Введение к работе
Актуальность темы Современная молекулярная биология стремительно расширяет круг знаний, область интересов перемещается от одиночных молекул к более сложным молекулярным машинам, растет потребность в структурной информации о комплексах нанобиообъектов. В настоящее время в мире расшифровано более 80000 атомных структур белков, в их числе мембранные белки, ионные каналы, аквапорины, рибосомальные субъединицы и др. Однако структура одиночного компонента может рассматриваться только как первый шаг к пониманию основ функционирования всей системы в целом. Известно, что изменение конформационного состояния белка отражается на его функциональной активности (Рубин, 2004). Знание структуры макромолекулярных комплексов дает возможность интерпретировать конформационные изменения в молекулах в процессе их активации и автоингибирования, а также при связывании с лигандами и/или плазматической мембраной.
Признанными методами для изучения структуры и конформационных изменений в белковых молекулах являются: рентгеноструктурный анализ, ЯМР, метод спиновых меток, детекция люминисценции и спектроскопические методы (Вассерман, Коварский, 1986; Stock et al, 2005; Tyszka et al, 2005). Каждый из этих методов имеет свои преимущества и ограничения. Большинство методов способны детектировать лишь незначительные изменения полипептидной цепи и далеко не всеми методами можно определить, какая часть белка и как изменила свою конформацию. В то же время, современный метод просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) макромолекул позволяет визуализировать не только трехмерную структуру, но и динамику самых разнообразных биологических нанообъектов с разрешением от 2-5 нм до атомного (0,2 нм). Метод ПЭМ не связан многими недостатками перечисленных выше структурных методов: в нем нет лимитирующего размера частиц, не обязательно наличие кристаллов, количество используемого материала достаточно мало, крио-модификация метода ПЭМ позволяет наблюдать молекулы в нативном водном окружении в состоянии, близком к физиологическому. В сочетании с методом реконструкции макромолекул (van Heel and Frank, 1981) и фиттингом кристаллических структур, ПЭМ белков
позволяет получить представление о трехмерной структуре и конформационных изменениях макромолекулярных комплексов.
В данной диссертационной работе метод ПЭМ использовался для получения впервые трехмерных структур крупных мембранных и цитоплазматических глобулярных белков, а также для изучения основ формирования фибриллярных структур белками паутины, спидроинами. В последние пять лет изучению молекулярного строения мембранных белков (ионных каналов и транспортеров) уделяется особое внимание во всем мире в связи с разработкой новых эффективных лекарств против таких болезней, как рак (Wang et al, 1996), сердечные заболевания (Schmitt et al, 2000), эпилепсия (Misonou et al, 2005; Singh et al, 2006). Однако до сих пор многие ионные каналы не изучены в должной мере из-за сложностей с кристаллизацией мембранных белков. Расшифрованная атомная структура крупных актинсвязывающих белков (АСБ) была бы незаменима при разработке фармацевтических препаратов против целого ряда заболеваний, связанных с нарушением клеточной подвижности (Васильев, 1997; Geiger and Peeper, 2009). В тоже время атомных структур многих полноразмерных АСБ до сих пор получить не удалось. Относительно недавно в качестве материала для тканевой инженерии был предложен рекомбинантный белок паутины спидроин (Moisenovich et al, 2009). В связи с тем, что искусственные матриксы определяют механические свойства и форму имплантата, формируют субстрат для адгезии клеток, представляется актуальным исследовать четвертичную структуру входящего с их состав спидроина.
Целью работы является разработка комплексного подхода к изучению четвертичной структуры белковых молекул на основе просвечивающей электронной микроскопии. Для достижения цели решаются следующие задачи:
-
Формулировка основных положений комплексного подхода к изучению четвертичной структуры белков;
-
Получение трехмерных структур ряда мембранных и цитоплазматических белков с разрешением 1,8-2,5 нм;
-
Построение молекулярных моделей белков на основе моделирования по гомологии и фиттинга;
-
Изучение конформационных перестроек в белковых молекулах при активации, взаимодействии с лигандами и с плазматической мембраной;
Научная новизна результатов
В работе впервые:
-
Получены трехмерные структуры калиевых потенциал-зависимых каналов Kv1.1, Kv2.1, Kv10.2 и их транкированных мутантов с разрешением 2,0-2,5 нм;
-
Получены трехмерные структуры актинсвязывающих белков (mDial, Агр2/3, Srv2, IRSp53) и их олигомеров с разрешением 1,8-2,5 нм;
-
Построены молекулярные модели полноразмерных белков: ионного канала Kv10.2, АСБ mDial и IRSp53 на основе моделирования по гомологии и фиттинга;
-
Показано наличие конформационных перестроек в цитоплазматических доменах калиевых потенциал-зависимых каналов при межмолекулярных взаимодействиях и активации;
-
Изучены структурные основы кластеризации потенциал-зависимых каналов семейства Kv10;
-
Определены конформации комплекса Агр2/3 в нативном состоянии и при связывании с лигандами и выяснена связь Агр2/3 с функциональной активностью клетки;
-
Показано, что автоингибирование формина mDial связано со стерическим блокированием сайтов связывания актина;
-
Предложена гипотеза изменения конформационного состояния формина в зависимости от его функционального состояния;
-
Определено олигомерное строение комплекса Srv2, и показано, что олигомер N-концевых доменов Srv2 способен разрезать полимеризованый F-актин в присутствии кофилина;
-
Изучены структурные основы активации и модификации плазматической мембраны I-BAR белками;
-
Разработана модель для изучения фолдинга белков паутины и изучена структура нанофибрилл спидроина I.
Практическая значимость работы заключается в разработке методологического подхода к изучению структуры белковых молекул на основе электронной микроскопии и молекулярного моделирования. С использованием разработанного подхода были получены трехмерные структуры и изучены важные структурные особенности макромолекул и белок-белковых комплексов, которые до настоящего времени не были подвергнуты кристаллизации, и, следовательно, их атомная структура не была расшифрована. Полученные знания в дальнейшем могут быть применены при исследовании строения белков, белок-белковых
комплексов, и как структурные предпосылки для молекулярного моделирования (направленная доставка лекарств, дизайн новых лекарственных средств), а также для практической работы по детекции и анализу наночастиц биологического происхождения. Результаты моделирования in vitro процессов прядения паутины свидетельствуют о принципиальной возможности разработки биоматериалов с уникальными свойствами на основе рекомбинантных аналогов белков паутины путем имитации природных процессов формирования нитей паутины. Эти результаты используются при производстве матриксов для культивирования клеток в транспланталогии.
Материалы диссертации используются при чтении курсов «Введение в методы микроскопии в биологии» студентам, обучающимся по специальности «Биоинженерия» на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова. Современные методы, изложенные в диссертации, включены в разделы практикумов по биоинженерии на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, используются студентами и аспирантами при выполнении курсовых, дипломных, магистерских и диссертационных работ.
Апробация работы Материалы работы были представлены на научных семинарах кафедры биоинженерии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (2006-2012), лаборатории электронной микроскопии ИКРАН им. А.В.Шубникова (2010) и кафедры биофизики Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (2012), семинарах факультетов Биохимии и Биологии университета Брандайз (2001-2010), семинаре Института мембранной и системной биологии университета Лидс (2007). Основные результаты работы были доложены на следующих международных и отечественных съездах, конференциях, семинарах: Гордоновской конференции по ионным каналам (2000); 54 ежегодной конференции по структуре транспортных белков и каналов и 54 ежегодном симпозиуме Общества основных физиологов США (2000); Ежегодном симпозиуме биофизического общества США (2001); Гордоновских конференциях по узнаванию лигандов и молекулярному управлению (2001; 2002); 1 и 2 международных конференциях по структуре, динамике и функции белков в биологических мембранах (2001, 2003); Гордоновских конференциях по трехмерной электронной микроскопии (2002, 2007, 2008, 2010, 2012); Московских конференциях по вычислительной молекулярной биологии (2007, 2009); конференциях Федерации европейского биохимического общества (FEBS): 30th
FEBS Congress (2005), 32nd FEBS Congress (2007), 33rd FEBS Congress & 11th IUBMB Meeting (2008), 34th FEBS Congress (2009); Международной конференции по структуре F-BAR белков (2009), конференциях Американского микроскопического общества (2010-2012), ежегодных Генеральных ассамблеях проекта EDICT 7 рамочной программы Евросоюза (2007-2012); Конференции Жак Моход «Молекулярные основы моделирования и организации мембран» (2011), IV и V Российских симпозиумах «Белки и пептиды» (2009, 2011), Конференциях общества клеточных биологов США (2006, 2011), международной конференции «Нанотехнологии в онкологии» (2011), 1 международной конференции по новым методам в структурной биологии (2012), IV международном съезде биофизиков (2012).
Публикации Всего по материалам диссертации опубликована 51 печатная работа, включая 24 статьи в реферируемых журналах, главу в коллективной монографии и два учебных пособия.
Личный вклад автора Автором осуществлен выбор направления исследований и постановка задач. Эксперименты, анализ и интерпретация данных проведены лично автором, либо под ее непосредственным руководством или в соавторстве. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Структура работы Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 352 источника. Работа изложена на 219 страницах, содержит 7 таблиц и иллюстрирована 103 рисунками.
Похожие диссертации на Комплексный подход к исследованию структуры белков на основе электронной микроскопии
