Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Свойства -амилоида 11
1.1.1. Болезнь Альцгеймера. 11
1.1.2. Бета-амилоидный пептид 19
1.1.3. А и кальциевый гомеостаз 24
1.1.4. Формирование ионных каналов амилоидом 26
1.1.5. Митохондрии в А патологии 28
1.1.6. -Амилоид и окислительный стресс 31
1.2. Свободные радикалы в клетке. 36
1.2.1. Общие свойства свободных радикалов 36
1.2.3. Митохондрии и продукция АФК 41
1.2.4. Ксантин оксидаза 46
1.2.5. НАДФН оксидаза 48
1.2.5.а. Цитозольные регуляторные субъединицы НАДФН оксидазы 51
1.2.5.б. Активация НАДФН оксидазы 52
1.2.5.в. НАДФН оксидаза в клетках центральной нервной системы 53
1.2.6. Цитохром P-450 54
1.2.7. Антиоксидантная система клетки 56
1.2.7.1. Ферментативные антиоксиданты 56
1.2.7.1.а. Супероксид дисмутаза 56
1.2.7.1.б. Глутатион пероксидаза 58
1.2.7.1.в. Каталаза 1.2.7.2. Неферментативные антиоксиданты 59
1.2.7.2.а. Витамины 59
1.2.7.2.б. Глутатион, основные функции. 60
1.2.7.2.6.1. Синтез глутатиона 60
1.2.7.2.6.2. Метаболизм глутатиона 61
1.3 Мембранный холестерин 62
1. 4. Кальциевая сигнализация. 64
1.4.1. Кальциевые насосы и обменники плазмалеммы и внутриклеточных органелл 66
1.4.1.а. Са2+-ATPазы 66
1.4.1.б. Ca2+ -обменники 68
1.4.2.Кальциевые каналы 69
1.4.2.1. Кальциевые каналы плазмалеммы 69
1.4.2.2. Внутриклеточные Са2+-каналы 76
1.2.5. Митохондрии 79
1.2.5.1. Роль митохондрий в кальциевой сигнализации 82
1.2.5.2. Аккумуляция Са2+ митохондриями 83
1.2.5.3. Система вывода Са2+ из митохондрий 86
1.2.5.4. Митохондриальная пора 87
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1 Культуры клеток 90
2.2 Определение содержания цитозольного кальция и митохондриального потенциала 2.3. Метод определения содержания глутатиона 94
2.4. Дифференциальный подсчет количества мертвых и живых клеток 94
2.5. Измерение скорости производства активных форм кислорода 95
2.6. Измерение транспорта флуоресцентного А в гипокампальные астроциты и нейроны 96
2.7 Метод регистрации НАДН 96
2.8 Измерение уровня холестерина в мембранах клеток 97
2.9. Измерение NO 97
2.10. Вестерн блот анализ 98
2.11. Иммунофлуоресценция 99
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 101
3.1.Влияние РА 25-35 и 1-42 на [Ca2+]c гиппокампальных и кортикальных нейронов и астроцитов. 102
3.2.рА-индуцированный сигнал в астроцитах и его зависимость от внутри- и внеклеточных Са2+-депо 106
3.3. рА-индуцированный вход ионов Са2+ в астроциты 113
3.4. Пути рА-индуцированного входа внешнего Са2+ 117
3.5. Ионная селективность каналов на плазмаллемме астроцитов сформированных из А 122
3.6. Зависимость А-индуцированного кальциевого сигнала в астроцитах от агрегации и длины пептидной цепочки 127
3.7. Измерение проникновения флуоресцентного А 1-42 в нейроны и астроциты 131
3.8. Зависимость А-индуцированного Са2+-сигнала от концентрации холестерина в плазмаллемме нейронов и астроцитов 133
3.9. Влияние Р-амилоида на Ауm 1 3.10. Роль [Ca2+]с в Р-амилоид стимулированных изменениях Дут 143
3.11. Способность дыхательных субстратов предотвращать действие РА на митохондрии 145
3.12. Роль свободных радикалов в митохондриальной деполяризации индуцированной рА 149
3.13. Роль циклоспорин-чувствительной поры в действии рА на митохондрии 152
3.14. Источники рА-индуцированной гиперпродукции свободных радикалов - роль НАДФН оксидазы 157
3.15. Эффект РА на продукцию АКФ 161
3.16. Активация ПАРП при действии А 166
3.17. Действие А на [GSH] в астроцитах и нейронах 172
3.18. Влияние А на перекисное окисление липидов 176
3.19. Влияние А на продукцию NO в нейронах и астроцитах 178
3.20. Токсичность рА в свете его действия на кальциевый сигнал, митохондриальный потенциал и НАДФН оксидазу 181
3.21. Экспрессия субъединиц НАДФН оксидазы в астроцитах 189
3.22. Функциональный анализ НАДФН оксидазы в астроцитах 192
3.23. Активация НАДФН оксидазы ионами кальция 196
3.24. Активация астроцитов стимулирует НАДФН оксидазу 204
3.25. Активность НАДФН оксидазы астроцитов регулируется мембранной протонной проводимостью и градиентом рН 206
3.26. Роль клеток микроглии в механизме нейротоксичности -амилоида. А-индуцированные изменения [Са2+]с микроглии 210
3.27. Механизм активации НАДФН оксидазы в клетках микроглии при действии А 2 3.28. Роль CLIC 1 в А стимуляции НАДФН оксидазы 219
Заключение 223
Выводы 230
Список используемой литратуры
- А и кальциевый гомеостаз
- Измерение скорости производства активных форм кислорода
- Ионная селективность каналов на плазмаллемме астроцитов сформированных из А
- Токсичность рА в свете его действия на кальциевый сигнал, митохондриальный потенциал и НАДФН оксидазу
А и кальциевый гомеостаз
При помощи флуоресцентного зонда Fillipin впервые показана разница в уровне холестерина в плазмаллеме гиппокампальных и кортикальных нейронов и астроцитов. Изменение концентрации холестерина в мембране нейронов и астроцитов при помощи ингибиторов и статинов показало, что для встраивания А в биологические мембраны необходим холестерин.
В настоящей работе обнаружена способность А вызывать различные формы митохондриальной деполяризации гиппокампальных и кортикальных астроцитов. Впервые на уровне целостной клетки показано быстрое и полная, циклоспорин А-зависимое изменение митохондриального потенциала при действии А.
При помощи специфических зондов для измерения активных форм кислорода дикарбофлуоресциина и дигидроэтидиума показано А –индуцированное производство свободных радикалов в НАДФН оксидазе.
Впервые обнаружена способность АФК произведенных в НАДФН оксидазе астроцитов вызывать изменения в митохондриальном трансмембранном потенциале посредством активации ПАРП и потребления НАД, а так же за счет индукции открытия митохондриальной поры. Обнаруженно, и при помощи Вестерн блот анализа и метода иммунофлуоресценции достоверно подтверждено наличие фермента НАДФН оксидазы в гиппокампальных и кортикальных астроцитах. Произведен анализ механизма стимуляции и регуляции этого фермента в астроцитах, клетках микроглии и клетках линии BV2 различными активаторами, включая А. Впервые показано участие фермента НАДФН оксидазы астроцитов в А-индуцированной гибели нейронов.
Впервые обнаружено межклеточное взаимодействие, когда -амилоид индуцированный кальциевый сигнал и изменения в митохондриальном мембранном потенциале в одном типе клеток (астроциты) может приводить к гибели другого (нейроны).
Научно-практическая значимость. В настоящее время активно ведется поиск как фармакологических, так и иных способах лечения и предупреждения болезни Альцгеймера. Данные полученные в данной работе по влиянию А на кальциевый сигнал, митохондриальный мембранный потенциал, уровень основного антиоксиданта центральной нервной системмы глутатиона, а так же о влиянии полипептида на продукцию АФК в астроцитах и микроглии смогут позволит существенно расширить имеющиеся представления о возможных путях остановки гибели нейронов и дегенеративных процессов в головном мозге при болезни Альцгеймера.
Обнаружение НАДФН оксидазы и анализ механизма ее активации в различных клетках так же может позволить предотврашать патологическое воздействие АФК в ЦНС, не подавляя при этом иммунитет. Кроме того, обнаруженная в данной работе способность А индуцировать открытие митохондриальной PTP и активацию НАДФН оксидазы может быть использовано в дальнейших их исследованиях.
Связь темы исследования с планом научных работ. Работа была финансирована грантом Королевского Научного общества Великобритании, Международным грантом организации The Wellcome Trust (Великобритания) и трехлетним проектным грантом этой же организации, а так же однолетним грантом CRDC.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на ежегодных съездах общества биофизиков (2003 – Сан Антонио, США; 2004- Балтимор, США; 2005 – Лонгбич, США; 2010 – Сан Франциско, США; 2013 – Филадельфия, США), конференциях Британского физиологического общества (2002, 2006, 2012 года – Лондон, Эдинбург, Великобритания), Европейском конгрессе физиологов (2003, Ница, Франция), 2 Международном конгрессе Нейрорегенерации (2004, Рио-де-Жанейро, Бразилия), Гордоновской исследовательской конференции «Свободные радикалы» (2005, Вентура, США), Международной научной конференции «Рецепция и внутриклоточная сигнализация» (2005, Пущино, Россия), Съезде Европейского общества нейрохимиков (2005, Инсбрук, Австрия), Глиальном конгрессе (2013, Берлин, Германия), на конференци Британского биохимического общества «Роль астроцитов в нейродегенерации» (Лондон, 2014). По материалам диссертации были проведены научные семинары в отделении физиологии Университетского колледжа Лондона (2005, Великобритания), отделении физиологии Кембриджского университета (2005, Великобритания), отделении физиологии и биофизики Калгарийского университета (2006, Канада), митохондриальном центре университета Ньюкастла (2007, Великобритания), в институте ИНСЕРМ (2008, Ницца, Франция), в университете Далхауси (2011, Галифакс, Канада), в Имперском колледже Лондона (2007, 2013, Лондон, Великобритания).
Измерение скорости производства активных форм кислорода
Не смотря на то, что супероксидный радикал кислорода сам по себе обладает малой реакционной способностью, он может нейтрализоваться спонтанно в водной среде с образованием синглетного кислорода. Однако, учитывая возможность повреждения клетки данным радикалом, клетка использует фермент супероксид дисмутаза (СОД). Различают несколько видов этого фермента, при этом все они катализируют одну и ту же реакцию получения перикиси водорода: ОО" + ОО" +2Н+ О2 + НООН Достаточно неаквная Н2О2 опасна при взаимодействии с металлами перементной валентности приводит к образованию одного из наиболее химически активных радикалов - гидроксид радикал (реакция Фентона): Fe2+ + Н202 -» Fe3+ + ОН- + ОН
Этот радикал является причиной окислительной модификации клеточных структур. Так, взаимодействуя с SH-группами белков, ОН вызывает денатурацию белков и инактивацию ферментов (Владимиров, 2000), однако наиболее активно этот радикал атакует мембранные липиды, которые содержат ненасыщенные двойные связи, что приводит к процесса перикисного окисления липидов (Болдырев, 2001).
Следует отметить, что гидроксид радикал может образовываться и без участия металлов с переменной валентности, при взаимодействии перикиси водорода с супероксид радикалом: О2- + Н202 -» ОН- + ОН Клетки иммунной защиты - фагоциты, используют перикись водорода в миелопероксидазной реакции для образования гипохлорита: Н202 + С1"-»Н20 + С10"
Гипохлорид способен разрушать стенку бактериальной клетки, индуцируя её гибель. Он опасен для любого типа клеток сам по себе, но так же и тем, что в присутствии ионов железа может превращаться в гидроксид радикал (Осипов и др., 1993; Владимиров, 2000). Н2О2 как более гидрофобное соединение может покидать клетку, но и оставшаяся перикись водорода утилизируется ферментами глутатионпероксидазой или каталазой: Н202 + 2GSH -» GSSG +2 Н20 Н202 каталаза Н20+02 NO - газообразный химический посредник, являющийся свободным радикалом. Молекула NO синтезируется ферментом NO-синтазой (NOS) из его метаболического предшественника аминокислоты L-аргинина. Описано несколько изоформ NOS: конститутивная, постоянно присутствующая в ткани (cNOS), и индуцибельная (iNOS) (Lamas et al, 1992). По приемущественной локализации в тканях принято выделять нейрональную (nNOS), эндотелиальную (eNOS) и макрофагальную (macNOS) NO-синтазы. Кальций-кальмодулинзависимость cNOS предполагает, что фермент может генерировать NO в ответ на рецепторную стимуляцию, например активацию NMDA-рецепторов в условиях ишемии мозга, или действие агентов, повышающих уровень внутриклеточного Са2+. В условиях дефицита L-аргинина nNOS, как оказалось, может генерировать супероксид-анион и перекись водорода, способные оказывать нейротоксическое действие при ишемии (Башкатова, Раевский, 1998). Кроме того, показано, что быстрая реакция сопряжения NO и О2 приводит к образованию пероксинитрита (ONOO"), который обладает уникальной реактивностью. NO#+02-- ONОOH" (пероксинитрит). Пероксинитрит, образующийся в этой реакции, может разлагаться с образованием ОН: ONОOH" - ONO + ОН (радикал гидроксила).
Образование пероксинитрита и радикала гидроксила приводит к повреждению клеток, которое может быть направлено как на болезнетворные микроорганизмы, так и на собственные клетки и ткани (Маеда, 1998). Естественным путем удаления этого радикала является его связывание гемоглобином и последующее окисление.
Основным источником первичных радикалов в организме служат фагоциты, т. е. гранулоциты и моноциты крови, а также тканевые макрофаги. Для борьбы с бактериями эти клетки образуют супероксидные радикалы, которые затем превращаются в перекись водорода и гипохлорит. Супероксид и NO с готовностью превращаются ферментами или неферментативными химическими реакциями в активные нерадикальные формы, такие как синглетный кислород (Ог), Н2О2 или пероксинитрит (ONOO"), т. е. в формы, которые могут привести к возникновению новых (вторичных) радикалов (Droge, 2002).
Ионная селективность каналов на плазмаллемме астроцитов сформированных из А
Существует три основных типа кальциевых каналов, классифицированные на основе их регуляторных механизмов -потенциал-управляемые, рецептор-управляемые и запас-управляемые.
Потенциал-управляемые каналы впервые были обнаружены в электровозбудимых клетках. Они характеризуются тем, что при потенциале покоя (-70-80 мВ) находятся в неактивном состоянии, а их активация происходит при сдвиге потенциала в положительную область, т.е. при деполяризации мембраны (Gao, 2000).
Идентифицировано несколько типов этих каналов, различающихся по чувствительности к мембранному потенциалу и фармакологическим веществам, а также по проводимости (Tsien, Tsein, 1990): L-, T-, N- и P типы. L-тип Са2+-каналов найден практически во всех электровозбудимых, и во многих электроневозбудимых клетках. Каналы L-типа (от англ. long-lasting, т.е. долгоживущие), будучи активированы, сохраняют это состояние довольно долго. Характерным признаком кальциевых каналов L-типа является их чувствительность к дигидропиридинам и другим кальциевым антагонистам. Каналы Т-типа (от англ. transient - кратковременный) (Ткачук, 1999) открываются при существенно более отрицательном мембранном потенциале (по сравнению с каналами L-типа) и быстро инактивируются. Через каналы Т-типа в клетки поступает быстрая составляющая кальциевого тока (Miller, 1996). Эти два типа кальциевых каналов осуществляют вход Са2+ в клетки сердца (Nilius et al., 1995). В нейронах обнаружен третий тип кальциевых каналов N-типа (neuron). N-каналы активируются при переходе от очень отрицательных значений мембранного потенциала к сильной деполяризации (Nowycky et al., 1985) и регулируют секрецию нейромедиаторов. Ток кальция через данные каналы в пресинаптических окончаниях ингибируется норадреналином через альфа-адренорецепторы. Каналы P-типа выявлены первоначально в нейронах Пуркинье, гранулярных клетках и в гигантских аксонах кальмара (Llinas et al., 1989). По-видимому, эти каналы также регулируют секрецию нейромедиаторов.
Каналы L-типа блокируются некоторыми органическими азотосодержащими липофильными соединениями: производными 1,4 дигидропиридинов (нифедипин, нитрендипин), фенилалкиламинами (верапамил, D-600), производными бензотиазепина (дилтиазем), а также специфическим ингибитором каналов L-типа кальцисептином. Вышеперечисленные блокаторы Са2+-каналов используются как препараты нормализующие кровяное давление за счет снижение входа Са2+ в клетки. Кроме того, VGCC блокируются катионами металлов, которые имеют большее сродство связывания с каналом, нежели Са2+. Впрочем, катионы, имеющие меньшее сродство, также способны конкурировать с Са2+ за связывающее место на канале, и, таким образом, уменьшать поток Са2+. Эффективность блокирования зависит от сродства иона к каналу, от радиуса иона, и, возможно, от степени гидратирования иона. Известно, что VGCC N- и P/Q-типов находятся под отрицательной регуляцией G-белков, сопряженных с пуринорецепторами (Currie, Fox, 1997). Эта регуляция может быть опосредована как вторичными посредниками, такими как cAMP и цГMФ, уровень которых зависит от активности G-белков, так и быть результатом непосредственного взаимодействия G-белка с VGCC. Действие cAMP и цГMФ на VGCC, в свою очередь, опосредовано соответствующими cAMP- и цГMФ-зависимыми протеинкиназами. cAMP-зависимая и СаМ-зависимая протеинкиназы оказывают активирующее действие на VGCC L-типа, а цГMФ-зависимая протеинкиназа и протеинкиназа С ингибируют проводимость этого канала. Различное действие протеинкиназ на активность каналов, очевидно, объясняется тем, что протеинкиназы имеют различные сайты фосфорилирования на канале. Другие типы этих каналов также фосфорилируется РКА и РКС, хотя еще не известно, какую роль играет это фосфорилирование. Таким образом, VGCC могут служить мишенями для разных сигнальных каскадов, и их действие может быть как аддитивным, так и взаимонейтрализующим. Наконец, активность каналов могут регулировать жирорастворимые вторичные мессенджеры, такие как, например, липоксигеназные метаболиты арахидоновая кислота (Jacques, Hartzell, 1996). Ее эффект , возможно, зависит от типа клеток и типа каналов: в одних случаях этот эффект ингибирующий, тогда как в других случаях, напротив, активирующий (Munaron et al., 1997). К рецептор-управляемым относятся проводящие Са2+ каналы, которые активируются исключительно по рецептор-опосредованному пути, а не в результате деполяризации плазматической мембраны. Различают три подгруппы рецептор-управляемых ионных каналов, участвующих в транспорте Са2+ . К истнно рецептор-управляемым каналам относятся каналы, в которых рецептор агониста либо сам выполняет функцию канала, либо непосредственно взаимодействует с канальной структурой. К числу истинных рецептор-управляемых каналов относятся, каналы, активируемые глютаминовой кислотой (NMDA-рецепторы) и адениловыми нуклеотидами (Р2-пуринорецепторы). Са2+ каналы, активируемые глутаминовой кислотой через рецепторы, агонистом которых является N-метил-D-аспартат (NMDA) в электрофизиологическом плане изучены подробно (Cotman, Iversen, 1987). Рецептор находиться в непосредственном контакте с малоселективным катионным каналом, и активация рецептора приводит к открыванию канала.
Токсичность рА в свете его действия на кальциевый сигнал, митохондриальный потенциал и НАДФН оксидазу
Неожиданность показанных выше результатов, в частности, отсутствие кальциевого сигнала у нейронов - при том, что нейротоксичность А очевидна и давно стала «классической», заставила нас предположить о том, что причиной этому может быть особенности или состояние нашей гиппокампальной культуры. Так, очевидно, можно предположить, что возраст культуры клеток может менять чувствительность нейронов к данному нейротоксину. Но, возраст культуры не изменял нечувствительность [Са2+]с гиппокампальных нейронов к РА, более того, согласно рисунку 8А-Б, величина, а также форма кальциевого сигнала в астроцитах практически не зависели от возраста первичной со-культуры. Кортикальные нейроны, так же как и гиппокампальные, черезвычайно чувствительны к токсическому действию -амилоида. В связи с этим, мы повторили данные эксперименты используя чистую первичную культуру кортикальных астроцитов. РА 1-42 (п=231) и 25-35 (п=126) обладали аналогичной активностью на [Са2+]с астроцитов, и опять не изменяли внутриклеточную концентрацию кальция в нейронах. Одними из наиболее близкими к физиологическим условиям можно считать экперименты, выполненые на эксплантальном срезе гиппокампа. На рисунке 9 представлены конфокальные изображения эксплантальной культуры загруженной флуоресцентным кальций 1 А
Зависимость рА-индуцированных изменений [Са2+]с астроцитов от внеклеточной концентрации Са2+. А - отсутствие кальциевого сигнала в кортикальных астроцитах в ответ на РА в безкальциевой среде. Б- отсутствие РА -стимулированных изменений в [Са2+]с гиппокампальных нейронов и астроцитов в среде без Са2+ и возникновение кальциевого сигнала в ответ на добавление Са2+, в астроцитах, но не в нейронах. В-постепенное уменьшение [Са2+]с РА -стимулированных кортикальных астроцитов после отмывки Са2+ из ячейки. течении 5-10 минут. Таким образом, А-индуцированный вход внешнего кальция может стимулировать выход Са2+ из ЭР.
Вход внешнего Са2+ в астроциты может служить тригером для выхода ионов кальция из внутриклеточных кальциевых депо через активацию фосфолипазы С с последующей мобилизацией инозитолтрифосфата (ІР3). Более того для колебательного типа кальциевого сигнала возникающего в астроцитах в ответ на разного рода стимуляторы (Peuchen et al, 1996), включая механическое воздействие (Charles et al, 1991) показан именно такой механизм. Однако, согластно данным, представленным на рисунке 11, ингибитор фосфолипазы С - 5 мкМ U73122 не изменял рА-индуцированного кальциевого сигнала в астроцитах (п=89 клеток). Ингибитор Независимого Са2+ выхода - 40 мкМ 2-АРВ также не менял эффект рА на [Са2+]с астроцитов (Рисунок 11Б; п=74). Для обоих вышеперечисленных ингибиторов контролем их действия служило отсутствие полная блокада действия 100 мкМ АТФ, стимуляция которого рецептора P2Y приводит к ГРЗ-зависимому выходу Са2+ из ЭР (Peuchen et al., 1996). Таким образом, неожиданно для нас, IP3 не влияет на формирование кальциевого сигнала в кортикальных и гиппокампальных астроцитов в ответ на нейротоксин.
Хотя и функция рианадинового рецептора (РР) в астроцитах спорна, рядом авторов показано его наличие в данном типе клеток (Matyash et al., 2002). В связи с этим, мы провели исследование роли РР в рА-стимулированном повышение [Са2+]с. Инкубация клеток с 10 мкМ дантролена (ингибитор реанадинового рецептора) так же не оказала
Время (мин) Рисунок 11. Внутриклеточные Са2+-депо не являются основными источниками (ЗА стимулированного кальциевого сигнала. Стимуляция клеток (ЗА вызывала изменения [Са2+]ц кортикальных и гиппокампальных астроцитов не смотря на инкубацию этих клеток с: А- 5мкМ U73122 (ингибитор фосфолипазы Ц), Б- 40 мкМ 2-АРВ (ингибитор 1Р3 реципторов), С- 10 мкМ дантролена (ингибитор рианодинового рецептора) и (Г) ингибитором Са2+-АТФазы ЭР 1 мкМ тапсигаргина, после которого ответ на 100 мкМ АТФ уже не наблюдался. какого-либо влияния на форму или амплитуду кальциевого сигнала, индуцированного РА (рисунок 11В, п=46).
Для того, чтобы полностью исключить возможную роль ЭР в генерации рА-индуцированного провышения [Са2+]с в астроцитах, мы использовали специфический ингибитор Са2+-АТФазы ЭР 1 мкМ тапсигаргин. Инкубация клеток с данным ингибитором (рисунок ИГ) приводила к полному опустошению кальциевого депо в ЭР, о чем свидельствует отсутствие ответа на 100 мкМ АТФ. Добавление к этим клеткам РА, после характерной задержки, вызывало изменения в [Са2+]с астроцитов, которые практически не отличались от контрольных. Средние значения роста [Са2+]с в клетках с преикубацией с тапсигаргином составляли 390+54 нМ, тогда как в контрольных астроцитах 456+57 нМ (п=301, р 0,05). Таким образом, мы достаточно достоверно можем утверждать, что Са2+-депо ЭР не играет значительной роли в РА индуцированном кальциевом сигнале.
Другой основной кальциевый резервуар клетки -митохондрия, имеет достаточно большую Са2+ емкость в астроцитах (Bonier et al, 1999). Более того, участие митохондрий в механизме рА индуцированного кальциевого сигнала достаточно вероятно, учитывая показанное для астроцитов РА индуцированное повреждение митохондрий (Casley et al, 2002). Добавление протонофора, 1 мкМ FCCP приводит к деполяризации внутренней митохондриальной мембраны, выходу Са2+ из органнелы и препятсвует дальнейшему транспорту ионов кальция внутрь митохондрий. В FCCP-обработанных клетках, как РА 1-42, так и 25-35 по-прежнему увеличивают [Са2+]с астроцитов (рисунок не показан, п=84).
