Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Фотосинтез 10
2.2. Структура комплекса фотосистемы 2 14
2.3. Функционирование комплекса фс 2 28
2.4. Фотоактивация фс 2 46
2.5. Заключение 62
3. Материалы и методы 63
3.1. Препаративные методы 64
Выделение мембранных фрагментов, обогащенных ФС 2 64
Выделение ядерного комплекса ФС 2 с активным КВК 65
Выделение комплекса ФС 2, лишенного марганцевого кластера (апо-КВК-ФС 2) 66
Приготовление протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС 2 66
Фотоактивация КВК 67
3.2. Аналитические методы 69
Флуоресценция 69
Полярографичеcкий метод измерения кислорода 69
Прямой электрометрический метод регистрации 69
Редокс-титрование первичного хинонного акцептора QA 72
4. Результаты и их обсуждение 74
4.1. Характерные особенности ядерных комплексов фс 2 74
4.2. Ядерные комплексы фс 2 с поврежденным и реконструированным квк в растворе и в липосомах 77
4.3. Электрогенные реакции, обусловленные s-переходами квк, в протеолипосомах, содержащих фотоактивированные препараты апо-квк-фс 2 85
4.4. Электрогенные реакции, обусловленные переносом зарядов на хинон-акцепторном участке, в протеолипосомах, содержащих фотоактивированные препараты апо-квк-фс 2 99
5. Заключение 109
6. Выводы 111
7. Список литературы 113
- Структура комплекса фотосистемы 2
- Фотоактивация фс 2
- Приготовление протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС 2
- Электрогенные реакции, обусловленные s-переходами квк, в протеолипосомах, содержащих фотоактивированные препараты апо-квк-фс 2
Структура комплекса фотосистемы 2
Расстояния между атомом кальция и четырьмя атомами марганца составляют 3,5 (Ca-Mn1), 3,3 (Ca-Mn2), 3,4 (Ca-Mn3) и 3,8 (Ca-Mn4). Обнаружено, что, помимо пяти атомов кислорода, четыре молекулы воды (W1-W4) ассоциированы с марганцевым кластером, причем W1 и W2 лигандируют Mn4 на расстояниях 2,1 и 2,2 , соответственно, а W3 и W4 лигандируют кальций на расстоянии 2,4 . Идентифицированы все аминокислотные остатки, лигандирующие марганцевый кластер. D1-Glu189 служит монодентатным лигандом для Mn1. Оставшиеся пять остатков, содержащих карбоксильную группу, являются бидентатными лигандами: D1-Asp170 лигандирует Mn4 и Ca, D1-Glu333 лигандирует Mn3 и Mn4, D1-Asp342 лигандирует Mn1 и Mn2, D1-Ala344 – Mn2 и Ca, а CP43-Glu354 – Mn2 и Mn3. Кроме того, D1-His332 также является лигандом Mn1. Вместе с оксомостиками и молекулами воды, аминокислотные лиганды составляют координационное окружение кластера Mn4Ca: каждый атом марганца имеет шесть лигандов, а атом кальция – семь лигандов [Kawakami et al., 2011].
По данным сайт-направленного мутагенеза, главным компонентом высокоаффинного сайта связывания марганца является остаток D1-Asp170 [Boerner et al., 1992]. По-видимому, он участвует в связывании и окислении свободного иона марганца при фотоактивации [Nixon et al., 1992]. Некоторые аминокислотные замены (D1-Asp(170)Glu) в этом месте, несомненно, снижают стабильность интермедиатов фотоактивации [Hwang et al., 2007]. Вероятно, причиной является нарушение связывания кальция.
D1-Asp61, D1-His337 и CP43-Arg357 находятся во второй координационной сфере марганцевого кластера и могут играть важные роли в поддержании структуры марганцевого кластера. Один из -атомов азота CP43-Arg357 связан водородной связью с O2 и O4 марганцевого кластера, а другой связан водородной связью с карбоксильными атомами кислорода D1-Asp170 и D1-Ala344. Имидазольный -атом азота D1-His337 связан водородной связью с O3. Таким образом, CP43-Arg357 и D1-His337 могут участвовать в поддержании структуры кубана, а также компенсировать отрицательные заряды оксомостиков и аминокислотных остатков, содержащих карбоксильные группы. Карбоксильный атом кислорода D1-Asp61 связан водородной связью с W1, а также с O4 через другую молекулу воды, поэтому этот остаток также может участвовать в стабилизации марганцевого кластера. Кроме того, D1-Asp61 расположен на выходе из гипотетического протонного канала, включающего хлорид-ион, что позволяет предположить его участие в отщеплении протона от марганцевого кластера.
Наиболее важной структурной особенностью марганцевого кластера является его форма в виде «искаженного стула». Искажение вызвано наличием атома кальция и O5. Более длинные расстояния между O5 и атомами металлов подразумевают, что соответствующие связи слабы и O5 может иметь более слабый отрицательный заряд, чем -2. Возможно, O5 в состоянии S1 существует в виде гидроксид-иона и является субстратом образования молекулы кислорода. Другим субстратом может быть W2 или W3, потому что обе эти молекулы находятся на расстоянии водородной связи от O5.
Так как переход между S0 и S1 является самым быстрым в цикле Кока (см. [Dau & Haumann, 2007]), протон, отщепляемый при этом переходе, может быть акцептирован D1yr161 (YZ), который перед этим депротонируется путем сопряженного переноса электрона и протона. По сравнению с O5, W3 ближе к тирозину YZ и может быть более предпочтительным кандидатом на отщепление протона. Поэтому не исключено, что W3 существует в виде гидроксид-иона в состоянии S1, и связь O-O образуется между W2 и W3.
Обнаружено два сайта связывания хлорид-ионов поблизости от марганцевого кластера. Каждый хлорид-ион окружен четырьмя группами, по две из которых – молекулы воды. В случае иона Cl1 оставшиеся две группы – это аминогруппа D2-Lys317 и остовный атом азота D1-Glu333, а в случае иона Cl2 – остовные атомы азота D1-Asn338 и CP43-Glu354. Так как боковые цепи D1-Glu333 и CP43-Glu354 непосредственно лигандируют марганцевый кластер, хлорид-ионы могут быть необходимы для поддержания координационного окружения марганцевого кластера.
Помимо этого, хлорид-ионы лежат в начале цепочек водородных связей, ведущих от марганцевого кластера в люменальную фазу. Цепочка с участием Cl1 находится на поверхности между субъединицами D1, D2 и PsbO, а цепочка с участием Cl2 находится на поверхности между субъединицами D1, CP43 и PsbU. Эти цепочки водородных связей включают молекулы воды, заряженные и гидрофильные аминокислоты, и они могут выступать в качестве путей выброса протонов или поглощения молекул воды.
Система водородных связей вокруг YZ YZ расположен между марганцевым кластером и первичным донором электрона РЦ ФС 2. Существует обширная система водородных связей между YZ и марганцевым кластером и от YZ до люменальной поверхности [Umena et al., 2011] (Рис. 1.4.). YZ связан водородными связями с двумя молекулами воды, лигандирующими атом кальция (W4 и W3). C W4 он связан напрямую, а с W3 – через еще одну молекулу воды. Через эту последнюю молекулу воды также проходит цепочка водородных связей, связывающая две молекулы воды, лигандирующие Mn4, и YZ. Еще одна прочная водородная связь длиной 2,5 была обнаружена между YZ и -азотом D1-His190 в противоположном направлении от марганцевого кластера. D1-His190, в свою очередь, связан с D1-Asn 298, а через него – с несколькими молекулами воды и аминокислотными остатками, включая CP43-Ala411, D1-Asn322 и PsbVyr137, образующими путь выхода в люменальную фазу. Эта система водородных связей расположена на поверхности соприкосновения субъединиц D1, CP43 и PsbV и может выступать в качестве пути выделения протона, отщепляемого от YZ. Данный факт свидетельствует в пользу того, что существует путь для выброса протонов, высвобождающихся от YZ, с участием D1-His190.
Фотоактивация фс 2
Чтобы расщепить молекулу воды, ФС 2 генерирует высокий окислительный потенциал. Это происходит в хрупком биологическом материале в условиях высокой концентрации кислорода. Поэтому образование активных форм кислорода, например, синглетного кислорода или других форм кислородных радикалов, происходит довольно часто. В дневное время ФС 2 нельзя выключить, чтобы предотвратить образование активных форм кислорода. ФС 2 всегда работает в стрессовых условиях, и ее время жизни довольно коротко. Прекращение фотосинтеза при высокой освещенности называется фотоингибирование или фотоинактивация. Период полураспада основного белка ФС 2 может составлять 30 минут-1 ч даже в условиях нормальной освещенности [Aro et al., 1993]. Фотоингибирование зависит не только от освещенности и может ускоряться при высокой или низкой температуре, засухе и т.п.
Чтобы поддерживать фотосинтетическую продуктивность растения на постоянном уровне, необходимо синтезировать новые комплексы ФС 2 с той же скоростью и в том же количестве, в котором они разрушаются. Синтезированный комплекс ФС 2 нуждается в марганцевом кластере для расщепления воды. Сборка марганцевого кластера происходит на конечных этапах синтеза и сборки комплексов ФС 2.
Фотоингибирование с деградацией белка D1 происходит, когда защитные механизмы, в основном на уровне антенны, не справляются с задачей. Деградация D1 происходит после ингибирования реакций переноса электронов. Было описано два независимых механизма ингибирования реакций переноса электронов: акцепторное фотоингибирование и донорное фотоингибирование. Оба механизма фотоингибирования приводят к повреждению и деградации белка D1. Длительное освещение также вызывает деградацию белка D2 и, в некоторой степени, деградацию также белков Cyt b559, CP43 и CP47, хотя эти процессы протекают значительно медленнее [Mattoo et al., 1999]. Сначала необходимо удалить поврежденный белок D1 и только затем можно встроить новую копию белка. Деградация поврежденного D1 требует нескольких специфичных протеаз.
Некоторые редокс-кофакторы, например, QA и YZ, повреждаются или инактивируются на ранних стадиях фотоингибирования. После потери белка D1 в комплексе ФС 2 происходят вторичные изменения. На каждый деградируемый белок D1 приходится 4 иона марганца, высвобождаемых от сайта связывания марганца. Высвобождение остальных кофакторов (хлорофиллов, каротиноидов, феофитинов), по-видимому, происходит в процессе деградации D1. Высвобождение трех периферических белков происходит с той же скоростью, что и деградация D1. После этого происходит частичное разъединение гидрофобного ядра ФС 2. Первый этап фотоингибирования процессов переноса электронов происходит в сомкнутых участках сердцевины гран, где расположены наиболее активные комплексы ФС 2. Ингибирование реакций переноса электронов, повреждение белка D1 и отщепление ионов марганца и периферических субъединиц также происходят в гранальной области мембран тилакоидов. Эти события запускают латеральное перемещение комплексов ФС 2 в соприкасающиеся со стромой области мембраны. Деградация белка D1 и последующая разборка ФС 2 происходят в стромальных ламеллах, где комплексы ФС 2 хорошо доступны репаративным ферментам хлоропласта. После того, как осуществляется репарация ФС 2, комплекс должен переместиться обратно в сердцевину гран. Таким образом, в тилакоидной мембране осуществляется масштабный латеральный перенос белков.
В отличие от некоторых стабильных неорганических кластеров, способных к самосборке, КВК весьма нестабилен. Активный центр КВК (марганцевый кластер) может обратимо собираться только в присутствии комплекса апо-КВК-ФС 2 в результате светозависимого процесса, называемого фотоактивация. Сильный окислитель P680+ имеет, помимо основной, еще одну функцию: окисление ионов марганца при сборке КВК. Интермедиаты процесса фотоактивации не являются кинетически стабильными, о чем свидетельствует низкая эффективность фотоактивации при импульсном освещении с длительными (более двух секунд) интервалами между вспышками [Cheniae & Martin, 1971]. С другой стороны, слишком короткие интервалы тоже неэффективны, т.к. темновая стадия ( 150 мс) должна завершиться между вспышками. Впрочем, есть данные, что добавление экзогенного восстановителя сдвигает оптимум в сторону более коротких интервалов, что объясняют снижением стабильности интермедиатов [Ono et al., 1987]. Было предложено несколько кинетических моделей, и все они содержали образование метастабильного интермедиата на лимитирующей стадии, требующей присутствия Mn2+ и световой и темновой стадий. Однако данных, которые дали бы возможность определить молекулярную структуру, степени окисления и реакционную способность интермедиатов, пока недостаточно.
Приготовление протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС 2
Как уже было отмечено, КВК является самым лабильным участком в электрон-транспортной цепи в тилакоидах оксигенных организмов, особенно при различных стрессовых условиях. Удаление ионов марганца из КВК приводит к экстракции кальция и периферических белков с последующим ингибированием реакции окисления воды и выделения кислорода. Исследования процесса реконструкции КВК in vitro ранее в основном проводились в различных препаратах ФС 2 в растворе.
Нами была исследована реакция переноса электрона от донора на пластохинон, являющийся терминальным акцептором электрона c помощью измерения кинетики индукции флуоресценции в ядерных комплексах ФС 2 с поврежденным (апо-КВК-ФС 2) и реконструированным КВК в растворе или в липосомах. Последние были получены либо из фосфолипидов (азолектин), либо из смеси тилакоидных липидов. Исследования кинетики световой индукции флуоресценции хлорофилла позволяют получить подробную информацию о состоянии электрон-транспортной цепи. Кривые индукции флуоресценции изолированных ядерных комплексов ФС 2, так же, как и в случае мембранных фрагментов [Pospil & Dau, 2000], обладают двухфазной кинетикой (так называемые фазы O-J и J-P) без промежуточной фазы I, которая обнаруживается в хлоропластах и тилакоидных мембранах. Начальная (фотохимическая) фаза O-J соответствует восстановлению первичного хинонного акцептора QA, в то время как фаза J-P обусловлена восстановлением терминального акцептора пластохинона на акцепторной стороне ФС 2. Известно, что в мембранных фрагментах, обогащенных комплексами ФС 2, константа скорости фазы J-P зависит от скорости переноса электронов от марганцевого кластера к пулу пластохинона и прямо пропорциональна стационарной скорости выделения кислорода; полное подавление фазы J-P соответствует полному ингибированию выделения кислорода [Ibid.]. Следует отметить, что амплитуда и характерное время фазы J-P различаются в разных препаратах. Интенсивность флуоресценции на уровне P зависит от скорости восстановления и от размера пула пластохинона [Kurreck et al., 2000]. Число молекул пластохинона на РЦ ФС 2 различается в различных препаратах. В ядерных комплексах ФС 2, использованных в настоящей работе, заполненность сайта QB не была определена, но она может быть низкой, так как характерное время фазы J-P приблизительно в 2 раза выше, чем в мембранных фрагментах, обогащенных ФС 2 [Pospil & Dau, 2000]. Нельзя исключать наличия пластохинонов в сайте QС в ФС 2 [Kaminskaya et al., 2007].
В случае ядерных комплексов ФС 2 в растворе, после включения возбуждающего света уровень J на индукционной кривой достигается за 2 мс, в то время как уровень P достигается за 1 с (Рис. 3.4.). Совершенно другая картина наблюдается в препаратах апо-КВК-ФС 2. Удаление периферических белковых субъединиц и неорганических кофакторов КВК вызывает полное исчезновение фазы J-P и появление провала сразу после фотохимической фазы. Этот провал может свидетельствовать об удалении марганца, как заключили Pospil & Dau [2000] на основании данных, полученных с помощью измерения кинетики индукции флуоресценции на мембранных фрагментах, обогащенных ФС 2. Подавление амплитуды фазы J-P может служить качественным индикатором ингибирования кислород-выделяющей активности. Отметим, однако, что в комплексах апо-КВК-ФС 2, возрастание флуоресценции, возможно, соответствует не стадии J, а стадии K, которая отражает однократное разделение зарядов с тирозином YZ в роли донора электронов, как было показано в экспериментах на листьях с разрушенным КВК ФС 2 [Tth et al., 2007].
Кривые индукции флуоресценции ядерных комплексов ФС 2 в растворе в отсутствие искусственных акцепторов электронов. Среда инкубации содержит 25 мМ MES-NaOH (pH 6,5), 300 мМ сахарозы, 10 мМ NaCl и 5 мМ CaCl2. MnCl2 добавляли только к препаратам апо-КВК-ФС 2. Концентрация хлорофилла - 10 мкг/мл.
Добавление небольшого количества MnCl2 в соотношении 4,0 иона марганца на реакционный центр ФС 2 вызывает увеличение амплитуды фотохимической фазы O-J с последующим восстановлением фазы J-P в препаратах апо-КВК-ФС 2 (Рис. 3.4.). В этих условиях относительная стационарная скорость выделения кислорода составляет до 60% от контроля (Таблица 3.1.). Отметим, что дальнейшее увеличение соотношения Mn/РЦ не влияет на кинетику флуоресценции, в то время как при соотношении 2,0 иона марганца на 1 РЦ степень восстановления кислород-выделяющей активности и скорость выделения кислорода пренебрежимо малы (не показано). Эти данные позволяют заключить, что каждый активный КВК требует 4 ионов марганца для максимальной активности.
Увеличение амплитуды фазы J-P в присутствии 4,0 Mn на РЦ в препаратах апо-КВК-ФС 2 в растворе свидетельствует о частичном восстановлении кислород 80 выделяющей активности ФС 2, хотя наблюдается увеличение характерного времени фазы J-P ( 320 мс) по сравнению с образцами с активным КВК ( 200 мс) (Таблица 3.1.).
Отметим, что, помимо типа препаратов ФС 2, восстановление кислород-выделяющей активности также зависит от конкретных условий эксперимента, таких как концентрация ионов кальция и бикарбонат-ионов, тип экзогенного акцептора электронов, метод удаления марганца и кальция, присутствие или отсутствие периферических белков с молекулярными массами 17, 23 и 33 кДа ([Dasgupta et al., 2008] и ссылки там же). В настоящей работе метод измерения кинетики индукции флуоресценции также был применен к ядерным комплексам ФС 2, встроенным в липосомы из азолектина (фосфолипидов соевых бобов) и из смеси липидов тилакоидов шпината (MGDG/DGDG/SQDG/PG). Данная смесь тилакоидных липидов аналогична по составу тилакоидной мембране, из которой выделяют ФС 2 [Murata et al., 1997]. Известно, что многие мембранные белки проявляют максимальную функциональную активность при правильной ориентации в липидном бислое [Rigaud & Levy, 2003]. В частности, встраивание в мембрану является одним из подходов к выявлению механизма функционирования мембранных белков, осуществляющих векторный перенос зарядов.
Встраивание ядерного комплекса ФС 2 в липосомы требует сохранения его активности во время контакта с детергентом, используемым для получения липосом. Существуют различные способы приготовления протеолипосом [Ibid.]. Мы использовали гель-фильтрацию для удаления детергентов, так как она сокращает время взаимодействия между ядерными комплексами ФС 2 и детергентом.
Как видно из Рис. 3.4. и 3.5., амплитуда фазы J-P в кинетике индукции флуоресценции в ядерных комплексах ФС 2 с активным КВК в растворе и в протеолипосомах практически одинакова, хотя в случае протеолипосом время жизни фазы J-P меньше (Таблица 3.1.). Следует отметить, что полярографические измерения показали, что относительные скорости выделения кислорода в этих препаратах также одинаковы (не показано). Увеличение амплитуды фазы J-P в присутствии экзогенного MnCl2 в препаратах апо-КВК-ФС 2, встроенных в липосомы из азолектина, свидетельствует о частичном восстановлении кислород-выделяющей активности фермента (Рис. 3.5.). В этих условиях относительная скорость выделения кислорода в протеолипосомах составляла до 55% от таковой в препаратах ФС 2 с активным КВК
Электрогенные реакции, обусловленные s-переходами квк, в протеолипосомах, содержащих фотоактивированные препараты апо-квк-фс 2
Пул пластохинона, в обычном понимании, - это свободные молекулы, находящиеся в гидрофобном липидном пространстве тилакоидной мембраны, функционально значимые постольку, поскольку они способны к обмену с молекулами, локализованными в специальных сайтах в интегральных белках тилакоидной мембраны (в частности, в сайте QB ФС 2 и пластохинон-редуктазном сайте цитохромного комплекса b6f). Ядерные комплексы ФС 2 практически не содержат мембраны, и поэтому применение к ним понятия «пластохиноновый пул» спорно. Возможна реконструкция функции пула пластохинона в случае протеолипосом с комплексами ФС 2. Следует отметить, что реконструкция пластохинона в нашем случае не требует серьезной обработки суспензии ФС 2, такой как озвучивание [Kurreck et al., 1995].
Отсутствие явно выраженной фазы J-P в препаратах апо-КВК-ФС 2, вероятно, обусловлено ингибированием переноса электронов на акцепторной стороне, а именно, между QA и QB в результате сдвига редокс-потенциала QA на +150 мВ (см. далее и [Krieger et al., 1995]). Добавление экзогенного марганца, однако, не приводит к появлению фазы J-P, как следовало бы ожидать. Но и в случае ядерных комплексов ФС 2 с активным КВК явно выраженная фаза J-P наблюдается не всегда. Логичным объяснением было бы недостаточное содержание пластохинона в препарате. Действительно, содержание пластохинона в препаратах данного типа исчерпывается QA и QB, а пластохиноновый пул практически отсутствует.
Мы предполагаем, что в ядерных комплексах ФС 2, используемых нами, существуют дополнительные сайты связывания пластохинона наряду с сайтом QB [Kurreck et al., 1995; Kaminskaya et al., 2003]. Эти сайты демонстрируют удивительно высокую специфичность по типу связываемого хинона. На основании сравнения результатов, полученных Kurreck et al. [1995], и наших, структура хинонного кольца представляется более важной, чем структура гидрофобной боковой цепи и/или общая липофильность соединения.
Повышение амплитуды фазы J-P в присутствии экзогенного dPQ отражает увеличение доли фотоактивированных комплексов апо-КВК-ФС 2. По-видимому, функциональная активация хинон-акцепторной стороны РЦ действительно делает более эффективной фотоактивацию донорной стороны ФС 2. Кроме того, как в случае интактных комплексов, так и фотоактивированных апо-КВК-ФС 2 в присутствии dPQ на кинетических кривых отсутствует провал, свидетельствующий о разрушении марганцевого комплекса. Таким образом, можно заключить, что нам удается наблюдать сопряжение функционирования донорной и акцепторной стороны ФС 2.
Среднеточечный потенциал первичного хинонного акцептора QA (Em (QA/QA-)) является одним из ключевых параметров для выявления энергетических и кинетических характеристик ФС 2 [Krieger et al., 1995; Shibamoto et al., 2010] и связан с активностью КВК. Этот параметр был измерен в различных препаратах различными методами [Shibamoto et al., 2010]. Отметим, что полученные из литературы значения Em(QA/QA-) демонстрировали большой разброс, принимая значения около -300, -100, 0 и +100 мВ против стандартного водородного электрода [Wydrzynski & Satoh, 2005].
В настоящей части работы было проведено редокс-титрование амплитуды генерации в ответ на первые лазерные вспышки, связанной с переносом электронов от YZ на QA и от Mn на QA в адаптированных к темноте комплексах ФС 2 с поврежденными и реконструированными КВК, соответственно. Кривая редокс-титрования комплексов апо-КВК-ФС 2 показана на Рис. 3.15. Уменьшение амплитуд электрических ответов апо-КВК-ФС 2 при равновесном восстановлении QA, показало, что Em QA (+65 мВ) не меняется при добавлении MnCl2 и CaCl2 в темноте (не показано).
Чтобы понять, необходимы ли для изменения потенциала QA ионы марганца или кальция, редокс-титрование проводилось в присутствии каждой из солей по отдельности. Инкубации препаратов на свету с только хлоридом марганца или только хлоридом кальция было недостаточно для того, чтобы вызвать переход от высокопотенциальной формы к низкопотенциальной форме QA. Единственные условия, при которых это было возможно, совпадали с условиями реконструкции выделения кислорода. Хотя в присутствии марганца на свету удается
Кривая редокс-титрования фотоактивированных комплексов апо-КВК-ФС 2. Черными квадратиками обозначено окислительное титрование, белыми – восстановительное. Данные аппроксимированы одноэлектронной нернстовской кривой с Em = -150 мВ.
Далее мы использовали прямой электрометрический метод для исследования электрогенных реакций в Mn-реконструированных (фотоактивированных) комплексах апо-КВК-ФС 2 в присутствии dPQ в качестве вторичного хинонного акцептора (ядерные комплексы ФС 2, ассоциированные с коллодиевой пленкой, не содержат пластохинона QB). Поскольку QB является двухэлектронным переносчиком, для выявления электрогенеза, обусловленного функционированием хинон-акцепторного участка фермента, регистрировались электрические ответы, индуцированные вторыми вспышками света (при условии, что хинон в сайте QB изначально находится в окисленной форме).
Отсутствие дополнительного электрогенеза в ответ на первую лазерную вспышку предполагает, что реакция протон-сопряженного переноса электрона между QA и Fe3+ не происходит (не показано). В кинетике электрического ответа на вторую вспышку света в присутствии dPQ наблюдается дополнительная электрогенная фаза (Рис. 3.17, Б). Разложение этой фазы демонстрирует наличие по крайней мере двух фаз с характерными временами 185 мкс и 0,5 мс. Что касается природы этих реакций, они могут быть вызваны комбинацией различных процессов, таких как переход S2S3 КВК, протонирование дважды восстановленного QB и быстрые структурные перестройки, сопровождающие восстановление QB. Отметим, что электрогенная фаза, индуцированная второй лазерной вспышкой и связанная с переходом КВК S2S3 (а именно, с выделением протона в водную фазу), была нами обнаружена в фотоактивированных комплексах апо-КВК-ФС 2 в присутствии феррицианида. Характерное время этой дополнительной фазы - 220 мкс, что близко к характерному времени более быстрой дополнительной фазы в присутствии dPQ ( 185 мкс). Что касается медленной электрогенной фазы с 0,5 мс, то она, вероятно, отражает реакцию протонирования Ов2-. В пользу последнего свидетельствует влияние 3-(3,4,-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевины (DCMU), ингибитора переноса электрона между QA и QB, на кинетику медленной фазы. Добавление DCMU устраняет более медленную фазу, оставляя только более быструю (Рис. 3.17.). Таким образом, только фаза с характерным временем 0,5 мс связана с протонированием дважды восстановленного QB.
С другой стороны, добавление dPQ без фотоактивации КВК к апо-КВК-ФС 2 не вызывает появления дополнительного электрогенеза в микросекундной или миллисекундной шкале времени.
Результаты работы показывают, что прямой электрометрический метод может быть применен для изучения сопряженной активации реакций на донорной и акцепторной сторонах фотоактивированного комплекса апо-КВК-ФС 2. В этих препаратах впервые была обнаружена кроме генерации мембранного потенциала, обусловленной функционированием КВК, а именно выбросом протона при S2 S3 переходе, электрогенная реакция, связанная с протонированием дважды восстановленного QB.
