Введение к работе
Актуальность работы
Болезнь Альцгеймера - самый распространенный вид нейродегенеративного заболевания в мире. С физиологической точки зрения заболевание характеризуется накоплением внеклеточных амилоидных бляшек и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков в нервных тканях мозга. Важнейшую роль в развитии болезни играет белок-предшественник бета-амилоида (ПБА). Протеолиз этого белка в организме человека различными ферментативными системами ведет к образованию бета-амилоида - главного на сегодняшний день маркера болезни Альцгеймера. ПБА является мембранным белком длиной 695-770 а.о., поэтому современные попытки его структурных исследований испытывают ряд объективных трудностей. ПБА и его производные димеризуются в мембране клеток и эндосом. Более половины мутаций, являющихся основным фактором риска раннего развития заболевания, приходится на трансмембранный (ТМ) домен белка. На данный момент нет четкого понимания механизма влияния патогенных мутаций на прогрессирование болезни. Однако существует мнение, что на протеолиз белка могут влиять как мутации, так и липидный состав мембраны.
Для адекватной терапии болезни Альцгеймера необходимо понимание молекулярных основ развития заболевания. Наличие одной лишь структуры целевого белка часто не достаточно для эффективного поиска новых лекарственных препаратов. Именно поэтому глубокое изучение динамики, условий и механизма ферментативного процессинга белка-предшественника бета-амилоида представляется перспективной задачей для современной фундаментальной науки и медицины.
Цели и задачи исследования
Целью данной диссертационной работы являлось изучение структуры, динамических свойств и белок-белковых взаимодействий в составе димерных комплексов ТМ домена белка-предшественника бета-амилоида в мембране и/или имитирующей мембранное окружение среде. Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
1) разработка системы эффективной экспрессии синтетического гена ТМ до
мена белка-предшественника бета-амилоида в клетках Е. coli, в том числе на
1С 1 Q
средах, содержащих изотопы N и С;
2) разработка эффективного протокола очистки пептида;
-
изучение пространственной структуры и динамических характеристик пептида в мембранном окружении методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения;
-
определение мотивов димеризации, структуры димера и энергетических параметров процесса димеризации пептида.
Научная новизна и практическая значимость работы
Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые:
-
разработана эффективная система экспрессии в клетках Е. coli ТМ домена белка-предшественника бета-амилоида;
-
разработана система очистки рекомбинантного ТМ домена белка-предшественника бета-амилоида;
-
определена пространственная структура ТМ домена белка предшественника бета-амилоида методами ЯМР-спектроскопии высокого разрешения, солю-билизированного в растворе мицелл из детергента додецилфосфохолина (ДФХ);
-
определена топология гомодимеризации пептида, а также описаны кинетические и энергетические параметры реакции димеризации.
Полученные данные о структуре и природе димеризации ТМ домена ПБА закладывают базис для адекватного описания молекулярных механизмов развития болезни Альц-геймера. Эти данные позволят не только расширить фундаментальные знания о влиянии старения или патогенных мутаций на процессы метаболизма в нейронах мозга, но и могут помочь выявить рациональный подход к эффективной терапии заболевания.
Апробация работы
Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях: EUROMAR-2009 (Ґетеборг, Швеция, 2009); Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009); 36th FEBS CONGRESS (Турин, Италия, 2011), EUROMAR2011 Magnetic Resonance Conference (Франкфурт-на-Майне, Германия, 2011); Biophysical Society 56і Annual Meeting (Сан Диего, Калифорния, США, 2012); Российско-Германский симпозиум "Molecular Neurobiology Today and Tomorrow" (Москва, 2012).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 работы в реферируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение») и выводов. Работа проиллюстрирована 40 рисунками, содержит 2 таблицы. Библиографический указатель содержит 110 источников.
