Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Проблемы исследования структуры и свойств вирусных и мембранных белков (литературный обзор) 13
1.1 Сведения о структуре бактериофага Т4 13
1.2 Адсорбция бактериофага Т4 на бактерии 14
1.3 Длинные хвостовые фибриллы (ДХФ) 16
1.3.1 Функциональная роль ДХФ 16
1.3.2 Физико-химические характеристики белкового комплекса ДХФ 17
1.3.3 Структурная характеристика белков ДХФ 18
1.4 Короткие хвостовые фибриллы (КХФ) 21
1.4.1 Функциональная роль КХФ 21
1.4.2 Молекулярная организация КХФ 22
1.5 Бактериофаг phiKZ 24
1.6 Фаговая терапия. Энзибиотики 25
1.7 Мембранные белки 27
1.7.1 Бактериородопсин в пурпурных мембранах галобактерий 27
1.7.2 Структура и фотоцикл бактериородопсина 33
1.7.3 Экспрессия бактериородопсина в различных системах 38
1.7.4 Практическое применение бактериородопсина в технике 42
1.8 Методы теоретического исследования структуры белков 45
1.9 Вторичная структура белков 48
1.9.1 Варианты а-спирального coiled-coil 48
1.9.2 Элементы р-структуры в фибриллярных белках вирусов и бактериофагов 50
1.9.3 Элементы вторичной структуры в трансмембранных белках 51
1.10 Выводы по главе и постановка задач исследования 55
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследований .59
2.1 Материалы, использованные в эксперименте по исследованию белков
бактериофагов Т4 и phiKZ (штаммы, ферменты, реактивы) 59
2.2 Материалы, использованные в эксперименте по исследованию бактериородопсина и его делеционных мутантов (штаммы, ферменты, реактивы) 61
2.3 Методы генной
инженерии .65
2.3.1 Методы генной инженерии, использованные в эксперименте по исследованию белков бактериофагов Т4 и phiKZ 65
2.3.2 Особенности методов генной инженерии, использованных при исследовании белка gp181 бактериофага phiKZ с помощью направленного делеционного мутагенеза 69
2.3.3 Методы генной инженерии, использованные
при исследовании бактериородопсина и его делеционных мутантов .72
2.4 Методы компьютерного анализа и биоинформатики, применяемые для теоретического исследования белков 85
2.4.1 Методы биоинформатики для исследования периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках бактериофага Т4 85
2.4.2 Вычислительные методы предсказания вторичной структуры мембранных белков по их аминокислотной последовательности .92
2.5 Заключение по главе 2 .95
ГЛАВА 3 Результаты исследований и их обсуждение .97
3.1 Исследование периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках и литических ферментах бактериофагов Т4 и phiKZ методами биоинформатики .97
3.2 Экспериментальное исследование белков систем инфицирования бактериофагов Т4 и phiKZ 108
3.3 Результаты предсказания вторичной структуры мембранных белков вычислительными методами по их аминокислотным последовательностям 119
3.4 Экспериментальное исследование бактериородопсина (bR) и его делеционных мутантов 135
Заключение 157
Список обозначений и сокращений .160
Список литературы
- Функциональная роль ДХФ
- Структура и фотоцикл бактериородопсина
- Материалы, использованные в эксперименте по исследованию бактериородопсина и его делеционных мутантов (штаммы, ферменты, реактивы)
- Результаты предсказания вторичной структуры мембранных белков вычислительными методами по их аминокислотным последовательностям
Функциональная роль ДХФ
Инфицирование фагом клетки E. coli начинается с обратимого связывания длинных хвостовых фибрилл (ДХФ) с липополисахаридными рецепторами на поверхности бактерии [11]. После того как произошло связывание не менее 3-х ДХФ, короткие хвостовые фибриллы (КХФ) разворачиваются под базальной пластинкой и необратимо связываются с другим типом рецепторов на внешней мембране клетки-хозяина [12]. Затем происходит реорганизация базальной пластинки из шестиугольной формы в форму шестиконечной звезды [12]. Одновременно с этим инициируется сокращение фагового чехла, и происходит инжекция фаговой ДНК в цитозоль клетки через хвостовой стержень, который проникает под мембрану бактерии [11]. В результате сокращения длина фагового чехла уменьшается с 95 нм до 38 нм. Это проникновение осуществляется благодаря комплексу белков gp5 и gp27 (в составе базальной пластинки), который, проходя сквозь внутреннюю мембрану, разрушает слой пептидогликана, позволяя ДНК бактериофага оказаться внутри клетки бактерии [13]. заключается в связывании олигосахаридов периплазматического пептидогликанового слоя для последующего расщепления лизоцимным доменом. Лизоцимный домен gp5 локализован на С-конце молекулы. Он связан линкером 1 с богатым -структурами ОВ доменом и с помощью линкера 2 - с -структурным доменом на С-конце молекулы.
Между С-концевым доменом и доменом лизоцима локализован сайт расщепления gp5 при созревании. C-концевой домен представляет собой -структурный домен, который, по-видимому, входит в цилиндрическую структуру, образуемую тримерами gp27, и служит каналом для проникновения ДНК внутрь клетки (рисунок 1.3).
Когда gp5 встраивается в состав базальной пластинки бактериофага Т4, происходит протеолитическое расщепление gp5 с образованием двух продуктов: gp5 и gp5С, причем оба из них остаются в структуре базальной пластинки. Gp5С – это SDS-устойчивый белок с богатой -структурной составляющей [15]. Комплекс gp5 и gp27, наблюдаемый и in vitro, и in vivo, образует гетералогичный ансамбль (gp27-gp5 -gp5С)3. При повышении температуры комплекс распадается на три гетеродимера (gp27-gp5 ) и гомотример (gp5С)3. Процесс инфицирования не требует энергии извне. Спустя 30 минут после инфицирования происходит разрушение бактериальной клетки, и из нее выходят около 100 новых фаговых частиц.
1.3 Длинные хвостовые фибриллы (ДХФ) 1.3.1 Функциональная роль ДХФ
Длинные хвостовые фибриллы инициируют адсорбцию фага на поверхности бактериальной клетки [16]. Мутанты бактериофага, в которых отсутствуют ДХФ, неинфекционны. Однако при этом присоединение таких мутантов к бактерии наблюдается, хотя оно и не сопровождается сокращением хвостового чехла и вводом фаговой ДНК в цитозоль клетки-хозяина [17]. Известно, что связывание всех длинных и коротких фибрилл с клеточными рецепторами является необратимым [18], однако точное количество рецепторов, необходимое для этого, не определено. При взаимодействии с рецепторами трех длинных хвостовых фибрилл из шести связывание фага с клеткой является обратимым [11].
Процесс прикрепления бактериофага Т4 к поверхности клетки Е. coli осуществляется при взаимодействии дистальной (удаленной от базальной пластинки) части ДХФ с глюкозно-гептозным участком липополисахарид-ных рецепторов клетки [11]. Непосредственной группой взаимодействия является терминальная а-(1-4)-глюкоза [19]. Адсорбция фага с помощью длинных фибрилл сопровождается механизмом запуска структурной реорганизации базальной пластинки, в результате которой происходит сокращение чехла и введение ДНК в клетку [11, 12]. Предполагают, что по длинным хвостовым фибриллам передается сигнал (вероятно, через медиатор - белок gp9) о наличии соответствующих рецепторов, после чего начинается конформационная перестройка базальной пластинки [20, 21]. После присоединения к клеточной стенке коротких фибрилл перестройка базальной пластинки завершается. 1.3.2 Физико-химические характеристики белкового комплекса ДХФ
Препарат длинных хвостовых фибрилл был впервые выделен в 1959 году в результате разрушения фага [22]. В дальнейшем были разработаны методики получения длинных хвостовых фибрилл и в неденатурирующих условиях [23, 24]. Согласно результатам, полученным с помощью электронной микроскопии, длинные хвостовые фибриллы имеют размеры 150 х 4.5 нм с утолщением в середине, которое разделяет их на две части по отношению к базальной пластинке фага – проксимальную (прилежащую к базальной пластинке) и дистальную (удаленную) [25]. Дистальная и проксимальная половинки фибрилл расположены друг к другу под углом около 156o. Они соединены жестко, но нековалентно. С базальной пластинкой ДХФ связаны подвижно, что позволяет им перемещаться относительно частицы фага.
В формировании фибрилл участвуют шесть генов, из которых четыре кодируют структурные белки – gp34, gp35, gp36 и gp37, а два другие гена кодируют белки – gp38 и gp57, которые помогают при сборке, но не включаются в конечную структуру. Впоследствии были определены нуклеотидная последовательность этих генов и аминокислотный состав кодируемых ими структурных белков [1, 26]. Молекулярные массы белков представлены в таблице 1.1.
Стехиометрия белкового комплекса длинных хвостовых фибрилл в течение длительного времени не была точно установлена. Данные, полученные при исследовании белков расчетными методами [27], анализом нуклеотидной последовательности генов [2], количественным SDS электрофорезом c использованием красителей [28] и радиоактивных меток [29] и сканирующей электронной микроскопией (STEM) [30], существенно различались. Однако в результате совершенствования экспериментальных методик и накопления сведений о структурной организации других фибриллярных белков вирусной природы, а также коротких хвостовых фибрилл бактериофага Т4 [31], была выдвинута гипотеза [30], что для длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4 характерна тримерная организация структурных белков, т.е. стехиометрическое соотношение белков gp35, gp34, gp36, gp37 составляет соответственно 1:3:3:3.
Из экспериментальных данных известно, что проксимальная часть длинных хвостовых фибрилл является гомоолигомером gp34. Дистальная же часть сформирована продуктами трех генов: gp35, gp36 и gp37 [2, 27].
Сборка дистальной половинки начинается с тримеризации gp37, в результате чего образуется предшественник фибриллы длиной около 65 нм [2]. На следующем этапе присоединяются три копии gp36 c удлинением предшественника на 17 нм [2]. Формирование длинных хвостовых фибрилл завершается присоединением одной копии gp35, играющего роль соединителя двух половинок фибрилл.
Структура и фотоцикл бактериородопсина
Структурный белок коротких хвостовых фибрилл бактериофага Т4 кодируется геном 12, входящим в кластер поздних генов базальной пластинки [39, 40]. Каждая короткая фибрилла является гомотримером gp12 [38, 43], в состав которого также входит 1 атом цинка на каждую копию gp12 [43]. В сборке коротких хвостовых фибрилл участвует собственный шаперон бактериофага Т4 – gp57 [27]. При изучении структурной организации коротких хвостовых фибрилл и gp12 возникают некоторые затруднения, связанные с тем, что выделенный белок сильно агрегирует и необратимо сорбируется на многих хроматографических носителях [39, 41]. Была разработана методика выделения и очистки gp12 в присутствии мочевины и последующего рефолдинга [42], а также выделения целых КХФ в неденатурирующих условиях [31]. С помощью этой методики удалось получить относительно стабильный в растворе препарат, исследование которого позволило получить ряд детальных сведений о структуре и функциях gp12.
По данным электронной микроскопии длина коротких хвостовых фибрилл составляет 38-52 нм, а диаметр около 2.5 нм. Один из концов фибриллы, соответствующий С-концу gp12, имеет массивную “головку” длиной около 10 нм. Вдоль белковой молекулы распределены восемь бусообразных утолщений диаметром 3.3-3.8 нм [31, 41], в ее середине располагается гибкая перемычка. Короткая хвостовая фибрилла заканчивается доменом длиной около 4 нм. Этот домен, соответствующий N-концу gp12, отвечает за прикрепление фибриллы к базальной пластинке и расположен глубоко в теле фага [31].
Основной фрагмент полипептидной цепи gp12 (остатки 48…320) состоит из шести тандемных повторов, в каждом из которых около 40 а.о. и еще двух более коротких, но подобных одиночных повторов [31]. С помощью компьютерных методов была предсказана вторичная структура этих повторов, представляющая собой набор чередующихся Р-тяжей и Р-изгибов. Повторы gp12 имеют довольно высокую степень гомологии с аналогичными повторами длинных хвостовых фибрилл. Предполагается, что переход базальной пластинки из гексагонального состояния в звездообразное [20] сопровождается конформационным изменением gp12 [31]. Такой переход обусловлен наличием гибкой области и согласуется с существованием двух изоформ gp12 с р! 7.0 и 7.2 [44].
Бактериофаг phiKZ – это вирус, который инфицирует бактерию Pseudomonas aeruginosa, являющуюся патогенной для человека. Его геном имеет размер 280334 пар оснований и является линейной, переставляемой по кругу и избыточной на концах А+Т-богатой двухнитевой молекулой ДНК [45]. ДНК бактериофага phiKZ не имеет заметной гомологии в последовательности с другими вирусами и микроорганизмами и не содержит сайты рестрикцирующих эндонуклеаз NotI, PstI, SacI, SmaI, XhoI и XmaIII. С помощью компьютерного анализа было установлено, что геном имеет 306 открытых рамок считывания, варьирующихся по размеру от 50 до 2237 аминокислотных остатков [46]. Сравнение этих выделенных аминокислотных последовательностей с другими аминокислотными последовательностями из баз данных для различных белков показало, что только 59 белков бактериофага phiKZ имеют четкую гомологию с белками, у которых функции известны. Кроме того, в белках бактериофага phiKZ были обнаружены 56 консервативных доменов. Подобные выводы были сделаны и при изучении бактериофага Т4, а именно: только 50 белков из 300 имеют заметную гомологию по аминокислотной последовательности с известными последовательностями других белков. Низкая гомология с другими бактериофагами как на уровне ДНК, так и на уровне белков ясно показывает, что бактериофаг phiKZ представляет собой ветвь, эволюционно отличную от ранее известных представителей семейства Myoviridae.
Частица бактериофага phiKZ имеет сократимый хвост длиной 2000 и большой икосаэдрический капсид диаметром 1450 , содержащий двухнитевую ДНК (рисунок 1.5). Внутри капсида была обнаружена плотная спиральная структура, и было установлено, что суперспиральная геномная ДНК закручена вокруг этого “внутреннего тела” [47].
Материалы, использованные в эксперименте по исследованию бактериородопсина и его делеционных мутантов (штаммы, ферменты, реактивы)
Затем была проведена трансформация компетентных клеток штамма Тор 10 Е. coli лигазной смесью. К 100 ці компетентных клеток добавляли 10 \А лигазной смеси и инкубировали в течение 30 мин во льду. Потом для клеток создавали тепловой шок при 42С в течение 45 с, после чего реакционную смесь охлаждали во льду 2 мин, добавляли 700 \А питательной среды SOC без ампициллина, инкубировали в течение 45 мин при 37С, центрифугировали 3 мин на частоте п=3000 об/мин (Eppendorf centrifuge 5417 R, США). После центрифугирования большую часть супернатанта сливали, а в оставшемся количестве, примерно, 100 \х\ ресуспензировали осадок клеток, которые высевали на чашки Петри с LB агаром с добавлением 200 jig/ml ампициллина. Смесь втирали стерильным шпателем в агаровый слой и инкубировали в течение ночи при 37С.
После того, как на чашках выросли колонии клеток, была проведена селекция клонов клеток Тор 10, содержащих рекомбинантные плазмиды. Как правило, трансформация компетентных клеток Тор 10 Е. coli лигазной смесью давала 15-40 колоний клеток, получивших устойчивость к антибиотику. Выросшие колонии пересевали в стерильные пробирки, содержащие по 3 ml среды с ампициллином 150 ug/ml, и выращивали в течение ночи при 37оС с интенсивной аэрацией. После этого клетки центрифугировали в течение 10 мин при п=4000 об/мин (Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16 R centrifuge, Германия). Плазмидную ДНК выделяли и очищали с помощью набора реагентов NucleoSpin и QIAprep по стандартной методике [171]. Выделенную плазмидную ДНК обрабатывали соответствующими рестриктазами (bOWTAS I, Sphl; ЬО10/SphI; ЪО13/SphI; fr.1233 /Xmal, Hindlll) и анализировали длину фрагментов с помощью электрофореза в 2% агарозном геле.
В общей сложности для 4-х фрагментов было проанализировано, примерно, 130 клонов. Для каждого из фрагментов были найдены клоны, содержащие плазмиду со вставкой нужного размера: bOWTcl.19; Ю10_с1.32, 33, 34; ЬО13сІ.13; fr.1233_cl.20, 34. Эти плазмидные ДНК были секвенированы для подтверждения их нуклеотидных последовательностей. Была выявлена на 100% гомология с теоретической последовательностью для клонов bOWTcl.19; Ю10_с1.32, ЬО13сІ.13. Для клонов 20 и 34 fr.1233 гомология с теоретической последовательностью составляла 99%.
Плазмида pUCBM20, содержащая вставку, была выделена из 50 ml жидкой культуральной среды (с ампициллином 150 ug/ml) с использованием набора реактивов QIAgen Plasmid Midi Kit. Затем была проведена рестрикция плазмиды pUCBM20 по сайтам рестрикции с учетом вставки: bOWI/Aatll-Xmal, ЪОА\0/Есо47Ш-Хта1, ЪОА\3/Есо47Ш-Хта1, й.ПЗЗ/Хтаї-НіпсйІІ.
Рестрикция синтезированных фрагментов NA и NE осуществлялась по сайтам Ncol-Aatll и Ncol-Eco47lll соответственно при выделении их из плазмиды pUC57.
Для постановки окончательного лигирования с тремя вставками использовали вектор v.1233, предварительно выделенный из 50 ml жидкой культуральной среды с помощью набора реактивов QIAgen Plasmid Midi Kit, линеаризованный по сайтам Ncol-Hmdlll и дефосфорилированный с помощью щелочной фосфатазы SAP (Fermentas GmbH, Германия) для избежания его “залипания” самого на себя.
Создание окончательных конструкций для экспрессии начинали с лигирования двойных фрагментов по липким концам NA-bOWT/Aatll-Xmal и по тупым концам Ш-ЪОА\0/Есо47Ш-Хта1, Ш-ЪОА\3/Есо47111-Хта1. При лигировании двух фрагментов друг с другом необходимо, чтобы молярное соотношение между фрагментами было 1:1. Но при этом более длинного фрагмента необходимо брать во столько же раз больше по массе, во сколько раз он длиннее другого. Отбор вставок нужного размера проводили с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Так как в нуклеотидной последовательности фрагмента fr.1233, клонированного в плазмиду pUCBM20, содержалась ошибка, было принято решение не продолжать анализировать клоны, а сделать лигирование фрагмента fr.1233, полученного с помощью ПЦР, напрямую в вектор v.1233. Для этого ПЦР-фрагмент fr.1233 был порезан по сайтам рестрикции Xmal-Hindlll, введенным в него с помощью соответствующих праймеров. Затем были проведены реакции лигирования и трансформации, а также отбор клонов. При проведении лигирования по липким концам необходимо использовать трехкратный избыток клонируемого фрагмента, чему соответствует молярное соотношение вектор:вставка=1:3. Было выявлено 6 искомых клонов, проверенных секвенированием и содержащих в себе плазмидную ДНК v.1233 со вставкой fr. 1233.
Окончательным этапом в создании экспрессионных плазмид было лигирование двойных вставок NA-bOWT, NE-bOA10, NE-bOA13 и вектора v.1233, уже имеющего fr.1233.
Электропорация. Отбор клонов. После реакции лигирования была проведена электропорация компетентных клеток штамма Тор 10 Е. coli с помощью ячеек Bio-Rad {Bio-Rad Laboratories GmbH, Германия). Этот метод более чувствительный, чем обычная трансформация, и позволяет получить большее число колоний. Для каждого из трех видов рекомбинантной плазмиды была произведена селекция клонов с помощью рестрикции и электрофореза в 1% агарозном геле. Выделенные плазмидные ДНК были отсеквенированы для подтверждения их нуклеотидных последовательностей.
Оказалось, что из трех запланированных конструкций (plbOWT, рІЬО10, рІЬО13) одна плазмида plbOWT содержала нужную вставку -ген bOWT. Для двух других конструкций (рІЬО10 и рІЬО13) после электропорации было проанализировано путем секвенирования порядка 300 клонов, но ни в одном из них не было обнаружено нужных вставок.
Результаты предсказания вторичной структуры мембранных белков вычислительными методами по их аминокислотным последовательностям
Прежде чем приступить к исследованию gp181 с помощью делеционного мутагенеза, мы проанализировали его аминокислотную последовательность с помощью программы BLAST [181] с целью выявить консервативные домены в структуре этого белка. Используя эту программу, нам удалось предсказать, что в С-концевой части белка gp181 (аминокислотные остатки 672-2242) находится домен пептидогликановой гидролазы или лизоцимный домен.
С учетом этих данных, а также данных об одинаковой периодичности в С-концевых частях gp181 и gp5 (т.е. с учетом имеющейся аналогии этих белков), были получены три делеционных мутанта гена 181, а именно: ген g181MA (582 п.н.), кодирующий лизоцимный домен, ген g181E (603 п.н.), кодирующий С-концевую часть белка gp181, расположенную после лизоцимного домена и ген g181M, являющийся объединением генов g181MA и g181E (рисунок 3.12).
Были созданы три плазмидные конструкции с использованием вектора pQE-30 E. coli (рисунок 3.13), содержащие гены g181M, g181MA и g181E бактериофага phiKZ, соответственно, pl_g181M, pl_g181MA и pl_g181E.
Вектор и вставка были линеаризованы с помощью рестрикции по сайтам ВатЖ и Hindm, соответственно (п. 2.3.1, глава 2). Затем была проведена реакция лигирования.
После лигирования полученными плазмидными конструкциями трансформировали компетентные клетки Тор10 и отбирали клоны, содержащие вставку. Клонами со вставкой gl81M, gl81MA и gl81E был трансформирован экспрессионный штамм AD494(DE3) Е. сoli, содержащий ген РНК- полимеразы Т5.
После экспрессии был проведен анализ рекомбинантных белков на растворимость, который показал, что при температуре 37С белок gpl81M экспрессируется полностью в нерастворимой форме, белок gpl81E частично находится в супернатанте, а белок gpl81MA полностью растворим. При проведении экспрессии при пониженной температуре 18С белок gpl81M также экспрессировался в нерастворимой форме, однако доля белка gpl81E, экспрессировавшегося в растворимой форме, существенно повысилась.
На рисунке 3.15 представлены картины электрофореза белков из экстракта клеток в 12% SDS-ПААГ, из которых видно, что gpl81M находится во фракции осадка, а gp 18IE во фракции супернатанта.
Известно, что белки, которые экспрессируются в виде телец включения, можно перевести в растворимую форму с помощью рефолдинга. Поэтому был проведен рефолдинг белка gpl81M, растворимой форме. Белок gp181M диализовали в буфере, содержащем 20 mM Tris HCl pH 7.5, 200 mM NaCl, 0.5% Tween 80, 0.1% сахарозу. После диализа, проведенного в течение ночи против использованного буфера, продукт рефолдинга
Белки gp181MA и gp181E диализовали для того, чтобы избавиться от избытка имидазола в буфере. Так как диализ белков gp181MA и gp181E прошел успешно, было проведено их концентрирование с помощью концентратора Centricon10 (Amicon, США). Для этого белковые растворы были центрифугированы на 3000 об/мин в течение 15 минут 4 раза. При этом белки сконцентрировались в 2.5 раза. На рисунке 3.16 представлена картина электрофореза белков в 12% SDS-ПААГ до концентрации и после концентрации. Белки gp181E и gp181MA имеют расчетный молекулярный вес 21.3 кДа и 21.4 кДа, соответственно. Но из рисунка видно, что их подвижность в SDS-ПААГ соответствует молекулярному весу порядка 30 кДа. Это можно объяснить устойчивостью этих белков к SDS и тем, что они не являются мономерами.
Белок gpl81E находится во фракции осадка при взаимодействии со штаммом РАО Pseudomonas aeruginosa. В качестве контроля использовали бактерию Е. сoli. При добавлении gpl81E к Е. сoli взаимодействия не наблюдается - на рисунке 3.17 видно, что белок gpl81E полностью во фракции супернатанта.
Перед началом экспериментальных исследований белка gp181E предполагалось, что его С-концевая часть (gp181E) может играть роль сенсорной молекулярной иглы. Это предположение согласуется с наблюдавшимся взаимодействием gp181E с клетками Pseudomonas aeruginosa.
Похожие диссертации на Характеристики структуры и свойства белков систем инфицирования бактериофагов Т4 и phiKZ и некоторых мембранных белков
