Введение к работе
Данная работа посвящена изучению фотофизических, фотохимических и фотобиологических свойств анионного фотосенсибилизатора мероцианина 540 (МЦ540).
МЦ540 нашел применение как флуоресцентный зонд, используется в фотодинамической инактивации микроорганизмов (ФДИ-МЦ540) - бактерий и вирусов, в фотодинамической терапии опухолей, что говорит о высокой практической значимости этого красителя. Существует много работ, в которых рассматривались перечисленные свойства МЦ540, но либо предложенные теоретические положения в этих работах не были доказаны, либо уже известные физико-химические закономерности фотопревращений МЦ540 в растворах не учитывались и как следствие не применялись в работах с биологическими объектами.
Ранее количественное описание переходов ионизированных форм красителя в агрегаты при добавлении солей содержали слишком большие упрощения, связанные с тем, что использовавшияся для этого спектрофотометрия не является специфическим и избирательным методом для регистрации агрегированных форм красителя. В то же время в литературе уже было описано явление резонансного светорассеяния (РСР) агрегатами красителей. Регистрация спектров РСР позволяет избирательно и с большой чувствительностью выявлять агрегаты красителей даже в присутствии большого количества его мономерных форм или других красителей. Метод РСР для исследования эффектов солей на агрегатное состояние МЦ540 в литературе не применялся. Первые работы на эту тему недавно появились только в нашей лаборатории. Отсутствие ясного описания процессов агрегации МЦ540 в водно-солевых растворов привело к тому, что при проведении антибактериальной ФДИ-МЦ540 не проверяли, как изменение агрегатного состояния красителя может повлиять на его фотобиологическую активность. При выборе условий фотосенсибилизированной инактивации бактерий применялись те среды, которые обычно используются в микробиологии, и не было сделано попыток изменить в них агрегатное состояние МЦ540 путем варьирования концентрации солей. Исходя из изложенного выше, были сформулированы цели и задачи настоящей работы.
Цель работы: Исследовать механизмы фотодинамических реакций мероцианина 540 и возможность их регулирования с помощью изменения агрегатного состояния МЦ540 в водных растворах путем добавления солей, а также оценить роль различных агрегатных форм МЦ540 в фотосенсибилизированной инактивации бактерий
Задачи работы.
-
Разработать модификацию метода регистрации спектров резонансного светорассеяния в водно-солевых растворах МЦ540 и разработать способы введения поправок на спектральную чувствительность прибора и эффекты экранировки возбуждающего света и реабсорбции рассеянного света.
-
Изучить качественные и количественные закономерности процессов агрегации МЦ540 в присутствии солей одно-, двух- и трехвалентных катионов используя методы спектрофотометрии, резонансного светорассеяния и динамического рассеяния света (ДРС).
-
Изучить влияние агрегатного состояния МЦ540 на его фотохимические превращения. Использовать полученную информацию для повышения эффективности фотосенсибилизированной МЦ540 инактивации бактерий.
Научная новизна работы.
Впервые было установлино существование критической концентрации соли (ККС), начиная с которой происходит формирование плотноупакованных агрегатов МЦ540. Обнаружено, что величина ККС одинакова для катионов Na+ и K+ и гиперболически зависит от концентрации МЦ540 в растворе. Показано, что произведение ККС на концентрацию МЦ540 является постоянной величиной, представляющей собой произведение растворимости диссоциированных форм красителя в воде. Методом ДРС обнаружено, вызванное добавлением солей формирование не плотноупакованных агрегатов диаметром 20-40 нм, когда концентрация соли ниже ККС. При концентрации соли в несколько раз выше ККС размеры агрегатов достигают диаметра 500-700 нм.
Фотосенсибилизированная МЦ540 инактивация бактерий зависит от агрегатного состояния МЦ540. В солевых растворах эффективность инактивации значительно увеличивается по сравнению с дистиллированной водой и приводит к гибели как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Фотовыцветание агрегированных форм МЦ540 может происходит по свободнорадикальному механизму. На это указывают ингибирующие эффекты L- аскорбиновой кислоты и ионола, которые не оказывают влияние на фотовыцветание мономерных форм, осуществляющиеся с участием синглетного кислорода.
Практическая значимость.
Фотосенсибилизированная МЦ540 инактивация бактерий зависит от агрегатного состояния МЦ540. Добавление солей в концентрациях, превышающих величину ККС и вызывающих формирование плотноупакованных агрегатов МЦ540, приводило к резкому увеличению эффективности инактивации как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, по сравнению с дистиллированной водой, где МЦ540 находится в ионизированном состоянии.
Фотовыцветание агрегированных форм МЦ540 происходит по свободнорадикальному механизму. На это указывают ингибирующие эффекты L- аскорбиновой кислоты и ионола, которые не оказывают влияние на фотовыцветание мономерных форм, осуществляющемуся с участием синглетного кислорода.
Разработаный подход для фотосенсибилизированной МЦ540 фотодинамической инактивации микроорганизмов, может быть применен в медицинской практике для стерилизации медицинских инструментов и поверхностей.
Положения, выносимые на защиту.
-
-
Добавление солей в растворы анионного фотосенсибилизатора мероцианина 540 приводит к изменению его агрегатного состояния и влияет на его фотофизические, фотохимические и фотобиологические свойства.
-
Исследования количественных закономерностей агрегации МЦ540, вызванной солями одно-, двух- и трехвалентных катионов, методами РСР и ДРС позволили установить существование критической концентрации соли (ККС), начиная с которой происходит формирование плотноупакованных агрегатов мероцианина 540, методом ДРС выявлено формирование рыхлых агрегатов при концентрациях солей ниже величины ККС.
-
Скорость фотовыцветания плотноупакованных агрегатов мероцианина 540 значительно выше, чем мономеров и димеров данного красителя.
-
Определение закономерностей процессов агрегации мероцианина 540 позволило повысить его антибактериальную фотодинамическую активность на суспензиях бактерий.
Внедрения результатов исследования. Результаты исследования используются в лекционном курсе кафедры физики и математики педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на Международном фотобиологическом конгрессе в Дюссельдорфе, Германия (2009 г.), на Европейских фотобиологических конгрессах во Вроцлаве, Польша (2009 г.) и Женеве, Швейцария (2011 г.), Съезде Российского фотобиологического общества в Шепси (2011 г.), 4-м Съезде биофизиков России в Нижнем Новгороде (2012 г.).
Результаты работы были обсуждены 13 июня 2012 г. на заседании кафедры физики и математики педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы в журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки; 13 тезисов докладов в материалах съездов, конгрессов, симпозиумов, Всероссийских, международных и региональных конференций.
Личное участие автора в получении научных результатов
Шмиголь Т.А. проделала значительный экспериментальный и аналитический объем работы. Также диссертантом были освоены методы культивирования бактерий и проведения на них фотодинамической инактивации, измерения резонансного рассеяния света, метод ультрафильтрации, а так же хемолюминесцентные, флуоресцентные и спектрофотометрические методы. Лично автором проведен статистический анализ результатов.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 124 страницах, содержит 33 рисунка и 7 таблиц. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей изложение и обсуждение результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, насчитывающего 151 наименований.
Похожие диссертации на Исследование механизма фотодинамических реакций мероцианина 540 в биологических системах
-
