Введение к работе
Актуальность темы. Идентификация фрагментов полипептидной цепи
белка, присутствующих в исследуемом объекте в нескольких альтернативных
конформациях, является важным шагом в процессе определения атомной
структуры белка методом рентгеноструктурного анализа. В то же время, этот
этап принадлежит к числу наиболее трудоемких и наименее
автоматизированных этапов рентгеновского исследования и требует
существенных затрат времени высококвалифицированных исследователей.
Прогресс в техниках кристаллизации значительно увеличил количество
кристаллов, дающих экспериментальные данные атомного разрешения. Карты
распределения электронной плотности, полученные для таких кристаллов,
позволяют обнаруживать детали структуры, которые не видны при более
низком разрешении. Одной из таких деталей является одновременное
присутствие в исследуемом кристалле белка нескольких альтернативных
конформаций (АК) отдельных боковых цепей либо других фрагментов
полипептидной цепи. Присутствие АК отчасти нарушает кристаллический
порядок, но является распространенным явлением при работе с кристаллами
биологических макромолекул. На данный момент единственным способом
поиска АК является трудоемкий визуальный анализ карт распределения
электронной плотности в окрестности каждого остатка. В то же время,
включение в атомную модель АК увеличивает точность фаз структурных
факторов, рассчитанных с использованием такой модели, что приводит к
повышению качества рассчитанных карт распределения электронной плотности
во всем объеме элементарной ячейки и создает возможность определения
дополнительных деталей структуры, не связанных непосредственно с АК.
Кроме того, часто наличие АК связано с механизмом функционирования
молекулы. В связи с этим, разработка методов диагностики присутствия АК в
кристаллах белков является актуальной задачей.
Целью данной работы было создание формализованной компьютерной
методики поиска фрагментов молекулы исследуемого белка, для которых
наиболее вероятно наличие альтернативных конформаций. В качестве индикатора наличия АК было выбрано поведение координат атомов модели белка в процессе свободного кристаллографического уточнения. Результатом поиска является список аминокислотных остатков, с наибольшей вероятностью присутствующих в исследуемом кристалле в альтернативных конформациях. Были поставлены следующие задачи:
-
Анализ взаимосвязи стабильности фрагмента модели в процессе свободного уточнения и наличия в нем АК для серии структур, депонированных в Protein Data Bank (PDB).
-
Проведение тестового свободного уточнения для наиболее надежно определенных белковых структур, отобранных из банка белковых данных (PDB), и формирование баз данных по подвижности координат атомов.
-
Выявление характеристик фрагментов структуры, наиболее сильно влияющих на подвижность этих фрагментов.
-
Разработка процедур принятия решений о необходимости введения в модель альтернативных конформаций для конкретного остатка на основе анализа величин атомных сдвигов в свободном уточнении. Анализ эффективности разработанных процедур.
-
Сравнение эффективности процедур предсказания альтернативных конформаций на основе анализа сдвигов атомов и процедур, основанных на других характеристиках модели: температурных факторах; значениях электронной плотности в комбинированных синтезах Фурье электронной плотности.
-
Реализация разработанной методики обнаружения АК в виде компьютерных программ; публикация программ.
Научная новизна. Все результаты, полученные в ходе данного
исследования, являются новыми. Была изучена подвижность координат атомов
в ходе свободного кристаллографического уточнения, разработаны процедуры
идентификации остатков, с наибольшей вероятностью присутствующих в
альтернативных конформациях, разработанные методики реализованы в виде компьютерных программ.
Личный вклад. Представленные в диссертационной работе результаты получены лично соискателем.
Практическая значимость. Предложенные в работе методы анализа модели белковой структуры, базирующиеся на ее подвижности в свободном уточнении, дают исследователям новый инструмент как для выявления наиболее подвижных участков структуры, которые могут играть существенную роль в механизмах функционирования белка, так и для оценки надежности уже определенных структур. Разработанные методы идентификации аминокислотных остатков, которые с наибольшей вероятностью присутствуют в альтернативных конформациях, позволят снизить временные затраты на визуальное исследование карт распределения электронной плотности и, в ряде случаев, облегчить интерпретацию сложных фрагментов карт. Компьютерные программы, реализующие разработанные методики, доступны по адресу .
Апробация работы. Основные результаты, изложенные в диссертации, были представлены автором в виде устных докладов на 27-й Европейской кристаллографической конференции (Берген, Норвегия, 2012), XXII Конгрессе и генеральной ассамблее международного союза кристаллографов (Мадрид, Испания, 2011), IV Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), II и IV Международных конференциях «Математическая биология и биоинформатика» (Пущино, 2008, 2012), 12,15,16,17 Международных школах- конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008, 2011, 2012, 2013), Международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика'12» (Пущино, 2012), а также в виде стендового доклада на 40-й Международной кристаллографической школе (Эриче, Италия, 2008).
Исследования выполнены при поддержке РФФИ:
Грант РФФИ 10-04-00254-а «Исследование частично разупорядоченных больших макромолекулярных комплексов методами рентгеновской дифракции» в 2010 -2012 гг.
Грант РФФИ 12-04-31096-мол_а «Разработка объективных методов идентификации альтернативных конформаций аминокислотных остатков в кристаллах белков в процессе рентгеноструктурного исследования» в 20122013 гг.
Грант РФФИ 12-04-09433-моб_з, «Научный проект "Анализ величин атомных сдвигов в процессе свободного уточнения позволяет выявлять альтернативные конформации боковых цепей" для представления на научном мероприятии "27-я Европейская кристаллографическая конференция"» в 2012 г.
Грант РФФИ 11-04-09516-моб_з, «Участие в XXII Congress and General Assembly of the International Union of Crystallography» в 2011 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ: 5 статей в рецензируемых научных журналах, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 11 тезисов докладов.
