Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы Структурные и динамические факторы, контролирующие реакции переноса электрона в белках 10
Анализ реакций переноса электрона в структуре белков в рамках неадиабатического проиближения 16
Анализ реакций переноса электрона в белках в рамках адиабатического приближения 23
Особенности реакций переноса электронов в структуре РЦ из фотосинтезирующих бактерий 28
ГЛАВА 2. Материалы и методы 35
ГЛАВА 3. Анализ микросекундной релаксационной динамики белков ивязких сред методом регистрации релаксационных сдвигов спектров фосфоресценции с использованием распределения Кола-Давидсона 38
Исследование молекулярной динамики в изобутиловом спирте 41
Исследование релаксационной динамики в белках 51
ГЛАВА 4. Анализ кинетики переноса электрона в структуре реакционных центров фотосинтезирующих бактерий с использованием эмпирических моделей 60
Анализ начальных участков кинетических кривых переноса электрона в рамках приближения Рипса-Джортнера. 61
Эмпирическая двухмодовая модель 70
Комбинированная двухмодовая модель 74
Анализ быстрой фазы кинетики ПЭ. 77
Анализ медленной фазы кинетики ПЭ. 79
ГЛАВА 5. Анализ кинетики переноса электрона в структуре нативных и мутантно модифицированных реакционных центров в рамках микроскопической двухмодовой модели 84
Описание модели 84
Выбор параметров. 91
Анализ статических параметров 93
Анализ температурных зависимостей 97
Анализ заселенности медленной популяции РЦ 99
Заключение 104
Выводы 111
Список литературы
- Анализ реакций переноса электрона в белках в рамках адиабатического приближения
- Исследование молекулярной динамики в изобутиловом спирте
- Эмпирическая двухмодовая модель
- Анализ температурных зависимостей
Анализ реакций переноса электрона в белках в рамках адиабатического приближения
Уже в средине прошедшего века сформировалось устойчивое мнение, что ключевым моментом многих биохимических процессов, происходящих в живых организмах и растениях, являются реакции переноса электрона. Характеристические времена этих процессов лежат в широком диапазоне времен, от фемтосекунд до секунд. В результате многочисленных исследований, начиная с 60-х годов прошлого века, было обнаружено, что эффективное протекание таких реакций в живых организмах обеспечивается за счет строго упорядоченного и направленного переноса электронов между металлосодержащими или органическими центрами в биологических макромолекулах.
В ранних работах, осознавая высокую эффективность переноса электронов в белках, высказывались различные гипотезы о причинах эффективности такого переноса. В частности, предполагалось, что белки, в силу их полипептидной структуры, наличия в них -спиралей с высокой упорядоченностью, подобно некоторым органическим кристаллам или полупроводниковым структурам, могут обладать зонной проводимостью, различной по различным направлениям [1],[2].
Второй особенностью белковых структур являются их динамические свойства. Динамика, внутренняя подвижность белковой глобулы важна для ферментативного действия белков. Фермент должен изменять свою структуру в процессе каталитического акта, подстраиваясь под геометрию реагентов. Это неотъемлемое свойство ферментов, принципиальное для их функционирования. Основное продвижение в экспериментальных исследованиях реакций переноса электрона в белках было осуществлено в 70 – 90 годы, это было обусловлено несколькими причинами.
Во-первых, методом рентгеноструктурного анализа была установлена точная пространственная структура значительного количества белков, в том числе белкового комплекса РЦ фотосинтезирующих бактерий. Это позволило осознанно сопоставлять получаемые экспериментальные данные по кинетике переноса электрона с конкретной структурой белковой глобулы, в которой осуществляется перенос.
Во-вторых, были разработаны экспериментальные методики, с помощью которых исследовался перенос электрона между хромофором, ковалентно присоединенным к той или иной группе белка, и металлосодержащим центром белка, в качестве которого чаще всего выступал гем (в структуре гемоглобина, миоглобина, цитохрома с, РЦ) или другой металлосодержащий центр, например, атом меди в активном центре азурина. При этом возможно исследование как мгновенно запускаемой реакции прямого переноса электрона с возбужденного хромофора (чаще всего в триплетном состоянии), так и обратной реакции рекомбинации электрона с металлосодержащего центра на окисленный краситель. Такой подход позволил селективно менять положение донорного или акцепторного центра в структуре белка, тем самым изменяя расстояние переноса, его траекторию в белковой глобуле, а замена возбуждаемого хромофора или модификация металлосодержащего центра в белке давала возможность менять в значительных пределах энергетику реакции. Это позволило значительно расширить диапазон исследуемых реакций [3–24].
В третьих, были разработаны и эффективно применялись различные физические методы (оптическая спектроскопия, ИК- и раман-спектроскопия, различные варианты метода ЭПР, спиновых, флуоресцентных и фосфоресцентных меток, метод ЯГР), позволившие измерять молекулярную динамику полипептидной цепи, атомов железа в структуре гема или поверхностных слоев водного окружения белков в интервале времен от 10-11 до 101 с в широком диапазоне температур [25–41]. В частности, с помощью данных методов было показано, что молекулярная динамика белковой глобулы при низких температурах во многих аспектах схожа с динамикой стеклующихся матриц [27–29,31,41,42].
И, наконец, в четвертых, были сформулированы основные принципы и теоретические модели, в рамках которых можно было провести анализ полученных экспериментальных данных.
В результате проведенных многочисленных исследований было установлено, что в биологических системах перенос электронов в большинстве случаев осуществляется с помощью белков. Электроны локализуются на определенных центрах в белках, чаще всего металлосодержащих. Эти центры в большинстве случаев локализованы вблизи поверхности белка, но не контактируют непосредственно с водным окружением.
Подробное исследование механизмов действия крупных белков или белок-мембранных комплексов показало, что в таких комплексах при протекании самых различных окислительно-восстановительных реакций электроны локализуются на отдельных металлосодержащих центрах, расположенных на расстояниях 5-20 друг от друга. Перескакивая последовательно с центра на центр, электроны могут перемещаться в результате на расстояния в десятки и сотни ангстрем без диффузионной подвижности самих белков.
Исследование молекулярной динамики в изобутиловом спирте
Актуальной проблемой современных фундаментальных и прикладных исследований является создание функциональных систем запасания или преобразования энергии на основе фотопереноса и стабилизации заряда. Ключевую роль при создании таких молекулярных или наноструктур приобретает анализ процессов диэлектрической релаксации, обеспечивающей стабилизацию разделенных зарядов.
Для этих целей может быть использован метод регистрации релаксационных сдвигов спектров люминесценции. Чувствительность спектральных характеристик возбужденной молекулы к динамическому состоянию матрицы хорошо известна, начиная с работ Бахшиева [95], Вери [96], Мазуренко [97], Павловича [98]. При исследовании реакции переноса заряда с участием возбужденного фотохрома этот подход, анализирующий перестройку диполей матрицы в непосредственном окружении возбужденной молекулы, может более адекватно отражать взаимосвязь «динамика – функция» по сравнению с интегральными характеристиками, полученными методом измерения диэлектрической релаксации. Особенно важно это при исследовании процессов переноса электрона в структуре высокоорганизованных молекулярных систем, таких как природные белки, где мозаика локальных зарядов является чрезвычайно гетерогенной, а их подвижность определяется иерархией структур биологической макромолекулы, и может варьироваться в широких пределах [28], [41], [99].
В тоже время ключевым вопросом в данном подходе остается четкое количественное определение параметров, характеризующих скорость релаксационных процессов, и их соотношение с параметрами, измеряемыми методом диэлектрической релаксации.
В мировой литературе большое число публикаций посвящено исследованию релаксационных процессов с помощью анализа спектров флуоресценции, позволяющей получать информацию о релаксационных процессах в пико- и наносекундном диапазоне времен. Развиты достаточно точные подходы количественного описания параметров флуоресцентных сдвигов красителей в простых растворителях [100–102].
Значительно реже для анализа диэлектрической релаксации используется регистрация релаксационных сдвигов спектров фосфоресценции, хотя для анализа процессов разделения зарядов в вязких средах и при низких температурах, когда характерные времена процессов лежат в диапазоне от микросекунд до секунд, она может представлять особый интерес [103–106].
Соответственно, комбинированное использование метода флуоресценции и фосфоресценции позволяет получить информацию о релаксационных процессах в растворителях или организованных молекулярных системах в диапазоне от долей наносекунд до секунд.
В развитие этих подходов возникает необходимость выработки достаточно простых и доступных методов определения характеристических времен релаксации и энергии активации релаксационных процессов в различных системах.
Особый интерес представляет изучение релаксационных процессов в таких сложных системах, как растворы белков в водных или глицериновых средах, например, при изучении реакций переноса электрона в биологических системах в широком диапазоне температур [103], [104], [107], [108]. Белки, в силу своей высокой структурной организации, обладают уникальной мозаикой локальных зарядов, множеством водородных связей, обширным набором колебательных, вращательных и диффузионных степеней свободы, что в совокупности позволяет предполагать чрезвычайно широкий спектр релаксационных процессов, в том числе при низких температурах. 40
Исследование релаксационных процессов методом кинетической фосфоресцентной спектроскопии триплетных зондов позволяет изучать релаксационную динамику в микросекундном и миллисекундном диапазоне времен непосредственно в окружении хромофора, в активном центре белка или в определенном участке биологической мембраны, что недоступно обычным интегральным методам анализа диэлектрической релаксации.
Ранее в публикациях [105], [106], [109–111], были проанализированы два подхода к анализу молекулярной динамики вязких сред и биологических макромолекул:
1 – параллельное исследование сдвигов стационарных спектров фосфоресценции и флуоресценции одного и того же красителя (эозина) в одноэкспоненциальном (дебаевском) приближении. Такой простейший подход с одновременным использованием методов фосфоресценции и флуоресценции, с характеристическими временами в диапазоне наносекунд и миллисекунд, позволил получить значения энергии активации релаксационных процессов, близкие к значениям, полученным методом диэлектрических измерений. Однако в пределах одного метода (флуоресценции или фосфоресценции) получаемые значения характеристических времен релаксации близки к дебаевским только в области более высоких температур, и значительно отличаются от дебаевских при понижении температуры [105], [106].
2 – исследования релаксационных процессов методом регистрации мгновенных спектров фосфоресценции с учетом наличия распределения по временам релаксации матрицы (в рамках модели Коула-Давидсона). В рамках этого приближения удается с высокой точностью описывать кинетические кривые динамического стоксова сдвига (ДСС), однако сопоставления полученных характеристических времен релаксации с данными диэлектрических измерений произведено не было [109–111].
Эмпирическая двухмодовая модель
Принимая, согласно [89], что AG1 = -0.14 эВ, Н = 1.9 эВ и R = 12.3 , из соотношения (2) можно определить Я при заданных 5г. При выборе значений &i и 83 принималось, что энергия электростатического взаимодействия между гемами с-559 и с-552 ( %) равна 0.01 эВ, а энергия электростатического взаимодействия между гемами с-559 и с-556 ( % - S1) равна 0.06 эВ [123]. Из соотношения (12) получено, что наилучшее соответствие эксперименту наблюдается при Я = 0.26 эВ, когда &i = 0.02 эВ и % = 0.06 эВ.
Соответственно, в рамках неадиабатического приближения для реакций при комнатных температурах получается, что AG1 = -0.14 эВ, AG2 = -0.16 эВ, АС3= -0.22 эВ и Я = 0.26 эВ. Согласно формуле (1), энергии активации для соответствующих процессов тогда равны Е\ = 0.014 эВ, Е2а = 0.009 эВ и Е3а = 0.0014 эВ. Как видно из рис. 18, вычисленные таким образом энергии
Из формулы (13) и вышеупомянутых величин и Е а получаем Ег Д = 0.052 эВ. В качестве Ег можно принять значение 0.23 эВ, которое легко получить из температурной зависимости для среднего времени релаксации тср = г0Д используя значения г0 и Д полученных в работе [40] при анализе с помощью эффекта Мессбауэра диффузионных смещений атома Fe в геме миоглобина в рамках формализма Кола-Девидсона. В результате получается Д = 0.23, что находится в хорошем соответствии с величинами Д из исследований динамики миоглобина с помощью мессбауэровской спектроскопии в температурном диапазоне 232-245 K [40].
Подстановка определенных таким образом значений AG1, AG2 AG3, Я, Д совместно с другими величинами, в формулу (11) и дальнейший анализ экспериментальных данных из соотношений 1 , как это было сделано ранее в рамках неадиабатического приближения, дает хорошее согласие полученных величин. С помощью определенных таким образом величин из формулы (11) можно определить характеристическое время релаксационной перестройки белка, если задаться величинами аь=1.610–5 эВ из работы [116] и є0/єх = 2, что обычно принимается для внутренних гидрофобных участков белковых глобул. В этом приближении для реакционных центров из Rps. viridis при комнатной температуре получается значение ть = 0.17 мкс, что замечательным образом совпадает с измерением динамики белков в структуре РЦ методом мессбауэровской спектроскопии [89].
Проведенный анализ показывает, что применение приближения Рипса-Джортнера позволяет непротиворечиво описать экспериментальные данные по начальным участкам кинетических кривых переноса электрона в структуре реакционных центров фотосинтезирующих бактерий с учетом внутренней молекулярной динамики белковых комплексов и получить разумную оценку всех физических величин, входящих в данную модель.
Однако этот формализм справедлив только для начальных участков кинетических кривых и не позволяет описать кинетические кривые на всем их протяжении. Для полного описания экспериментальных данных в широком температурном диапазоне была предложена эмпирическая двухмодовая модель, основанная на приближении Суми-Маркуса.
Эмпирическая двухмодовая модель
Для описания температурных зависимостей эффективного параметра Q, отражающего скорость переноса электрона в структуре реакционных центров при различных степенях восстановления цитохрома с, приведенных в публикации [83] (рис. 7), была использована двухмодовая модель реакций переноса электрона, первоначально предложенная Овчинниковой [124] и далее развитая Суми и Маркусом [93].
В рамках этой модели в формулу (1) были введены модификации, основанные на предположении о возможности диссипации энергии при переносе электрона одновременно по двум степеням свободы: по колебательной и диффузионной [65]. Действительно, наряду с диффузионным движением в белках всегда существуют колебательные (недиффузионные) движения. Такие движения имеют очень короткие времена релаксации и не вымораживаются даже при очень низких температурах. На рис. 19 приведена поверхность свободной энергии для реакций такого типа. Если движение вдоль обеих координат, колебательной q и диффузионной Х1, является быстрым, реакция идет по оптимальной, наиболее быстрой неадиабатической траектории 1 от точки B 1 к точке C с минимальной энергией активации Еmin в точке S1, представляющей переходное состояние реакции. Однако, если движение вдоль диффузионной координаты Х1 замедляется при понижении температуры и реакция переноса электрона вдоль диффузионной координаты становится формально адиабатической, то эффективный перенос электрона продолжает осуществляться благодаря возможности протекания реакции преимущественно вдоль колебательной координаты через другое переходное состояние с большей энергией активации. Так как процесс релаксации вдоль колебательной координаты быстрый, и перенос электрона вдоль этой координаты всегда неадиабатический (для реакций переноса электрона в микросекундном диапазоне времен), то в этом случае реакция протекает в комбинированном адиабатическо-неадиабатическом режиме вдоль пути 2, который пересекает линию переходных состояний в точке S2.
Анализ температурных зависимостей
В рамках этой модели были проанализированы реакции переноса электрона в РЦ, как это описано в публикациях [55], [127], [54]. В этих работах последовательно проведен анализ кинетики переноса электрона между проксимальным гемом цитохрома с-559 и димером бактериохлорофилла Р в двух различных типах реакционных центрах, выделенных из бактерий Rps. viridis, Rps. sulfoviridis и в семи мутантно модифицированных реакционных центрах, изолированных из фотосинтезирующих бактерий Rps. viridis, в которых аминокислота тирозин L162 (Y), находящаяся на половине пути переноса между с-559 и Р (рис. 6), была замещена фенилаланином (F), триптофаном (W), глицином (G), метионином (M), лейцином (L), треонином (T) или гистидином (Н). Исследования проводились в температурном диапазоне 298 - 8 К для нативных и мутантных РЦ из Rps. viridis и в диапазоне 298 - 40 К для РЦ из Rps. sulfoviridis.
Из рентгеноструктурных данных известно, что вблизи траектории переноса электрона в структуре белка Rps. viridis находится несколько молекул воды, одна из которых, НОН38, расположена рядом с гемом с-559 (рис. 6) [43].
Очевидно, что даже небольшое изменение структуры аминокислотного остатка может повлиять на значение квадрата матричного элемента V b, изменить локальную полярность в этом районе белка и тем самым энергию реорганизации и вероятность внедрения молекулы воды НОН38 в структуру реакционного центра, что в значительно мере определяет скорость переноса электрона.
В качестве примера применения модели ОГСМ для анализа экспериментальных данных на рис. 22 приведено семейство экспериментальных кривых при разных температурах для мутантного производного РЦ L162Т и их моделирование в рамках предложенной модели. поглощение Р+ (отн.ед.)
Экспериментальные кинетические кривые мутанта L162Т (точки), полученные в высокотемпературной (а, Т = 295 (1), 288 (2), 278 (3), 268 (4), 256 (5) и 246 К (6)) и низкотемпературной (б, Т = 293 (1), 237 (2), 220 (3), 203 (4), 182 (5), 159 (6), 140 (7), 120 (8), 102 (9), 80 (10), 60 (11), 38 (12) и 10 К (13)) сериях измерений, и их теоретические аппроксимации (линии). Вставка -Т = 182 К (по данным работы [128]). Как видно из рисунка, удается достичь высокого соответствия теоретического анализа (сплошные линиии) экспериментальным данным (точки)
Выбор параметров. Модель содержит один динамический параметр г, который необходимо найти как функцию Т, и несколько не зависящих от Т статических параметров определяющих к(Х). Моды среды предполагаются классическими при T Tg, а при низких Т они становятся квантовыми; были выбраны coci = сох= 2Tg 250 см-1, что дало наилучший результат в низкотемпературной области. Остальные шесть статических параметров - Vab, AG0, coq, Xq , Xci и Ax- входят в (23) в виде четырёх комбинаций. Отсюда ясно, что модель не позволяет точно определить все статические параметры, поскольку вариация параметров при неизменных значениях упомянутых комбинаций не влияет на качество совпадения теоретических кривых с экспериментальными. Поэтому два параметра можно зафиксировать. Внутримолекулярная мода считается квантовой при всех температурах, и для неё было выбрано значение coq = 800 см-1. В качестве значений AG мы использовали AG1 = -0.14 эв, AG2 = -0.18 эв, AG3 = -0.29 эв, как было определено ранее.
Из оставшихся четырёх параметров два можно выбрать из условия совпадения начальных наклонов теоретических и экспериментальных кривых при комнатной и низкой температуре (в соответствии с формулами (25) и (26), и тогда остаются лишь два произвольно варьируемых параметра. Варьируя эти параметры и г, можно было найти минимум стандартного отклонения между экспериментальной и расчетной кривой и тем самым определить значение для данной температуры. Полученную функцию т(Т) , при T Tg представляли в виде т(Т) 1 = г"1 exp
Более подробное описание процедуры выбора параметров и определения т(Т) дано в [55]. По аналогии с изложенным при описании комбинированной двухмодовой модели с распределением по временам релаксации, первоначальная обработка экспериментальных данных включала определение относительной населённости As и константы скорости ks для медленной популяции по участку кривой на временах t 100 мкс (см. [55], [127], [54]); это показано сплошной линией на вставке к рис. 22-а. При моделировании полной кинетической кривой ( воспринималось, что вклад быстрой популяции пропорционален 1 -As, поэтому кинетическая кривая представлялась в виде
Таким образом, в процессе анализа с помощью данной модели ряд статических параметров coci = сох = 2Tg 250 см-1, coq = 800 см-1, AG1 = -0.14 эв, AG2 = -0.18 эв, АС3 = -0.29 эв были заданы на основе литературных данных одинаковыми и температурно независимыми для всех типов РЦ. Из моделирования кинетических кривых определены индивидуальные для каждого белка параметры Vab, q , hi и Дх, которые также не зависят от температуры и от степени восстановления цитохрома, а также зависящее от температуры среднее время релаксации белка т, которое характеризует его подвижность. В итоге были определены и проанализированы все основные факторы, определяющие кинетику переноса электрона в нативных и мутантных белках в диапазоне температур от комнатной до гелиевой. Анализ статических параметров
Статические параметры Vab, h , hi и he, характеризующие скорость реакции в данной конформации X, не зависят от температуры; найденные из компьютерного моделирования кинетических кривых значения этих параметров для всех белков приведены в табл. 1.
Из таблицы видно, что значение матричного элемента Уаь, важнейшего параметра, определяющего перекрывание волновых функций донора и акцептора и тем самым экспоненциальную зависимость вероятности переноса электрона от расстояния, меняется при замене аминокислот на пути переноса значительно, до 40 раз. Учитывая, что Уаъ входит в выражения (2) и (17) для константы скорости в квадрате, изменение только этого параметра может привести к изменению к(Х) более чем на три порядка.
Для матричного элемента переноса в фотосинтезирующей бактерии Chromatium приводятся значения Уаъ = 3 см-1 [133] (с оценкой расстояния переноса от края до края R=8–10 ) и 0.1-0.4 см-1 [134] (7?=12-13 ), сравнимые с данными табл. 1. Можно также сопоставить полученные значения Уаъ с эмпирической формулой Даттона и соавт. [137], которая предсказывает линейную зависимость log10 V b отр, доли пространства между донором и акцептором, занятого атомами
