Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Строение и фотофизические характеристики псораленов
1.2. Фотохимические реакции фурокумаринов 13
1.3. Мембранотоксические эффекты продуктов фотоокисления 15
псоралена
1.4. Общие положения теории РСР 20
1.5. Закон Бунзена-Роско 23
1.6. Современные представления о механизмах развития реакции контактной чувствительности
1.7. Иммунологические эффекты ПУВА-терапии и фотофереза 34
1.8. Методы регистрации апоптоза 38
1.9. Иммунологические эффекты продуктов фотоокисления псоралена 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Реактивы 44
2.2. Приготовление раствора фотосенсибилизатора и его облучение 44
2.3. Изучение агрегатного состояния и фотолиза псоралена 45 оптическими методами
2.4. Приготовление суспензии эритроцитов и постановка ФОП- гемолиза
2.5. Лабораторные животные, постановка реакции КЧ 47
2.6. Приготовление суспензий клеток лимфоузлов и селезенок, оценка абсолютного числа клеток и пролиферации лимфоцитов в лимфатических узлах
2.7. Оценка уровня секреторных цитокинов 50
2.8. Оценка апоптоза in vivo: подготовка суспензий клеток и цитометрический анализ
2.9. Оценка апоптоза in vitro 53
2.10. Иммуномагнитная сепарация 54
2.11. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1.агрегация продуктов фотоокисления псоралена 56
3.1.1 Фотоиндуцированная агрегация псоралена, спектры РСР
3.1.2. Измерение спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции продуктов фотоокисления псоралена
3.1.3. Влияние тушения флуоресценции на РСР фотопродуктов псоралена
3.1.4. Стабильность фотоиндуцированных агрегатов псоралена во времени
3.1.5. Измерение сигналов РСР при разведении ФОП 67
3.1.6. Зависимость фотоиндуцированной агрегации псоралена от дозы 69 УФА-облучения
3.1.7. Зависимость фотоиндуцированной агрегации псоралена от 72
интенсивности УФА-излучения и концентрации псоралена во время облучения
3.1.8. Исследование спектров РСР и гемолитической активности ФОП при облучении псоралена в бескислородной среде и в присутствии кислорода
3.1.9. Проверка выполнимости закона Бунзена-Роско при фотоиндуцированной агрегации псоралена и при образовании ФОП-гемолизинов
3.1.10. Влияние интенсивности УФА-излучения на образование ФОП- гемолизинов
3.2. Изучение иммунных механизмов ограничения реакции кч при действии фоп
3.2.1. Супрессорное действие ФОП на разные фазы развития реакции КЧ 3.2.2. Действие ФОП на афферентную стадию реакции КЧ в зависимости от способа его введения
3.2.3. Влияние ФОП на динамику накопления клеток в лимфоузлах и селезенках ДНФБ-сенсибилизированных мышей
3.2.4. Измерение пролиферативной активности клеток лимфоузлов под действие ФОП in vivo
3.2.5. Изменение цитокинового профиля клеток лимфоузлов под действием ФОП in vivo
3.2.6. Индукция апоптоза клеток ЛУ продуктами фотоокисления псоралена in vivo и in vitro
3.2.7. Выполнимость закона Бунзена-Роско для проапоптотического действия ФОП на клетки лимфоузлов интактных мышей
3.2.8. Образование агрегатов продуктов ФОП при дозах, вызывающих апоптоз клеток лимфоузлов мышей
3.2.9. Выявление субпопуляции Т-лимфоцитов, ответственной за развитие реакции КЧ к ДНФБ
3.2.10. Выявление специфичности супрессорного действия ФОП при его внутривенном введении мышам
3.2.11. Выявление популяции клеток, ответственных за супрессорное действие продуктов фотоокисления псоралена
Заключение 129
Выводы 132
Список литературы
- Современные представления о механизмах развития реакции контактной чувствительности
- Приготовление суспензий клеток лимфоузлов и селезенок, оценка абсолютного числа клеток и пролиферации лимфоцитов в лимфатических узлах
- Стабильность фотоиндуцированных агрегатов псоралена во времени
- Измерение пролиферативной активности клеток лимфоузлов под действие ФОП in vivo
Современные представления о механизмах развития реакции контактной чувствительности
Псоралены – вещества растительного или синтетического происхождения, которые используют для фотохимиотерапии дерматозов. Существует, по крайней мере, два основных метода терапии с использованием псораленов и УФ-А облучения светом в УФА-диапазоне области спектра (320-400 нм): ПУВА-терапия (псорален+УФА) и фотоферез. При ПУВА-терапии УФА облучают кожу пациента предварительно получившего препарат псораленов. При фотоферезе облучению в присутствии псораленов подвергается лейкоцитарная фракция крови пациентов. Наряду с терапевтическим действием ПУВА вызывает побочные токсические эффекты, такие как гиперпигментация и эритема. Тем не менее, оба метода давно успешно используются в клинической практике для лечения патологий, обусловленных гиперреактивностью Т-клеточного звена иммунитета, например, витилиго, псориаза, аллергического контактного дерматита и др [81].
При УФА облучении тканей пациентов в присутствии псораленов (ПУВА-воздействие) происходит фотолиз фотосенсибилизатора с образованием продуктов его фотоокисления (ФОП). В нашей лаборатории ранее было выявлено, что существуют стабильные продукты ФОП, которые, при введении их в биологические объекты, инициируют фотобиологические эффекты сходные с таковыми при ПУВА-воздействии [66]. А именно, ФОП обладал как мембранотоксическим, так и иммуномодулирующим действием. Эти данные указывали на то, что продукты ФОП могут вносить вклад как в терапевтические, так и побочные токсические эффекты ПУВА-терапии и фотофереза.
Мембранотоксические эффекты ПУВА-воздействия чаще всего изучались на модели гемолиза эритроцитов [5]. Показано, что облучение эритроцитов в присутствии псоралена приводит к индукции гемолиза (ПУФА-гемолизу), механизм которого сильно зависел от интенсивности используемого УФА-излучения. При низкой интенсивности ПУФА-гемолиз имеет все черты, присущие коллоидно-осмотическому гемолизу, тогда как при высокой интенсивности механизм становится иным. Было высказано предположение, что основной вклад в развитие высокоинтенсивного ПУФА гемолиза вносят ФОП-продукты фотоокисления псоралена [46]. Так появилось новое направление исследований, ориентированное на изучение механизма гемолиза, индуцируемого стабильными продуктами фотоокисления псоралена (ФОП-гемолиза).
Черты ФОП-гемолиза имеют много общего с чертами высокоинтенсивного ПУФА-гемолиза, поэтому было высказано предположение о сходности их механизмов. Интенсивные исследования в этой области привели к описанию ряда физико-химических закономерностей, присущих развитию ФОП-гемолиза, но механизм этих процессов оставался во многом неясным. Предполагалось, что мембранотоксическое действие ФОП может быть опосредовано тем, что при облучении раствора псоралена в нем образуются фотоиндуцированные агрегаты его фотопродуктов, которые и вызывают повреждение мембраны эритроцитов. Этот механизм гемолиза был назван механохимическим. Однако, прямых методов, позволяющих обнаружить такие агрегаты, ранее не существовало. В настоящее время появился метод резонансного светорассеяния (РСР), позволяющий с высокой чувствительностью выявлять агрегаты красителей. Таким образом, одна из задач настоящей работы заключалась в том, что привлекая метод РСР, ответить на вопрос – образуются ли фотоиндуцированные агрегаты псоралена и играют ли они какую-либо роль в мембранотоксическом действии ФОП.
Предполагается, что терапевтическое действие псораленовой фотохимиотерапии основано на индукции специфической иммуносупрессии. Эти данные были получены преимущественно в моделях Т-клеточного иммунного ответа in vivo (реакции гиперчувствительности замедленного типа и контактной гиперчувствительности) [71]. В нашей лаборатории в моделях реакций КЧ и ГЗТ впервые было продемонстрировано, что ФОП модулирует (активирует/супрессирует) Т-клеточный иммунный ответ in vivo [44]. Это указывало на то, что ФОП-продукты могут вносить вклад в терапевтическое действие псораленовой фотохимиотерапии [46]. Предварительные данные показывают, что ФОП-продукты эффективны при лечении атопической экземы и псориаза [2]. На сегодня иммунные механизмы супрессорного, и, как следствие, терапевтического действия ФОП остаются не ясными. В этой связи изучение влияния ФОП-продуктов на различные этапы развития Т-клеточного иммунного ответа является актуальным и может позволить приблизиться к пониманию иммуносупрессорного действия ФОП и тем самым дать предпосылки для разработки нового способа псораленовой фотохимиотерапии – ФОП-терапии. Очевидным преимуществом ФОП перед ПУВА-терапией или фотоферезом может быть тот факт, что ФОП-терапия не требует облучения тканей пациента, что позволит избежать негативных побочных эффектов воздействия УФА-света. Цель настоящей работы: Изучить агрегацию продуктов фотоокисления псоралена и иммунологические механизмы их супрессорного действия.
Приготовление суспензий клеток лимфоузлов и селезенок, оценка абсолютного числа клеток и пролиферации лимфоцитов в лимфатических узлах
Покоящиеся клетки (G0) и клетки, находящиеся в пресинтетической фазе клеточного цикла (G1), содержат количество ДНК, соответствующее диплоидному набору хромосом (2N); на гистограмме это отражается в виде так называемого диплоидного (G0+G1) пика. В премитотической фазе (G2) и фазе митоза (М) число хромосом и содержание ДНК удваивается (4N), что отражается в виде G2 + М-пика. В фазе синтеза (S) содержание ДНК колеблется от 2N до 4N. Содержание ДНК в сравнении с клетками, находящимися в G0G1 фазах клеточного циклах, в апоптотирующих клетках после соответствующей обработки (преципитирующие фиксаторы, отмывание) снижается, что выражается в появлении на гистограммах так называемого гиподиплоидного ( 2N) пика. Этот пик называют также "суб-G0G1" или просто субдиплоидным пиком. Таким образом, ясно, что по интенсивности флуоресценции йодистого пропидия можно определять плоидность ДНК, а значит и апоптоз клеток. Метод 2. Необходимо отметить, что вышеуказанная методика с применением PI способна зафиксировать лишь поздний апоптоз, тогда как для выявления раннего апоптоза с помощью проточного цитометра чаще всего используют аннексин-V, конъюгированный с флуорохромом ФИТЦ [22].
Во время апоптоза клетки высвобождают фосфатидилсерин на клеточной поверхности. Аннексин V, являющийся фосфолипид связывающим протеином, в присутствии ионов кальция селективно, с высокой аффинностью связывает фосфатидилсерин. Он проявляет очень низкую аффинность к таким фракциям фосфолипидов как фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин и фосфатидилхолин. Такой профиль связывания позволяет использовать аннексин-V в качестве высокоспецифичного агента для определения апоптотических клеток [22]. Комбинация аннексина V/FITC с иодидом пропидия позволяет разделить три различные фенотипа: а) клетки, находящиеся в раннем апоптозе, связываются только с Аннексином-V, б) клетки, одновременно связывающиеся с аннексином V и йодистым пропидием, проходят поздний апоптоз, и в) некротические клетки, которые окрашиваются только йодидом пропидия.
Иммунологические эффекты продуктов фотоокисления псоралена Известно, что при проведении ПУВА-терапии в коже пациента происходит фотолиз псоралена с образованием продуктов его фотоокисления. Существует предположение, что иммуносупрессия, обусловленная ПУВА-воздействием, может возникать при участии продуктов фотоокисления псораленов, образующихся в ходе реакции IV типа [5; 43].
В нашей лаборатории было показано, что продукты фотоокисления псоралена обладают иммуносупрессорными свойствами [5; 43] и терапевтическим действием при лечении псориаза и атопической экземы [2; 4]. Среди продуктов фотолиза водных растворов 8-метоксипсоралена и псоралена были идентифицированы такие, как 6-формил-7 гидроксикумарины, гидроксикислоты и гидроксиэфиры, продукты расщепления пиррольного кольца, фурокумариновая кислота и гидроперикись [16]. К сожалению, биологическая активность и свойства большинства фотопродуктов псоралена до сих пор не изучена, и тем самым затруднительно сделать вывод о том, какие именно продукты фотоокисления играют первостепенную роль в иммуносупрессии ГЗТ и КЧ. Тем не менее было показано, что предварительно облученный раствор псоралена при в/в или пероральном введении мышам способен ингибировать Т-клеточный иммунный ответ in vivo у мышей [64]. Это было выявлено на моделях реакций [45; 46], а затем и КЧ [66]. Было доказано, что фотопродукты псоралена с иммуносупрессорными свойствами являются именно продуктами фотоокисления псоралена, поскольку они образовывались только в присутствии кислорода [66]. УФА-облучению непосредственно ни сами животные ни их клетки не подвергались, им вводились продукты фотоокисления псоралена. При такой схеме проведения экспериментов присоединение фотоокисленных псораленов к ДНК не осуществлялось и реакции типа III (см. раздел 1.2) не могли иметь место.
Продукты с иммуносупрессорными свойствами были получены из псоралена, 8-МОП и императорина [2; 44]. Более того, в нашей лаборатории было показано, что механизмы иммуносупрессорного действия продуктов фотоокисления псоралена сходны с таковыми для ПУВА-терапии. Такое предположение было основано на следующих наблюдениях: а) угнетение in vivo пролиферативной активности АГ-специфических Т-лимфоцитов; б) активация клеток с иммуносупрессорным потенциалом; в) индукция адоптивно-переносимой клетками супрессии Т-клеточного иммунного ответа [45]; г) угнетение функций эффекторных АГ-специфических Т-лимфоцитов в отсутствии прямого действия на них; д) отсутствие влияния на гуморальный иммунный ответ. Кроме того известно, что фотопродукты псоралена, выделенные с помощью HPLC-хроматографии, в достаточно большой концентрации in vitro обладают проапоптотической активностью на опухолевую Т-клеточную линию Jurkat [16]. При этом известно, что иммуносупрессорное действие ПУВА-терапия и фотофереза также реализуется, в том числе и через механизм апоптоза Т-клеток [88].
Тем не менее, до настоящего момента остаются неясными: а) химическая структура фотопродуктов псоралена с иммуносупрессивными свойствами; б) иммунные механизмы супрессорного действия продуктов фотоокисления псоралена на Т-клеточный иммунный ответ in vivo. Такие механизмы удобно изучать на наиболее часто используемой модели Т-клеточного иммунного ответа – реакции КЧ. Механизмы ее развития описаны в соответствующем разделе (1.6).
Стабильность фотоиндуцированных агрегатов псоралена во времени
Суспензии клеток лимфоузлов ДНФБ-сенсибилизированных или интактных мышей готовили, как описано в разделе 2.6. Суспензии клеток выделяли из мышей через 48 и 96 ч после сенсибилизации ДНФБ, получивших ФОП в/в или перорально. Из маточной суспензии отбирали аликвоту, содержащую 106 клеток. Клетки двухкратно отмывали холодным раствором ФБР. Отмытые клетки ресуспендировали в 100 мкл ФБР (4С) и фиксировали 900 мкл 70% глубоко охлажденного этанола (-20С) в течение не менее 30 мин при -20С. Фиксированные в этаноле клетки осаждали центрифугированием при 300 g 5 минут и ресуспендировали с помощью пипетки с отсеченным наконечником в 500 мкл ФБР и 500 мкл фосфат-цитратного буфера (0,192 М Na2HP04, 4 мМ лимонной кислоты, pH=7,8). Инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Далее повторно центрифугировали при 300 g, 5 минут и ресуспендировали в 500 мкл «красящего» раствора, содержащего пропидиум йодид (1 мг/мл РНКазы + 33 мкг/мл пропидиум йодида + 0,2% тритон X-100; Sigma, США). Пробы инкубировали 30 минут при комнатной температуре в темноте. По окончании инкубирования образцы с клетками анализировали методом однолучевой проточной цитофлуорометрии при длине волны 488 нм.
Обработка данных проточной цитофлуорометрии. Исследование апоптоза проводили на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 (Becman Coulter, США), анализируя диаграммы распределения флуоресцирующих клеток. Типичные диаграммы распределения клеток по флуоресценции ДНК состояли из трех пиков (рисунок 11). По данным литературы [7] клетки, входящие в состав пиков характеризуются следующим образом:
Типичные диаграмма DotPlot (слева) и гистограмма (справа) флуоресценции мононуклеаров при определении апоптоза. FS – переднее рассеяние, SS – боковое рассеяние.
Увеличение содержания клеток в первом пике свидетельствует об индукции апоптоза, поскольку биохимическим индикатором апоптоза является расщепление ДНК эндонуклеазами на олигонуклеосомальные фрагменты. Анализировали 10000 событий.
Мышей сенсибилизировали ДНФБ, и через 24 или 72 ч готовили суспензии паховых лимфатических узлов. В группе отрицательного контроля (К-) ЛУ выделяли из интактных животных. К суспензиям, содержащих 5 х 106 клеток в ФБР добавляли различные объемы ФОП таким образом, чтобы конечный объем пробы составлял 2 мл и конечные концентрации по псоралену до его облучения составляли 10-6, 10-5, или 5 х 10-5 М. Инкубацию суспензий проводили в течение 15 минут при температуре 37C и 5% CO2. В контрольных пробах (К+ или К-) 5 х 106 клеток в 2 мл ФБР инкубировали в присутствии 1% этанола. Для определения апоптотической активности необлученного псоралена, к суспензии, также содержащей 5 х 106 клеток в ФБР, добавляли 1 мл необлученного агента, в концентрации 10-4 М (конечная концентрация составляла 5 х 10-5 М). После инкубации, суспензии клеток трехкратно отмывали в неполной среде RPMI-1640 путем центрифугирования (5 мин, 400 g). Затем удаляли супернатант, и осадок, содержащий клетки лимфатических узлов, культивировали в полной среде RPMI-1640 при 37C и 5% CO2 в течение 4 или 18 ч. После культивации, 5 х 105 клеток были помечены аннексином-V и йодистым пропидием (An/Pi) согласно инструкции к набору реагентов Annexin V-FITC – PI (“Beckman Coulter”, США). Дабы избежать «температурного» апоптоза, все манипуляции, начиная с конца культивации вплоть до постановки пробы в цитофлюориметр, проводили при 4оС. В область (гейт) анализа включали все события за исключением дебриса. Долю AnV+-клеток (ранний апоптоз), AnV+/PI+-клеток (поздний апоптоз) и PI+-клеток (некроз) определяли по стандартной методике на проточном цитофлуориметре Altra (“Beckman Coulter”, США) согласно инструкции производителя. Интенсивность подачи суспензии в цитофлуориметр подбирали таким образом, чтобы скорость сбора к моменту записи данных составляла 300 событий в 1 с. Анализировали 10000 событий.
Иммуномагнитная сепарация Для получения отдельных популяций спленоцитов использовали методы негативной и позитивной клеточной селекции (сепарации). Для сепарации СD3+ клеток использовали реактив Dynabeads Mouse pan T (Thy1.2), сепарации B-клеток – Dynabeads Mouse pan B , а для сепарации СD3+, CD4+ и CD8+ – Dynal Mouse Negative Isolation Kit (Invitrogen Dynal AS, Норвегия) (рисунок 12). Для сепарации отдельной популяции лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD45R) из 107 клеток, к суспензии спленоцитов в 100 мкл «буфера 1» (ФБР без Ca2+ и Mg2+, 0,1% фетальной сыворотки, 2 мМ ЭДТА, pH 7,4) добавляли 20 мкл смеси моноклональных антител против поверхностных антигенов клеток, которые следовало удалить. После тщательного перемешивания, содержимое пробирки инкубировали 20 мин при 4C. На следующем этапе клетки отмывали путем добавления 2 мл «буфера 1» и центрифугирования (300 g, 8 мин.) при 4C. После отбора супернатанта клетки ресуспендировали в 800 мкл «буфера 1». Следующим шагом было добавление парамагнитных полимерных микрочастиц Dynalbeads и инкубация с постоянной ротацией в течение 15 мин. при 18-25C. Затем содержимое пробирки разбавляли добавлением 1 мл «буфера 1» и оставляли в магнитном поле штатива DynalMag-2 (Invitrogen Dynal AS, Норвегия) на 2 мин. После чего собирали супернатант, содержащий интересующую популяцию клеток, не прикрепившуюся к полимерным микрочастицам, и отмывали центрифугированием в ФБР. После подсчета клетки вводили внутривенно экспериментальным животным в объеме 0,5 мл.
Измерение пролиферативной активности клеток лимфоузлов под действие ФОП in vivo
Известно, что развитие реакции КЧ протекает в две стадии – афферентной (сенсибилизации) и эффекторной (разрешения) [36]. На афферентной стадии реакции КЧ после аппликации гаптена происходит: 1) контакт и захват гаптена АПК кожи; 2) миграция связанных с гаптеном АПК в регионарные ЛУ; 3) представление АПК антигена наивным Т-лимфоцитам, что приводит к пролиферации, созреванию и миграции в ткани эффекторных лимфоцитов. Эффекторная стадия КЧ развивается после повторного контакта организма с АГ.
Ранее, в нашей лаборатории было показано, что пероральное введение мышам ФОП на эффекторной стадии реакции КЧ, а именно, за сутки до повторного нанесения гаптена (т.е. за сутки до разрешения реакции), вызывает ее супрессию [42]. Однако действие ФОП на афферентную фазу реакции КЧ изучено не было. В этой связи одной из задач настоящей работы было изучить действие ФОП на афферентную фазу развития реакции КЧ к ДНФБ у мышей.
Для решения поставленной задачи были поставлены следующие эксперименты. В первой серии опытов растворы ФОП вводили мышам перорально по 0,5 мл за 24 часа или через 24 часа (афферентная стадия), или 120 часов (эффекторная фаза) после сенсибилизации ДНФБ. Инициацию реакции КЧ к ДНФБ у мышей проводили согласно экспериментальному подходу, представленному в разделе материалы и методы. ФОП получали путем облучения (365 нм, 23 Вт/м2, 44 кДж/м2) 0,1 мМ раствора псоралена в ФБР, содержащим 1% этанола. Результаты экспериментов приведены на рисунках 36 и 37. На рисунке 36 видно, что ФОП вызывает супрессию КЧ независимо от времени его введения мышам: через 24 часа после сенсибилизации на 58±5% (p 0,02), а через 120 часов – на 47±7% (p 0,05). Однако, введение ФОП за 24 часа до аппликации гаптена (рисунок 37) не приводил к супрессии КЧ. Таким образом, в настоящей работе было показано, что, как эффекторная, так и афферентная фаза реакции КЧ чувствительны к супрессорному действию ФОП.
Согласно данным литературы [64] можно предположить, что супрессия КЧ при введении ФОП через 24 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ могла быть следствием влияния данного агента на способность АПК представлять антиген наивным Т-лимфоцитам в регионарных ЛУ, а также на пролиферацию и созревание специфических Т-лимфоцитов. Отсутствие действия ФОП на реакцию КЧ при введении его за 24 часа до сенсибилизации могло быть следствием нескольких причин. Известно, что при приеме пациентом препарата псораленов в ходе проведения ПУВА-терапии они выводятся из организма пациента в течение суток [2; 86]. В этой связи можно предположить, что ФОП мог быть выведен из организма к моменту аппликации ДНФБ. Во-вторых, отсутствие действия ФОП при введении его мышам за 24 часа до сенсибилизации, могло свидетельствовать о том, что интактные иммунные клетки не были чувствительны к действию ФОП, или данный агент не влиял на процессы захвата антигена АПК кожи и последующую их миграцию в регионарные ЛУ.
Супрессорное действие ФОП на эффекторной стадии КЧ, т.е. при его введении за 24 часа до повторной аппликации гаптена, можно связать с прямым или опосредованным действием ФОП на функции эффекторных клеток [36].
Таким образом, результаты полученных исследований указывают на существование нескольких иммунных механизмов ограничения реакции КЧ под действием ФОП. Рисунок 36. ФОП вызывает супрессию реакции КЧ как на афферентной, так и на эффекторной стадиях ее развития. Необлученный псорален или ФОП вводили по 0,5 мл перорально через 24 или 120 часов после однократной сенсибилизации мышей ДНФБ. К+ (положительный контроль КЧ): сенсибилизированные ДНФБ мыши, получившие повторно аппликацию ДНФБ на ухо. К" (отрицательный контроль КЧ): интактные мыши, получившие аппликацию ДНФБ на ухо. Данные 5 независимых экспериментов ± SEM. р 0,02 по сравнению с К+; #р 0,05 по сравнению с К+
Введение ФОП за 24 часа до инициации реакции КЧ не вызывает ее супрессию. ФОП вводили мышам перорально за 24 (ФОП -24) и спустя 24 (ФОП +24) часа с момента однократной сенсибилизации ДНФБ. К+ (положительный контроль КЧ): сенсибилизированные ДНФБ мыши, получившие повторно аппликацию ДНФБ на ухо. К" (отрицательный контроль КЧ): интактные мыши, получившие аппликацию ДНФБ на ухо. Данные 3 независимых экспериментов ± SEM. р 0,02 по сравнению с контролем
Известно, что при проведении фотофереза УФА облучению подвергаются лейкоцитарная фракция крови пациента в присутствии псоралена [86]. Данное воздействие приводит к супрессии Т-клеточного иммунного ответа, в том числе и реакции КЧ [52]. В экспериментах, приведенных на рисунке 36, продукты фотоокисления псоралена вводили животным перорально, что приводило к супрессии реакции КЧ. Известно, что продукты фотоокисления псоралена высокореакционно-способны по отношению к биологическим молекулам [16]. В этой связи становится очевидным, что при пероральном или в/в введении ФОП первичные мишени с которыми будет реагировать ФОП должны различаться. Поэтому, осталось неясным, может ли ФОП вызывать супрессию реакции КЧ при его в/в введении. В настоящей работе была сравнена эффективность супрессорного действия ФОП при его пероральном и в/в введении.
Эти исследования проводили на афферентной фазе развития реакции КЧ (через 24 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ). ФОП получали путем облучения (365 нм, 23 Вт/м2, 44 кДж/м2) раствора псоралена (0,1 мМ в ФБР + 1% этанола). Через 120 ч после сенсибилизации гаптен наносили на ухо животного. Через 24 часа регистрировали степень развития реакции КЧ. Результаты экспериментов представлены на рисунке 38. Видно, что супрессия реакции КЧ не зависела от способа введения ФОП мышам. При в/в и пероральном введении супрессорное действие ФОП составляло 43%±5% и 44%±7% соответственно. С учетом изложенного, можно предположить, что при обоих способах введения, несмотря на различие, по-видимому, в первичных биологических мишенях при в/в и пероральном введении ФОП, его супрессорное действие на реакцию КЧ было сравнимым. 0. 0.20
Рисунок 38. Супрессия реакции КЧ к ДНФБ не зависит от способа введения ФОП мышам. Мышам вводили перорально (per os) или внутривенно (в/в) по 0,5 мл ФОП через 24 часа после однократной сенсибилизации ДНФБ. К+ (положительный контроль КЧ): сенсибилизированные ДНФБ мыши, получившие повторно аппликацию ДНФБ на ухо. К" (отрицательный контроль КЧ): интактные мыши, получившие аппликацию ДНФБ на ухо. Данные 5 независимых экспериментов ± SEM. p 0,001 по сравнению с К+. #р 0,004 по сравнению с К+.
Влияние ФОП на динамику накопления клеток в лимфоузлах и селезенках ДНФБ-сенсибилизированных мышей Известно, что ключевым этапом при развитии реакции КЧ является пролиферация, созревание и накопление пула специфических Т-лимфоцитов в ответ на накожную аппликацию гаптена [36]. Этот этап соответствует афферентной фазе развития КЧ. Т.к. ФОП угнетал реакцию КЧ на её афферентной стадии (рисунок 36), это указывало на возможность угнетения пролиферации АГ-специфических лимфоцитов при действии ФОП. В этой связи была поставлена задача изучить, как изменяется количество лимфоцитов в регионарных лимфоузлах и селезенках ДНФБ сенсибилизированных мышей после введения ФОП. Для этого мышей сенсибилизировали путем аппликации на выбритую кожу брюшка 50 мкл 0,3% раствора ДНФБ в ацетоне.
