Введение к работе
Актуальность проблемы. Амилоидные агрегаты - основной признак амилоидозов, конформационных болезней человека и животных, наступающих в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белка. Амилоидные агрегаты можно разделить на два класса: амилоидные фибриллы, представляющие собой высокоупорядоченные структуры и аморфные агрегаты, не имеющие упорядоченной структуры. Известно, что амилоидные агрегаты имеют ряд специфических тинкториальных и физико-химических характеристик (способность связываться с красителями Конго красным и тиофлавином Т, богатая р-складчатостью вторичная структура, двойное лучепреломление в поляризованном свете, нерастворимость в большинстве растворителей и устойчивость к протеазам) (Dobson, 2004; Ross & Poirier, 2004; Uversky & Fink, 2004). Накопление белка в виде амилоидных агрегатов связано более чем с 25 разными тяжелыми и неизлечимыми заболеваниями человека. Эти заболевания включают амилоидоз, связанный с гемодиализом, диабет II типа, болезни Паркинсона, Хантингтона, Альцгеймера и др. (Dobson, 2004; Uversky & Fink, 2004; Wang & Good, 2005; Gruden et al., 2004; Wilhelm et al., 2007).
Интерес к проблеме амилоидозов мозга объясняется тем, что сейчас эти болезни - главная причина смерти после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, а по данным ВОЗ неврологические и психические заболевания в ближайшие 10-15 лет по числу больных могут выйти на первое место.
Изучение амилоидозов приобрело особую актуальность в связи с распространением прионных болезней (прионных амилоидозов) таких, как смертельные трансмиссивные энцефалопатии и среди них болезнь Куру, болезнь Крейтцфельда-Якоба, фатальная семейная бессонница у людей, а также энцефалопатии у крупного рогатого скота (бешенство коров, имеющее эпидемический характер), скрепи у овец, коз и прион-зависимые энцефалопатии у других животных и птиц.
Амилоидные отложения найдены при кардиомиопатиях, миокардитах и миозитах в мышцах и кровеносных сосудах, однако их белковая природа до сих пор неизвестна. Установление белковой природы депозитов и их свойств, выяснение молекулярных механизмов амилоидозов, развитие терапевтических методов лечения и предупреждения этих заболеваний, а также разработка их прижизненной диагностики являются актуальными задачами. Одним из эффективных подходов к решению этих задач является изучение амилоидогенеза в системах in vitro: выяснение общих свойств амилоидов, образуемых разными белками, открытие факторов, регулирующих их образование и разрушение, эффектов на жизнедеятельность клеток и т.д.
Ранее в нашей лаборатории были открыты амилоидные свойства четырех белков скелетных и сердечной мышц. Показано, что белки семейства тайтина (тайтин, С-, Х-, Н-белки), составляющие около 15% от общего количества саркомерных белков, способны формировать амилоидные фибриллы в условиях, близких к физиологическим (Марсагишвили и др., 2005; Подлубная и
Марсагишвили, 2008). Легкость, с которой эти белки формируют амилоиды обусловлена наличием у них -90% р-складчатой структуры, необходимой для образования амилоидов. В связи с тем, что амилоидные отложения находят в кровеносных сосудах, нашей задачей было продолжить исследования, направленные на поиск новых амилоидных белков в мышцах и в частности, изучить амилоидные свойства гладкомышечного белка смитина (аналога тайтина скелетных и сердечной мышц). Поскольку смитин имеет молекулярную структуру, подобную тайтину скелетных и сердечной мышц (Kim & Keller, 2002), мы предположили, что смитин также может легко формировать амилоиды. Подтверждению этого предположения посвящена первая часть диссертационной работы.
Основная стратегия терапии амилоидозов — разрушение амилоидных фибрилл или предотвращение их образования, поэтому вторая часть диссертационной работы посвящена in vitro исследованию способности фуллерена С60 и его производных разрушать амилоиды Ар(1-42)-пептида мозга, участвующих в патогенезе болезни Альцгеймера, и амилоиды мышечного X-белка. Важность использования фуллерена С6о в этих исследованиях обусловлена наличием у него таких положительных свойств, как нейропротекция и сильные антиоксидантные свойства (Dugan et al., 1996; Chiang et al., 1995; McEwen et al., 1992). Для тестирования антиамилоидного эффекта фуллерена С6о и его производных был выбран мышечный Х-белок, благодаря его способности in vitro строить спирально скрученные амилоидные фибриллы, подобные фибриллам Ар-пептидов мозга, разрушение которых можно легко оценивать с помощью электронной микроскопии. С помощью этого метода была показана способность гидратированного фуллерена С6о разрушать амилоидные фибриллы Х-белка и АР(25-35)-пептида мозга (Подлубная и Марсагишвили, 2008). Однако низкая растворимость гидратированного фуллерена С6о затрудняла его использование как потенциального препарата для эффективной антиамилоидной терапии. Это стимулировало наши исследования антиамилоидного эффекта водорастворимых производных фуллерена Сбо на амилоидные фибриллы мышечного Х-белка в сравнении с их эффектом на амилоидные фибриллы Ар(1-42)-пептида мозга.
Цель работы.
Поиск новых амилоидных мышечных белков и тестирование подходов к разрушению амилоидов.
Задачи исследования.
-
Выяснить способность гладкомышечного белка смитина формировать амилоиды in vitro.
-
Изучить антиамилоидное действие фуллерена С60 и его водорастворимых производных на амилоидные фибриллы мышечного Х-белка и Ар(1-42)-пептида мозга.
-
Изучить влияние антиамилоидных веществ на филаментообразование актина.
-
Исследовать цитотоксичность фуллерена С6о и его водорастворимых производных.
-
Провести сравнительную оценку эффективности антиамилоидных веществ.
Научная новизна работы. Открыты амилоидные свойства гладкомышечного белка смитина - аналога тайтина скелетных и сердечной мышц. С помощью электронной микроскопии показано, что смитин способен in vitro формировать агрегаты в условиях, близких к физиологическим. Амилоидная природа агрегатов смитина подтверждена спектральными методами по связыванию их со специфическими красителями на амилоиды Конго красным и тиофлавином Т.
Проведена оценка антиамилоидных свойств восьми водорастворимых производных фуллерена Сбо и их цитотоксичности. Оценка антиамилоидных свойств производных фуллерена С60 была проведена на амилоидных фибриллах мышечного Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга, разрушение которых можно легко оценить с помощью визуальных методов.
Научная и практическая значимость работы. Полученные результаты свидетельствуют о способности натриевой соли поликарбоксилыюго производного фуллерена С6о, комплексов фуллерена Сбо с поливинилпирролидоном (м.м. поливинилпирролидона 10000 и 25000), фуллеренола, Сбо-ИОг-пролина, С6о-(М02)2-пролина, Сбо-МОг-пролин-ЫОг, а также гидратированного фуллерена С6о не только разрушать амилоидные фибриллы мышечного Х-белка и АР(1-42)-пептида мозга, но и предотвращать их образование.
На основании отобранных критериев (высокая антиамилоидная способность, отсутствие токсичности, низкие агрегационные свойства) сделано заключение о том, что фуллеренол и комплексы фуллерена Сбо с поливинилпирролидоном являются наиболее эффективными и нетоксичными антиамилоидными веществами, на основе которых могут быть созданы антиамилоидные препараты.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на многих российских и международных конференциях, в частности, на Международных конференциях "Биологическая подвижность" (Пущино, 2010); 38-ой Европейской мышечной конференции (Лилль, Франция, 2009); II Съезде физиологов СНГ (Кишинев, Молдова, 2008); 12-ой, 13-ой, 14-ой Международных Путинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2008, 2009, 2010); VII «Конференции молодых ученых, специалистов и студентов», посвященной дню космонавтики и приуроченной к 45-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН (Москва, 2008); Международном форуме по нанотехнологиям (Москва 2008); Всероссийской конференции с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология» (Пущино, 2009); Международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009, 2011); 1-ой Международной научной школе «Наноматериалы и нанотехнологии
в живых системах» (Красновидово, 2009); V, VI, VII Международных и Междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии», (Судак, Крым, Украина, 2009, 2010, 2011); Конференции по программе «Фундаментальные науки — медицине» (Москва, 2010); Докладах совещаниях «Нейродегенеративные заболевания: современные представления о патогенезе, диагностике и лечении» (Москва, 2010); III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии (Москва, 2010); XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); Школе-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности «Системные и клеточные механизмы в физиологии двигательной системы и мышечной деятельности» (Москва, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 29 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на НО страницах, иллюстрирована 3% рисунками и 5" таблицами. Список цитируемой литературы включает 807 источников.
