Введение к работе
Актуальность темы
Тромбоциты - это безъядерные клетки крови, основной функцией которых является участие в свертывании крови, процессе, предотвращающем кровопотерю при повреждении кровеносного сосуда. Повреждение кровеносного сосуда приводит к активации каскада реакций плазменного гемостаза и тромбоцитов. Основные активаторы тромбоцитов это коллаген, обнажающийся при повреждении сосуда, тромбин, основной белок каскада плазменного гемостаза, АДФ и тромбаксан А2, секретируемые тромбоцитами в процессе активации. При активации тромбоцит может изменять форму, адгезировать к месту повреждения, агрегировать с другими тромбоцитами, секретировать различные вещества, формировать прокоагулянтную поверхность, содержащую фосфатидилсерин, и отделять микровезикулы.
Известно, что любая сильная активация тромбоцитов приводит к разделению тромбоцитов на две субпопуляции. Это так называемые укутанные и неукутанные тромбоциты. Поверхность укутанных тромбоцитов, в отличие от неукутанных, содержит фосфатидилсерин, такая поверхность необходима для существенного ускорения реакций плазменного звена системы гемостаза. Укутанные тромбоциты также характеризуются наличием альфа-гранулярных белков, связанных с поверхностью таких тромбоцитов, и дезактивацией интегрина аІІЬрЗа, основного трансмембранного белка, обеспечивающего агрегацию тромбоцитов.
Механизмы формирования субпопуляций активированных тромбоцитов изучены недостаточно хорошо. Известно, что различная активация ведет к формированию различного количества укутанных тромбоцитов, что говорит о том, что тромбоциты изначально являются гомогенной популяцией и разделяются на субпопуляции именно в процессе активации. Также было показано, что секреция АДФ, но не тромбаксана А2, регулирует формирование укутанных тромбоцитов. Также известно, что добавление кальциевого ионофора А23187 ведет к экспрессии фосфатидилсерина всеми тромбоцитами суспензии, что говорит о вероятной роли кальциевой сигнализации в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов.
В данной работе изучалась роль кальциевой сигнализации в формировании укутанных тромбоцитов. Была разработана методика детекции кальция в субпопуляциях тромбоцитов, произведен сравнительный анализ флуоресцентных красителей, чувствительных к концентрации кальция в цитоплазме тромбоцитов. Произведен анализ кинетики кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов при различной активации.
В большинстве работ, посвященных изучению субпопуляций активированных тромбоцитов, тромбоциты активировались в концентрации более чем на порядок ниже
физиологической. Такой подход позволяет упростить экспериментальную модель, сведя к минимуму вклад секреции тромбоцитов и межклеточных взаимодействий. Таким образом, в данный момент существует необходимость детального изучения процессов, происходящих в тромбоцитах при их активации в физиологической концентрации, что, возможно, позволит прояснить ряд противоречий и выявить дополнительные механизмы, ведущие к экспрессии фосфатидилсерина при активации тромбоцитов.
Цель работы: Изучить свойства и механизмы формирования фосфатидилсерин-положительных тромбоцитов в физиологических концентрациях.
Задачи исследования:
1. Подобрать оптимальный внутриклеточный Са2+-флуорофор, подходящий
для достоверной оценки изменений концентраций кальция, характерных для сильной
активации тромбоцитов.
Исследовать кальциевую сигнализацию в тромбоцитах при использовании различных активаторов.
Исследовать зависимость кальциевой сигнализации и экспрессии фосфатидилсерина от концентрации активированных тромбоцитов.
Выявить механизмы, регулирующие экспрессию фосфатидилсерина при активации тромбоцитов в физиологической концентрации.
Научная новизна. При активации тромбоцитов в физиологических концентрациях
о о
(2x10 /мл-4хЮ /мл) впервые выявлена гетерогенность среди ФС-положительных тромбоцитов. Помимо известной ранее Ф С-положительной субпопуляции с устойчиво повышенной концентрацией внутриклеточного кальция, выявлена новая, также ФС-положительная субпопуляция с низкой концентрацией кальция, не превышающей уровня, характерного для неактивированных тромбоцитов. Для тромбоцитов новой ФС-положительной субпопуляции характерны высокие значения прямого и бокового светорассеяния, способность связывать фибриноген/фибрин и наличие активного интегрина аІІЬрЗа. Показано, что секреция тромбоцитов в процессе активации увеличивает количество тромбоцитов в обеих ФС-положительных субпопуляциях, но не влияет на соотношение между ними. Показано, что тромбоциты новой субпопуляции формируются в результате межклеточных взаимодействий с участием интегрина аІІЬрЗа. При снижении концентрации активируемых тромбоцитов ниже 5 х 107мл, вновь выявленная вторая ФС-положительная субпопуляция не образуется.
Научно-практическое значение. Полученные результаты позволяют по-новому взглянуть на роль активации тромбоцитов в свертывании крови. Тромбоциты вновь открытой субпопуляции, сочетающие прокоагулянтные и агрегационные способности, представляются наиболее важными участниками свертывания крови. Полученные результаты по-новому раскрывают роль межклеточных взаимодействий в процессе
активации тромбоцитов. Также результаты, полученные в работе, дают новое представление о возможном дополнительном влиянии на гемостаз антагонистов интегрина аІІЬрЗа, использующихся в терапии сердечно-сосудистых заболеваний. Положения, выносимые на защиту:
1) Концентрации кальция, наблюдаемые в тромбоцитах при сильной активации,
находятся в пределах динамического диапазона флуоресцентного Са2+-флуорофора
Fura Red. В отличие от Calcium Green-1, она может использоваться для исследования
кальциевой сигнализации в субпопуляциях тромбоцитов крови.
2) Экспрессия фосфатидилсерина укутанными тромбоцитами сопровождается
продолжительным увеличением концентрации кальция в цитоплазме.
3) При активации тромбоцитов в физиологических концентрациях формируется
новая субпопуляция тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, которая
характеризуется:
а) низким уровнем внутриклеточного кальция
б) более высоким сигналом прямого и бокового светорассеяния, чем у укутанных
тромбоцитов
в) поверхностью, покрытой фибриногеном
г) наличием активированного интегрина аІІЬрЗ, в отличие от ранее описанных
укутанных тромбоцитов.
4) Формирование этой субпопуляции прокоагулянтных тромбоцитов при
физиологической концентрации обусловлено межклеточными взаимодействиями через
интегрин аІІЬрЗ в процессе активации.
Апробация работы. Работа прошла апробации: 26 марта 2012 года на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.
Результаты диссертационной работы были представлены: 12-я международная школа-конференция "Биология наука XXI века" (Пущино, Россия, 10-14 ноября 2008), 36th FEBS Congress, (Турин, Италия, 25-30 июня 2011), XXIII Congress of the international society on thrombosis haemostasis (ISTH) (Киото, Япония, 23-28 июля 2011).
Публикации. По материалы диссертационной работы опубликовано 6 научных работ. Статей в рецензируемых журналах - 1; публикаций в трудах конференций и съездов - 5
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 83 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов, главы 3 - описание экспериментальных результатов, главы 4 - обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 88 источников. Работа выполнена на базе Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный
центр РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф., д.б.н. Атауллаханов Ф.И.) и Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией д.ф-м.н. Пантелеев М. А.).
Похожие диссертации на Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов
