Содержание к диссертации
Введение
Список используемых сокращений 5
1. Введение 6
2. Обзор литературы 9
2.1 Роль механических свойств клеток в биологии и медицине 9
2.2 Структурные компоненты животных клеток, определяющие их механические свойства 10
2.2.1 Клеточная мембрана 10
2.2.2 Клеточное ядро 10
2.2.3 Элементы цитоскелета 11
2.2.4 Актиновый цитоскелет 13
2.2.5 Регуляция актинового цитоскелета 17
2.3 Измерение механических свойств животных клеток 24
2.3.1 Механические модели для описания клетки 24
2.3.2 Методы измерения механических свойств клеток 27
2.4 Атомно-силовая микроскопия животных клеток 28
2.4.1 Принцип действия АСМ 28
2.4.2 Визуализация животных клеток с помощью АСМ 32
2.4.3 Взаимодействие кантилевера с клеткой 34
2.5 Измерение механических свойств животных клеток с помощью АСМ 38
2.5.1 Силовая спектроскопия клеток 38
2.5.2 Измерение вязкоупругих свойств клеток 49
2.6 Особенности структуры цитоскелета и механических свойств опухолевых клеток 52
2.7 Перспективы использования АСМ для исследования эмбрионов 57
3. Материалы и методы 61
3.1 Исследуемые объекты 61
3.1.1 Фибробласты мыши 613
.2 Астроциты и нейроны культуры СМГ 61
3.1.3 Трансформированные и контрольные клеточные линии 62
3.1.4 Эмбрионы Xenopus laevis 63
3.2 Методы 63
3.2.1 Атомно-силовая микроскопия для визуализации объектов 63
3.2.2 Силовая спектроскопия 65
3.2.3 Атомно-силовая микроскопия для измерения вязкоупругих свойств 67
3.2.4 Реология модельных объектов (полиакриламидных гелей) 67
3.2.5 Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия и проточная цитофлуориметрия 68
3.2.6 Статистическая обработка данных 69
4. Результаты и их обсуждение 70
4.1 Разработка методики обработки данных АСМ для измерения механических свойств образца 70
4.2 Проверка методики на модельных объектах (полиакриламидных гелях) 72
4.3 Визуализация клеток с помощью АСМ 75
4.3.1 Сканирование фиксированных клеток на воздухе 75
4.3.2 Сканирование фиксированных клеток в жидкости 78
4.3.3 Сканирование живых клеток в среде культивирования 78
4.4 Силовая спектроскопия клеток с использованием острых кантилеверов 86
4.5 Силовая спектроскопия клеток с использованием модифицированных кантилеверов 90
4.5.1 Влияние положения ядра на измеряемый модуль Юнга клеток 92
4.5.2 Влияние степени конфлюентности на модуль Юнга клеток 93
4.6 Сопоставление механических свойств нормальных и трансформированных клеток 97
4.7 Изучение влияния биохимических воздействий, приводящих к изменению структуры актинового цитоскелета, на нормальные и опухолевые клетки 103
4.8 АСМ эмбрионов Xenopus laevis 105
4.8.1 Исследование фиксированных эмбрионов Xenopus laevis на разных стадиях эмбриогенеза 107
4.8.2 Исследование живых эмбрионов Xenopus laevis 116
4.9 Силовая спектроскопия живых эмбрионов Xenopus laevis 120
5. Заключение 122
Выводы 123
Благодарности 125
Приложения 126
Список литературы 129
- Структурные компоненты животных клеток, определяющие их механические свойства
- Измерение механических свойств животных клеток с помощью АСМ
- Атомно-силовая микроскопия для визуализации объектов
- Сканирование живых клеток в среде культивирования
Структурные компоненты животных клеток, определяющие их механические свойства
Всё большее количество экспериментальных фактов указывает на важную роль механических свойств клеток в процессе их жизнедеятельности. Традиционно в клеточной биологии функционирование клеток рассматривается с точки зрения потребления энергии, скорости деления, экспрессии генов, активности ферментов. В то же время, клетка является объектом с характерными механическими свойствами, определяющими её способность сопротивляться внешним силам или генерировать их. В ходе выполнения функций клетки подвергаются влиянию огромного количества внешних физических силовых воздействий, например, при сохранении формы и перемещении в пространстве (эритроциты, проходящие через узкие капилляры, или фагоциты, мигрирующие к зоне воспаления). Механические свойства играют одну из ведущих ролей в процессах взаимодействия клетки с субстратом, внеклеточным матриксом, другими клетками; в движении клетки как целого и отдельных её частей, в механизмах механочувствительности и механотрансдукции – преобразования механических сигналов в биохимические. Данные события особенно важны при развитии эмбриона, сокращении мышц, работе связок, перемещении клеток в кровеносных сосудах и тканях, при развитии злокачественных опухолей и метастазировании [114].
Для описания механических свойств клеток используют модуль Юнга (обычный или комплексный), вязкость, времена релаксации напряжений и некоторые другие величины, используемые в механике сплошных сред. Их измерение является довольно трудной задачей ввиду малых размеров клеток (десятки микрометров), необходимости поддержания их жизнеспособности во время экспериментов, низких значений модулей упругости (100 Па – 100 кПа). В последние годы для измерения механических свойств клеток было разработано несколько методов, одним из которых является атомно-силовая микроскопия (АСМ).
Возможность исследования живых объектов, находящихся в физиологическом окружении является важнейшим преимуществом АСМ перед другими методами микроскопии, в частности, перед электронной микроскопией. В настоящее время происходит постепенный переход от визуализации клеток при помощи АСМ к изучению их локальных механических свойств, а также к микро- и наноманипулированию. Изучение живых клеток может быть выделено в специальное направление АСМ из-за существующих технических и методических сложностей. Множество важных свойств клеток проявляются только в составе многоклеточного организма (например, в эмбрионе), однако методики работы на АСМ с такими объектами практически отсутствуют. Многие вопросы обработки данных АСМ для расчета механических свойств клеток остаются нерешенными. В связи с этим, одной из поставленных здесь задач является развитие методик работы с живыми объектами – клетками и эмбрионами – с использованием АСМ.
Огромную и, возможно, ведущую роль в определении механических параметров клетки играет цитоскелет. При этом наибольший вклад в большинстве типов животных клеток вносит актиновый цитоскелет, представляющий собой структурированную трёхмерную сеть филаментов [114]. Он также отвечает за форму, подвижность клеток, внутриклеточный транспорт, играет роль в митозе.
Вопрос о том, каким образом перестройки цитоскелета приводят к изменению механических свойств клетки, остается открытым. В регуляции цитоскелета участвует большое количество различных биомолекулярных комплексов. В их число входят как белки, непосредственно участвующие в сборке/разборке и стабилизации актинового цитоскелета (актин-связывающие белки формин, Arp2/3, кофилин, миозин и другие), так и белки, определяющие их активность (Rho ГТФазы, ROCK и другие). В настоящее время есть данные о роли некоторых из этих белков в клеточной подвижности, но практически отсутствуют данные об их влиянии на механические свойства.
Актуальность работы также связана с открытием различий в жесткости нормальных и опухолевых клеток [49, 239]. Низкий модуль Юнга (модуль упругости или просто жесткость) – новый недавно обнаруженный маркер многих опухолевых клеток, который в некоторых случаях коррелирует с метастатическим потенциалом [88, 139]. Предположительно, особые механические свойства опухолевых клеток играют важную роль в метастатических процессах, когда происходит активная миграция клеток в тканях, интравазация и экстравазация, для чего также требуется активное изменение структуры цитоскелета [75]. Строение и регуляция актинового цитоскелета в опухолевых и нормальных клетках сильно отличаются, что, возможно, связано с изменениями в экспрессии и активности регуляторных белков [181]. С учетом того, что цитоскелет представляет собой многоуровневую и подвижную систему, объяснение механизмов регуляции его структуры и сопоставление таких механизмов в нормальных и опухолевых клетках является чрезвычайно сложной задачей. В частности, остаются неясными особенности регуляции многих ключевых белков, отвечающих за состояние актинового цитоскелета в опухолевых клетках, и их влияние на механические свойства клеток. Изучение эффектов различных ингибиторов и активаторов этих белков с помощью АСМ и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) может помочь установить регуляторные пути, ведущие к появлению фенотипа опухолевой клетки. Цели и задачи исследования
Цель работы состоит в установлении роли актинового цитоскелета в определении механических свойств клеток; установлении влияния трансформации и различных воздействий, приводящих к изменению актинового цитоскелета, на механические свойства различных клеточных линий и эмбрионов.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи: 1. Разработать методику измерения механических свойств с помощью АСМ на модельных объектах – полиакриламидных гелях, сравнить ее с классической реологией. 2. Получить с помощью АСМ и проанализировать изображения живых клеток в жидкости, измерить их механические свойства в различных состояниях. 3. Определить взаимосвязь между структурой актинового цитоскелета и механическими свойствами нормальных и трансформированных клеток. 4. Исследовать влияние различных биохимических воздействий, приводящих к изменению структуры актинового цитоскелета, на механические свойства нормальных и трансформированных клеток. 5. Разработать методику для исследования клеток в составе организма на примере эмбрионов Xenopus laevis с помощью АСМ, получить изображения живых и фиксированных эмбрионов на разных стадиях, определить влияние полимеризации актина на механические свойства эмбрионов.
Измерение механических свойств животных клеток с помощью АСМ
Продавливание мембраны кантилевером при сканировании в контактном режиме подтверждается также следующими факторами: - при увеличении силы воздействия цитоскелет становится более рельефным на топографических изображениях, а измеряемая высота клетки уменьшается [86]; - при сканировании в полуконтактном режиме, когда из-за высокой частоты воздействия проявляются вязкоупругие свойства клеток и растет эффективная жесткость, элементы цитоскелета видимы значительно хуже или вообще отсутствуют на изображениях [170, 218]; - высота фиксированных клеток (например, с помощью формальдегида) значительно больше, так как фиксирование на несколько порядков увеличивает жесткость клетки. Элементы цитоскелета после фиксирования обычно не различимы [30, 272]; - высота клеток, измеренная с помощью метода силового картирования (описан далее) при нулевой силе значительно больше, при увеличении силы становятся видимыми элементы цитоскелета [194, 195]; - высота клеток больше при измерении методом сканирующей микроскопии на основе ионной проводимости, когда зонд напрямую не контактирует с клеткой и поэтому не оказывает на неё воздействия [200].
Таким образом, при сканировании в контактном режиме можно наблюдать цитоскелет: мембрана легче проминается между его упругими фибриллами. Можно следить за его перестройками в ходе различных процессов, что является интересной и актуальной задачей. Приближенную к истинной топографию поверхности получают при сканировании с очень низкой силой (30 пН) или в полуконтактном режиме. При этом элементы цитоскелета не видны, а поверхность мембраны в некоторых случаях можно изучать с разрешением 10 – 20 нм [87]. В таких экспериментах на поверхности мембраны часто наблюдают мелкие объекты, по-видимому, мембранные белки, но идентифицировать их не представляется возможным, так как АСМ в данном случае дает информацию только о морфологии поверхности. Отметим, что при исследовании живых клеток цитоскелет виден не всегда: его не видно на многих опухолевых, эпителиальных, эндотелиальных клетках. Это, по-видимому, связано с его строением в данных типах клеток: с отсутствием толстых пучков фибрилл и/или их расположением относительно мембраны (например, на большой глубине).
Увеличить разрешение метода АСМ можно с помощью процедуры фиксации клеток. Цель фиксации – быстрая остановка биохимических процессов в образце и изменение его вязкоупругих свойств таким образом, чтобы закрепить и сохранить его морфологические структуры. Фиксация может быть химической или с использованием физических методов (криометоды, вакуумная сублимационная сушка и др.). Для химической фиксации наиболее часто используют альдегиды: формальдегид, глутаровый альдегид. Фиксирующие действия альдегидов связаны, главным образом, с их реакцией с клеточными белками. Например, формальдегид вступает в реакцию с активным атомом водорода белков с образованием метиленового мостика (активным водородом аминогруппы белков, сульфгидрильных связей, гуаниновых и фенольных групп). Механизм фиксирующего действия глутарового альдегида до конца не известен, возможно, образуются сшивающие мостики из его олигомеров, причем молекулы белков сшиваются более прочно, чем в случае формальдегида. Глутаровый альдегид обеспечивает лучшую сохранность морфологических образований в поверхностном слое клеток, его чаще используют для целей сканирующей электронной микроскопии [8]. Жесткость клеток повышается при фиксации на несколько порядков, а, следовательно, растет и разрешение метода АСМ. Разрешение метода АСМ на мягких образцах напрямую связано с продавливанием и определяется площадью контактной площадки [30]. Эти параметры можно оценить, зная характеристики кантилевера, приложенную силу, модуль Юнга образца и воспользовавшись соответствующей моделью взаимодействия зонд-образец. Как правило, для стандартных кантилеверов из нитрида кремния и умеренных силах воздействия радиус контактной площадки на живых клетках составляет 300 нм. На фиксированных клетках, когда жесткость увеличивается на 1-2 порядка, радиус уменьшается до 30-100 нм и менее. Считается, что радиус контактной площадки ограничивает максимальное разрешение на данном образце. Разрешение на мягких образцах может быть улучшено при использовании мягких кантилеверов и чувствительных систем детекции их отклонения [30].
Однако, на фиксированных клетках, как говорилось выше, цитоскелет обычно не виден. Для его наблюдения одновременно с фиксацией производят удаление клеточной мембраны детергентами [22]. При этом удаляется мембрана, часть цитоплазмы и водорастворимых белков, и филаменты цитоскелета обнажаются. Их можно исследовать как в жидкости, так и на воздухе.
Таким образом, регулируя силу воздействия со стороны зонда, можно изучать как поверхность клетки с высоким разрешением, так и устройство внутренней среды клетки, а именно цитоскелета. При больших силах воздействия с помощью АСМ можно наблюдать деформацию и изменение морфологии клетки, поврежденной кантилевером, или можно направленно повреждать клетку в интересующем месте [161]. Это было сделано на примере нейронов: после разрезания мембраны кантилевером вдоль линии цитоплазма клетки вытекала и образовывала ореол, в котором контуры клетки были слабо различимы. Выяснилось, что при повреждении аксона клетка остается живой: можно перерезать аксон кантилевером множество раз, и это не приведет к гибели клетки. К гибели приводил надрез на теле клетки на глубину 100 нм длиной менее 3 мкм.
Тромбоциты способны активироваться под действием механического воздействия со стороны кантилевера, причем активация сопровождается изменением их формы и структуры цитоскелета [78]. При небольшой силе воздействия тромбоциты, адсорбированные на подложку, можно сканировать длительное время, не вызывая в них изменений. Однако увеличение силы, с которой осуществляется сканирование, ведет к их активации.
Влияние кантилевера на морфологию клетки существенно зависит от типа клеток. Это было показано при сопоставлении изображений двух типов клеток: клеток нейробластомы линии SK-N-SH и клеток сирийского хомяка линии AV12 [271]. Было обнаружено, что плотная адгезия является одним из важнейших факторов, влияющих на выживание клеток в процессе сканирования. Для выживания клеток линии AV12 требуется как наличие межклеточных контактов, так и адгезия к межклеточному матриксу. При выращивании на стекле клетки этой линии образуют группы, сцепленные между собой волокнами матрикса. Когда целостность группы нарушается, клетки быстро сметаются кантилевером с подложки (рис. 10). В отличие от них, клетки линии SK-N-SH располагаются на подложке преимущественно поодиночке. Под действием кантилевера в процессе сканирования клетки этой линии начинают сжиматься, для них межклеточные контакты относительно неважны. Слабая адгезия клеток также является одним из факторов, которые мешают получению высокого пространственного разрешения в экспериментах с живыми клетками на АСМ [25].
Атомно-силовая микроскопия для визуализации объектов
В программе OriginPro был разработан скрипт для обработки силовых кривых (СК). Изначально СК представляет собой график зависимости электрического тока на фотодетекторе (нА) от вертикального смещения пьезосканера (рисунок 16). Основной задачей скрипта является определение модуля Юнга в данном измерении. Скрипт для обработки СК состоит из нескольких частей.
1. В первой части, подготовительной, из СК вычитается общий наклон, так, чтобы привести к нулю начальную часть кривой. Общий наклон может быть обусловлен особенностями настройки лазерно-оптической системы регистрации изгиба кантилевера, а также его термальным дрейфом. На предшествующем контакту участке СК, обычно являющемся линейным, выбираются две точки, по возможности захватывающие максимальный линейный диапазон. Отрезок между этими точками аппроксимируется линейной зависимостью с использованием метода наименьших квадратов. Затем производится вычитание данной линейной зависимости из всей СК. При необходимости производится обращение оси абсцисс, чтобы смещение пьезосканера представлялось положительной величиной. В результате получается СК, в которой начальный участок имеет примерно нулевой наклон и совпадает с осью абсцисс.
2. Во второй части осуществляется поиск точки контакта, для чего пользователь указывает диапазон, в котором она должна находиться. Для этого выбираются две точки, одна на 500-1000 нм левее предполагаемой точки контакта, вторая – на 100-200 нм правее, на участке индентирования. Скрипт с помощью алгоритма нелинейной регрессии производит аппроксимацию окрестности точки контакта комбинацией двух функций: линейной (область до контакта) и степенной (показатель степени 3/2 для модели Герца и 2 для модели Снеддона, область контакта). Точка пересечения этих функций считается точкой контакта.
3. В третьей части СК переводится в координаты сила – глубина продавливания с использованием известных значений координат точки контакта, чувствительности лазерно-оптической системы и жесткости кантилевера. Далее с помощью алгоритма нелинейной регрессии проводится аппроксимация данных моделью Герца или Снеддона и рассчитывается значение модуля Юнга для выбранного диапазона глубин продавливания. По умолчанию используется диапазон 0-500 нм, то есть первые 500 нм индентирования. Вычисляется также достоверность аппроксимации, параметр R2.
4. Дополнительно может быть произведен расчет зависимости модуля Юнга от глубины индентирования. В этом случае происходит прямое вычисление модуля Юнга при подстановке в формулу глубины индентирования и величины силы, действующей на кантилевер в данной точке. В более сложном варианте скрипта для каждой точки продавливания осуществляется вычисление модуля Юнга с помощью аппроксимации (алгоритм нелинейной регрессии) участка от точки контакта до данной глубины.
Типичная точность аппроксимации выбранного участка СК с помощью разработанного скрипта (скорректированный коэффициент детерминации) R2 = 0,8 – 0,99, что свидетельствует об адекватности используемых моделей.
Также был разработан скрипт для обработки данных, полученных в экспериментах по изучению вязкоупругих свойств образцов. В скрипте проводится БПФ сигналов DFL (отклонение) и SensHeight (положение пьезотрубки), для них находится частота и амплитуда колебаний, сдвиг фаз между ними. Сначала такая обработка производится для сигналов, снятых на поверхности стекла (твердого материала), для установления так называемого лага пьезосканера. В идеальном случае сдвиг фаз между сигналами DFL и SensHeight на твердой поверхности должен быть нулевым, но из-за задержек в оцифровке, эффектов крипа и гистерезиса он имеет некоторое небольшое значение, пропорциональное частоте колебаний, которое в дальнейшем учитывается при обработке данных.
Рисунок 16. Обработка силовых кривых. (A) Первый шаг – вычитание фонового наклона. (Б) Второй шаг – поиск точки контакта. Показан выбранный для поиска диапазон. (В) Третий шаг – перевод в координаты сила – продавливание, поиск модуля Юнга.
Для учета гидродинамической силы проводились дополнительные измерения над поверхностью образца. Как было показано в работе [11], гидродинамическая сила прямо пропорциональна частоте колебаний и увеличивается при приближении к поверхности. Поэтому измерения проводились на одной частоте (100 Гц) на минимальных высотах над образцом ( 100 нм), когда взаимодействие зонда с поверхностью еще не происходит. Наличие взаимодействия отслеживали по изменению в амплитуде колебаний кантилевера.
Проверка методики на модельных объектах (полиакриламидных гелях)
В работе в качестве модельных объектов, чьи вязкоупругие свойства можно измерить методами классической реологии, были использованы ПААГ с концентрациями мономеров (акриламид/бисакриламид, %) 4/0,1; 4/0,3; 6/0,1; 6/0,3. На тестовых образцах гелей на реометре был измерен линейный диапазон вязкоупругих свойств, для чего в режиме колебательных измерений увеличивали амплитуду деформации от 0,01 до 300%. Пересечение модулей сохранения и потерь наступало при деформациях около 25%, при более высоких деформациях происходили нарушения в структуре геля. В дальнейшем эксперименты проводили при постоянной деформации 1%, что гарантировало нахождение в линейном диапазоне вязкоупругих свойств. В тестах с частотной разверткой (0,05-100 Гц) был обнаружен рост и действительной, и мнимой частей комплексного модуля сдвига при частотах выше 5 Гц. При этом действительная часть значительно превосходила мнимую на исследуемых частотах (рисунок 17). Однако на частотах выше 10-30 Гц было замечено проскальзывание образца ПААГ между плоскостями геометрии, что, скорее всего, приводило к ошибкам в измерениях. Поэтому рассматривали только измерения, полученные на частотах до 10 Гц. Для перехода от модуля сдвига к модулю Юнга для ПААГ использовали коэффициент Пуассона 0,45 [29, 242]. При сравнении с данными АСМ брали значение модуля Юнга, полученное на частоте 1,83 Гц. Данная частота находилась на стадии плато – когда модуль Юнга еще не растет, при этом действительная его часть существенно превосходила мнимую (примерно в 100 раз). Полученные значения модулей Юнга ПААГ с используемыми концентрациями мономеров были близки к литературным данным [29, 247], увеличение концентрации мономеров вело к росту жесткости геля.
В экспериментах по АСМ на одном и том же образце (ПААГ 4/0,1) было показано, что значения, полученные кантилеверами с микросферами (E = 1480±150 Па) значительно меньше значений, полученных обычными острыми кантилеверами (E = 2800±630 Па), и стандартное отклонение в последнем случае намного выше (коэффициент вариации в первом случае 4%; во втором – 23%). Данный факт известен в литературе, его связывают с высокими локальными напряжениями при использовании острых игл, ведущими к нарушению условий применимости модели Снеддона [201]. Значения модулей Юнга ПААГ, полученные кантилеверами с микросферами, находятся в лучшем соответствии с результатами измерений, выполненных на реометре. При этом наилучшее соответствие наблюдается для значений модуля Юнга, полученных при обработке силовых кривых на глубинах более 500 нм (скорректированный коэффициент детерминации R2 = 0,99) (рисунок 18). Возможно, вблизи поверхности геля полимеризация идет хуже, поэтому на меньших глубинах значения модуля упругости ниже.
Сканирование живых клеток в среде культивирования
Возможность исследования живых объектов в их физиологическом окружении является большим преимуществом АСМ перед многими другими методами микроскопии, и, в частности, перед электронной микроскопией. Однако при работе с живыми объектами на АСМ возникает много методических трудностей – они обсуждались в литературном обзоре. Несмотря на эти трудности, в данной работе с помощью АСМ была исследована поверхность живого эмбриона. Удалось получить временную серию изображений одной и той же области поверхности образца и зарегистрировать клеточные перестройки с течением времени in vivo (рисунок 53). Самые ранние стадии эмбриогенеза на живых образцах Xenopus laevis методом АСМ исследовать не удается из-за слишком большой кривизны поверхности, особенно в областях борозд деления. Дополнительной помехой является короткое время их существования. Поэтому исследования живых эмбрионов проводили со стадий поздней бластулы – ранней гаструлы. Именно эти стадии наиболее интересны из-за интенсивных морфогенетических движений клеток на поверхности [118].
Клеточные перестройки в ходе гаструляции Xenopus laevis относятся к общим механизмам морфогенетических изменений в тканях эмбриона [82]. Одним из морфогенетических процессов в ходе гаструляции является инволюция клеток мезодермы в области, называемой бластопором. В это же время происходит радиальная интеркаляция клеток глубоких слоев в более поверхностные. В результате происходит эпиболия – морфогенетический процесс, при котором эпителий эктодермы разрастается и покрывает большую часть поверхности эмбриона. Также происходит конвергентное расширение, при котором происходит интеркаляция клеток к средней линии ткани, в результате чего ткань сужается и удлиняется в антерио-постериорном направлении. Конвергентное расширение идет и в эпителиальных, и в мезенхимальных тканях. Некоторые эксперименты подтверждают, что силы, вызывающие конвергентное расширение, генерируются глубоко расположенными мезенхимальными клетками и что эпителиальный пласт мезодермального и нейрального регионов пассивно растягивается за счет этих сил. Однако эти области эпителия могут быть специализированы таким образом, чтобы пассивные клеточные перестройки осуществлялись более легко по сравнению с регионами, где в норме не происходит конвергентное растяжение [118]. Чтобы перестраиваться внутри эпителия, клетки должны быть способны быстро разрушать и переделывать клеточные контакты с соседями без образования нарушений в проницаемости барьера, обусловленного этими плотными контактами [90]. Изучение клеточных движений в ходе морфогенеза является довольно сложной задачей.
Клеточные движения на поверхности живого эмбриона удалось визуализировать методом АСМ. Пример серии последовательных изображений приведен на рисунке 53, где показана перестройка клеток на поверхности эмбриона на стадии ранней гаструлы. На топографическом изображении клеточные границы выглядят как возвышения шириной 1-2 мкм и высотой 50-100 нм, в местах стыка до 300 нм. В данном месте расположена многоклеточная структура, похожая на розетку, когда границы соседних клеток сходятся в одну точку. Подобные структуры наблюдались в ходе мезенхимного перехода в первичной полоске эмбрионов птиц и в ходе растяжения зародышевой полоски у дрозофилы [27, 253]. Их роль в развитии эмбриона Xenopus laevis пока до конца не ясна. На сканах можно видеть, как клетки, составляющие розетку, меняют свою форму. Наблюдается последовательное разрешение розетковидной структуры. Помеченная звездочкой клетка постепенно изменяет форму с треугольной на прямоугольную. Подобный процесс наблюдался и у дрозофилы с GFP-меченными мембранными белками [27]. Средняя скорость относительного перемещения клеточных границ, измеренная по АСМ-изображениям (скорость удлинения/укорочения фрагмента клеточной границы), составляет 0,5 – 1,5 мкм/мин. Эта оценка по порядку величины совпадает с данными микрокиносъемки: скорость перемещения клеток в области бластопора составляет 1,8 – 4 мкм/мин [119]. Проведению измерений мешает дрейф, который оказывается гораздо сильнее, чем при работе с фиксированными эмбрионами. Он может быть отчасти связан с перемещениями исследуемой области по поверхности эмбриона из-за движения окружающих клеток. В целом, АСМ можно рассматривать как новый метод визуализации клеточных движений на поверхности эмбриона, не требующий дополнительной пробоподготовки.
Серия кадров с поверхности живого эмбриона (11 стадия), контактный режим АСМ в жидкости. Топография (A, C, E) и сигнал ошибки обратной связи (B, D, F). Показано разрешение розетковидной структуры из клеток. Время на 1 кадр – 5 минут, сканы (A) и (C) получены подряд, (C) и (E) через один. Одна и та же клетка, отмеченная на кадрах звездочкой, меняет свою форму. На топографических изображениях границы клеток, образующих структуру в виде розетки выделены зелеными линиями, клетки пронумерованы.
Кроме смещений клеточных границ, на поверхности живого эмбриона с помощью АСМ можно увидеть и другие структурные изменения. На изображениях, представляющих ошибку обратной связи, наблюдались структуры, которые были интерпретированы как микроворсинки и подмембранный цитоскелет (рисунок 54). Микроворсинки – небольшие возвышения ( 50 нм на топографическом изображении) диаметром менее 1 мкм, расположенные с плотностью 0,8 ± 0,1 мкм-2 – это значение близко к полученному на фиксированных образцах (смотри выше). Они есть не на всех клетках, расположены ближе к границам, однако некоторые клетки целиком покрыты ими. На серии последовательных кадров можно наблюдать за изменением количества и расположения микроворсинок на клетках. Подмембранный цитоскелет наблюдается как сеть на поверхности [216]. Он по-разному выражен у разных клеток и очень динамичен – на двух последовательных кадрах выглядит совершенно по-разному (рисунок 54А и В). Перестройки в цитоскелете выглядят как изменения в положении углублений, выступов и фибрилл на последовательных кадрах.
Рисунок 54. Два последовательных изображения (сигнал ошибки обратной связи) с поверхности живого эмбриона (10 стадия, гаструла, время на 1 кадр – 5 минут). В области, выделенной квадратом 1, микроворсинки на втором кадре исчезли. В области, выделенной квадратом 2, произошла перестройка цитоскелета (исчезла яма) и появилось несколько микроворсинок.
