная номенклатура гликозидгидролаз, подобно всем известным на сегодня ферментам (Enzyme nomenclature, 1992), . основана на их субстратной специфичности и, отчасти, на молекулярном механизме их действия. Такая общая классификация не отражает структурных особенностей и эволюционных взаимоотношений ферментов, поскольку она основана исключительно на особенностях ферментативной реакции, катализируемой тем или иным ферментом.
В начале 1990-х, в связи с накоплением данных о структуре и функциях ферментов, активных по отношению к гликозидной связи, Хенриссат предложил радикально новый подход к классификации (Henrissat, 1991). В основу новой классификации гликозидгидролаз была положена гомология известных к этому моменту 300 АК последовательностей белков. Первоначально, гликозидгидролазы были разделены на 36 семейств. В дальнейшем, определение новых аминокислотных последовательностей ферментов привело к открытию новых семейств. В настоящее время несколько тысяч известных последовательностей гликозидгидролаз и родственных ферментов (трансгликозидазы, трансферазы и т.д.) сгруппированы в 94 семейства (Countinho & Henrissat, 1999; Countinho & Henrissat, 2000). Основным признаком семейства в данной классификации стала гомология не менее 100 АК остатков в выровненных первичных структурах белков. Вторым важным признаком стал одинаковый стереохимический результат каталитического гидролиза гликозидной связи: с обращением или сохранением конфигурации аномерного углеродного атома субстрата в месте разрыва гликозидной связи. Правомерность классификации Хенриссата особенно ярко проявилась при сравнении известных трехмерных структур и механизмов действия гликозидгидролаз. Оказалось, что ферменты из одного семейства, даже с разными каталитическими свойствами, структурно гомологичны и имеют идентичный тип укладки полипептидной цепи (Mizuguchi etal., 1998). Это обстоятельство позволило использовать методы гомологичного компьютерного моделирования для получения приблизительных трехмерных структур внутри каждого семейства гликозидаз, если известна, по крайней мере, одна структура (Strohmeier et ah, 2004).
Как сейчас установлено, представители 27-го и 35-го семейств гликозидгидролаз являются так называемыми «сохраняющими» гликозидазами (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/), т.е. и субстрат, и продукт ферментативной реакции имеют одинаковую конфигурацию аномерного атома углерода (Sinnott, 1990; Jacobson etal, 1994, 1995; Withers, 1995). Механизм действия «сохраняющих» гликозидаз (Рис. 1), впервые предложенный еще 50 лет назад (Koshland, 1953) и общепринятый сегодня (McCarter& Withers, 1994), представляет собой реакцию двойного замещения, где аномерный углеродный атом субстрата подвергается двум последовательным нуклеофильным атакам (McCarter & Withers, 1994; Davies & Henrissat, 1995).
На первой стадии гликозилирования атом кислорода каталитического аминокислотного остатка (нуклеофила), участвующего в каталитическом акте, атакует электрофильный атом СІ гексозного кольца с образованием переходного состояния типа карбоксониевого иона с последующим разрывом гликозильной связи и образованием ковалентно-связанного промежуточного комплекса фермент-субстрат. На второй «симметричной» стадии дегликозилирования происходит вторая нуклеофильная атака аномерного атома углерода кислородом молекулы воды, депротонированной вторым аминокислотным остатком (кислотно-основным катализатором). На этой стадии образуется продукт реакции и регенерируется фермент. Гликозидгидролазы, обращающие аномерную конфигурацию субстрата («обращающие» гликозидгидролазы) катализируют гидролиз гликозидной связи по другому механизму, который, как правило, включает только одну нуклеофильную атаку (McCarter & Withers, 1994; Rye & Withers, 2000; Zechel 8c Withers, 2000). В этом случае одна из карбоксильных групп в активном центре фермента действует как основный катализатор, активируя молекулу воды, которая, в свою очередь, осуществляет нуклеофильную атаку аномерного атома углерода субстрата. Карбоксильная группа второго каталитического остатка протонирует уходящую группу, завершая акт катализа. Такой одностадийный механизм приводит к обращению аномерной конфигурации субстрата. Ранее было показано (McCarter & Withers, 1994), что две каталитических карбоксильных аминокислоты гликозидгидролаз находятся на противоположных сторонах гексозного кольца, содержащего гликозильную связь.
Приборы и методы сбора данных в кристаллографии макромолекул
Высокоинтенсивное синхротронное излучение повысило требования, предъявляемые к детектирующим устройствам. Очевидно, что первоначально используемая система, рентгеновская пленка-денситометр, не отвечала возросшим требованиям рентгеновского эксперимента. Помимо этого, рентгеновская фотопленка, как и разработанные позже газонаполненные многопроволочные двухмерные детекторы не имели достаточного динамического диапазона для использования на синхротроне (Helliwell, 1992). Проблему удалось решить, используя детекторы на основе запоминающих экранов (Image Plate detector), которые были разработаны в конце 80-х годов (Amemiya et aL, 1988; Tanaka & Katayama, 1990). Детекторы на основе запоминающих экранов работают как интегрирующие детекторы и в этом отношении напоминают фотопленку. Материал такого экрана представляет собой микрокристаллическую пленку BaFBr:Eu2+: на пластиковом основании. Способность такого флюорофора «запоминать» обусловлена присутствием соли, содержащей ионы Еи2+, наличием природных точечных дефектов в структуре микрокристаллов BaFBr и явлением фотоиндуцированной люминесценции. За счет ионизации при поглощении рентгеновского кванта, Еи2+ способен переходить в Еи3+, при этом получившиеся быстрые электроны могут либо обратно рекомбинировать с Еи3+, либо перейти в центры окраски (F-центры). F-центры образуются в позициях кристаллической решетки, где отсутствует атом галогена. Захваченный F-центром электрон переходит в метастабильное состояние со средним временем жизни несколько часов. При освещении видимым светом, электрон может покинуть F-центр и рекомбинировать с Еи3+ с излучением голубого света с длиной волны 390 нм. Важными факторами позволяющими использовать такой флюорофор для запоминающих экранов являются: 1. число F-центров, заселенных электронами пропорционально поглощенной дозе рентгеновского излучения; 2. интенсивность светового потока при фотоиндуцированной люминесценции пропорциональна числу F-центров, заселенных электронами. Конструктивно, детектор состоит из установленной нормально к падающему рентгеновскому пучку круглой пластины, представляющей собой собственно запоминающий экран, способный вращаться, а также сканирующей головки с гелий-неоновым лазером и фотоумножителем. Наибольшее распространение получили детекторы компании Marresearch (Рис. 3). Детектор позволяет регистрировать дифракционные картины до 345 6) коаксиальная трубка системы охлаждения. мм диаметром с разрешением до 100 мкм. Образец устанавливается на гониометрическую головку и юстируется при помощи встроенной телевизионной камеры. Коллиматор состоит из четырех пар щелей с диапазоном регулирования (5-0,01) мм. Все перемещения образца поперек пучка производятся при помощи шаговых двигателей с шагом 5 мкм. Характерный вид дифракционной картины белкового кристалла показан на Рисунке 4. Недостатком данных детекторов является относительно длительный период считывания информации (около 3 мин), когда прерывается процесс сбора данных. От этого недостатка свободны детекторы картины кристалла а-галактозидазы из T.reesei. на основе приборов с зарядовой связью (ПЗС). При попадании рентгеновского излучения на тонкий сцинтиляционныи экран происходит переизлучение в видимой области, которое регистрируется и запоминается фотоэлектронной матрицей, а затем отправляется непосредственно в память компьютера (Gruner, 1994). Быстродействие таких детекторов весьма высоко, например, характерное время считывания информации в детекторе Saturn-92 компании Rjgaku достигает 2,5 с, а чувствительность — 28 электронов на один квант рентгеновского излучения (www.rigaku.com). Одной из проблем кристаллографии макромолекул является слабая отражающая способность кристаллов и их разрушение при рентгеновском облучении. При использовании синхротронного излучения, радиационное разрушение заметно уменьшает область переданных импульсов, ухудшая разрешение восстановленной электронной плотности, даже при охлаждении до 4С. Поиск решения данной проблемы привел к созданию методов криогенного сбора дифракционных данных. Основное отличие кристаллов макромолекул от кристаллов малых молекул - это наличие большого количества кристаллизационной воды (30-70)%, которая при замерзании образует микрокристаллы льда, вызывающие дифракционные пятна и кольца. Для предотвращения этого было предложено использовать криопротекторы - вещества, препятствующие кристаллизации воды. В первых работах по глубокому охлаждению кристаллов криопротектором служил 2-метил-2,4-пентадиол (Haas & Rossman, 1970), позднее были применены глицерин и этиленгликоль. В настоящее время разработаны достаточно эффективные системы для охлаждения белковых кристаллов в потоке газообразного азота при температуре 100 К.
Получение тяжелоатомных производных кристаллов белков и сбор дифракционных данных
Одна из трудностей в белковой кристаллографии - это получение тяжелоатомных производных, приемлемых для решения фазовой проблемы. При введении атомов тяжелых металлов в кристалл белка, параметры элементарной ячейки изменяются. Чем сильнее изменения, тем большие ошибки возникают при определении положений и заселенностей тяжелого атома. Несколько меньше страдает от таких ошибок метод многоволновой аномальной дисперсии, так как сбор всех данных производится с одного кристалла. Но и этот метод требует введения в кристалл белка атомов, аномально рассеивающих рентгеновское излучение.
Метод быстрой криодериватизации, предложенный Дотером (Dauter et aL, 2000), позволяет значительно упростить и ускорить процедуру получения тяжелоатомной производной белка. Обычные методы введения атомов тяжелых металлов в кристалл белка предполагают длительную (дни, недели) экспозицию кристалла в солях тяжелых металлов при миллимолярных концентрациях. Химические реакции протекают при этих условиях весьма медленно, так как комплексные соединения тяжелых металлов, обычно используемые для получения производных, должны поменять координацию с ионных лигандов на определенные аминокислотные группы в белке. Наоборот, малые молекулы способны быстро диффундировать в кристалл белка.
Дотер предложил использовать соли галогенов - бромиды и иодиды, которые имеют значительный аномальный сигнал при длине волны порядка 1 Л (Dauter, Z. & Dauter, М., 2001). При высоких концентрациях (до 1 M/JI) часть упорядоченных молекул воды в белковом кристалле замещается аномально рассеивающими атомами. Было предположено, что соединения Cs1+ также могут использоваться для этой цели (Nagem et al., 2001). Удобство данного способа состоит в том, что получение производной происходит непосредственно во время инкубации кристалла в растворе криопротектора, и не требует дополнительных манипуляций. Дительность процедуры составляет от нескольких секунд до получаса, после чего кристалл замораживают и используют для сбора данных.
Пакеты программ DENZO и SCALEPACK (Otwinowski & Minor, 1997) предназначены для обработки дифракционных картин макромолекул полученных рентгеновскими-детекторами на основе запоминающих экранов или ccd-приборами. Каждая дифракционная картина приводится к единой шкале интенсивностей, интегральные интенсивности вычисляются суммированием плотности дифракционного пика в каждом пикселе в некоторой области, центр которой совпадает с центром пика. Плотность фона вычисляется суммированием значений фона в каждом пикселе в области окружающей дифракционный пик. Вводятся корректирующие поправки с учетом поляризации и фактора Лоренца, производится автоиндексация отражений. На выходе программы каждому отражению присваиваются Миллеровские индексы Ш, интегральная интенсивность I(hkl) и среднеквадратичная ошибка измерения o{hkl). В случае измерения аномального сигнала, пары Бейвута интегрируются раздельно.
Программа RSPS (Knight, 2000) позволяет поиск позиций тяжелых атомов в тяжелоатомной производной, используя разностный синтез Паттерсона. Поиск выполняется для каждой тестовой позиции на сетке, перекрывающей элементарную ячейку кристалла. Для тестовой позиции вычисляется функция Паттерсона и сравнивается с плотностями функции Паттерсона в точках, соответствующих предсказанным векторам. Программа SnB (Weeks & Miller, 1999) используется, для решения структур малых молекул или субструктур, образованных тяжелыми атомами в белковом кристалле. Программа использует тангенс-формулу Карле Хауптмана (2.4.13) в обратном пространстве и модификацию электронной плотности в прямом пространстве. Процедура Shake-and-Bake подразумевает циклы пересчета структурных факторов в электронную плотность с использованием фаз, рассчитанных прямыми методами, и уточнение фаз путем модификации распределения электронной плотности. Программа SHARP (de La Fortelle &Bricogne, 1997) использует метод наибольшего правдоподобия для уточнения позиций, заселенности, температурных факторов тяжелых атомов в производных. На основании уточненных параметров рассчитывается фазовое распределение для каждого отражения. Основное достоинство программы —учет .всех ошибок, возникающих в результате неизоморфизма.
SOLOMON (Abrahams & Leslie, 1996). Программа предназначена для уточнения экспериментальных фаз методом модификации электронной плотности. На карте электронной плотности, рассчитанной с использованием экспериментальных фаз, исключаются районы отрицательной плотности, идентифицируются участки, принадлежащие белку и растворителю. На основании улучшенной карты рассчитывается новый набор фаз, которые комбинируются с экспериментальными фазами по процедуре SigmaA (Read, 1986) и рассчитывается новая карта электронной плотности. Процесс повторяется до сходимости.
Связывание ингибитора и строение активного центра а-галактозидазы
Культура мезофильного гриба Penicillium была выращена в течение 58 часов в колбах Эрленмейера на термостатируемом шейкере в среде того же состава, что использовался для культивирования T.reesei. Мицелий был удален центрифугированием (3000 g, 40 мин), а супернатант был сконцентрирован в 10 раз и переведен в 0,02 М Na-ацетатный буфер, рН 4,2 при помощи ультрафильтрационного модуля АР 0,2. Полученный концентрированный препарат наносили на колонку с SP-Sephadex С-50 уравновешенную 0,02 Na-ацетатным буфером, рН 4,2 и элюировали с 1 М/Л
NaCl в том же буфере. Полученный раствор был сконцентрирован до 20 мЛ на ультрафильтрационной мембране Amicon РМ-30, диализован против 0,02 М Tris-HCl буфера, рН 7,2 и нанесен на колонку для ВЭЖХ TSK-DEAE 5PW, уравновешенную тем же буфером. р-Галактозидаза была элюирована с линейным градиентом (0 - 0,5) М/Л NaCl. Фракции, содержащие Р-галактозидазную активность были собраны, сконцентрированы до 5 мЛ и диализованы против против 0,02 М Tris-HCl буфера, рН 7,2. Полученный раствор белка был нанесен на колонку monoQ HR5/5 и рехроматографирован в тех же условиях, как описано выше. На последней стадии очистки, Р-галактозидазная фракция была насыщена твердым сульфатом аммония до концентрации 1,7 М/Л и нанесена на колонку Phenyl-Superose HR5/5, уравновешенную 1,7 М сульфатом аммония в том же Tris-HCl буфере. Белок элюировали спадающим градиентом (1,7-0) М/Л сульфата аммония. На этой стадии, отдельный пик, соответствующий Р-галактозидазной активности был собран, очищенный белок диализован против деионизованной воды и лиофильно высушен. Все стадии очистки были выполнены при 4С. Активность фермента контролировали, используя ПНФрГ в концентрации 3 мМ/Л в качестве субстрата (Leparouxe a/., 1997). Количественно единица ферментативной активности была определена как активность необходимая для гидролиза 1 мкМПНФрГ за 1 мин при 37С и рН 6.0. Для кристаллизации, лиофилизированный белок растворялся в дистиллированной воде до конечной концентрации 5-10мГ/мЛ и смешивался с равным объемом 15 %-го раствора ПЭГ 8000 в 0,05 М Na-фосфатного буфера, рН4,0. Капли полученного раствора объемом (5 — 10) мкЛ уравновешивали на платах Linbro (Hampton Research Со.) против 1 мЛ 15 %-го раствора ПЭГ в соответствующем буфере. В течение первых двух дней формировался аморфный осадок, из которого через 4-5 дней вырастали бипирамидальные кристаллы, достигавшие максимального размера около 0,2 мм по всем измерениям.
В экспериментах по получению тяжелоатомных производных кристаллов а-галактозидазы было протестировано большое число солей тяжелых металлов. Применение солей ртути, обычно используемых для дериватизации белковых кристаллов, даже в минимальных концентрациях (около 0,01 мкМ/Л) приводило к разрушению кристаллов. Соли тяжелых металлов — Pt, Os, Re, Ag, Au, U, Pb, W - были использованы в экспериментах по получению производных в концентрациях от 1 мкМ/Л до ЮмМ/Л. Времена экспозиции кристалла в растворе соли в маточной жидкости варьировалось от 1 до 10 суток. Однако изучение большого числа наборов дифракционных данных не выявило тяжелоатомной производной, пригодной для решения фазовой проблемы. Удачным оказался метод, предложенный для быстрой криодериватизации белковых кристаллов (Dauter, Z & Dauter, ML, 2001). Цезиевая тяжелоатомная производная кристалла а-галактозидазы была получена погружением кристалла белка в раствор, содержащий 0,2 МАЛ CsCl, 20 % (06./06.) глицерина, 30% (в/об.) ПЭГ 3350 (Sigma) в 0,05 М Na-ацетатном буфере, рН5,5. После 20-минутной инкубации, кристалл был заморожен в потоке газообразного азота при 100 К и использован для сбора рентгено структурных данных. В связи с нарушением изоморфизма с кристаллом нативного белка (один из параметров элементарной ячейки Cs-производной изменился почти на 10 %), дополнительный набор данных был получен, на кристалле, который инкубировался в течение 10 мин в растворе, содержащем 0,2 МУЛ KI, 20 % (об./об.) глицерина, 30% (в/об.) ПЭГ 3350 (Sigma) в 0,05 М Na-ацетатном буфере, рН 5,5. Йодный набор данных не выявил продуктивного связывания тяжелого атома (I), но йодная "псевдопроизводная" оказалась изоморфна кристаллу цезиевой производной и полученный набор данных использовали в дальнейшем как набор сравнения (нативный) при расчете фаз. Метод быстрой криодериватизации белковых кристаллов был использован для получения двух из трех производных кристалла Р-галактозидазы. Йодная производная была получена инкубацией кристалла белка в течение 330 с в растворе 0,5 М/Л Nal, 15 % (об./об.) этиленгликоля в маточной жидкости. Для цезиевой производной, кристаллы р-галактозидазы выдерживались в течение 60 с в растворе, содержащем 0,33 М/Л CsCl и 15 % (об./об.) этиленгликоля в маточной жидкости. Уранильная производная была получена инкубацией кристалла белка в течение 12 ч в растворе следующего состава: 0,05 М/Л (U02)Ac2) 15 % (об./об.) этиленгликоля в маточной жидкости. Модифицированные кристаллы для сбора дифракционных данных были заморожены в потоке газообразного азота при 100 К немедленно после экспозиции в растворах солей тяжелых металлов.
Все рентгеноструктурные данные были собраны с использованием метода вращения, на линии белковой кристаллографии Бразильского национального центра синхротронного излучения (Табл. 3), Кампинас, штат Сан-Паулу, Бразилия (Polikarpov, L, OHva, G., etal, 1997). Длина волны рентгеновского излучения была установлена равной 1,54 А для увеличения уровня аномального сигнала и оптимизации отношения сигнал/шум (Polikarpov, I., Perles, L.A., et ah, 1997). В качестве детектора использовался двумерный позиционно-чувствительный детектор на основе запоминающих рентгеновских экранов - Image plate MAR 345, управляемый программой AUTOMAR (Marresearch Со.) в режиме 2300 пикселей.
