Биофизические механизмы изменения механических свойств волокон скелетных мышц при опорной разгрузке Огнева, Ирина Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 19

1.1. Механочувствительность клеток 19

1.2. Механические свойства клеток 26

1.2.1. Атомная силовая микроскопия 26

1.2.1.1. Принцип работы атомного силового микроскопа 26

1.2.1.2. Вычисление поперечной жесткости и модуля Юнга образца

по силовым кривым 31

1.2.2. Механические свойства немышечных клеток 34 ;

1.2.3. Механические свойства мышечных волокон 39

1.2.3.1. Поперечная жесткость сарколеммы мышечных волокон 43

1.2.3.2. Поперечная жесткость сократительного аппарата мышечных волокон 45

1.2.3.3. Структурно-функциональная роль белков внесаркомерного цитоскелета

1.3. Роль гравитации как внешнего механического

стимула для волокон скелетных мышц 51

Глава 2. Объект, методы исследования и экспериментальные подходы 61

2.1. Объект исследования 61

2.1.1. Экспериментальные животные 61

2.1.2. Исследуемые мышцы 63

2.2. Методы исследования 64

2.2.1. Атомная силовая микроскопия 64

2.2.2. Флуоресцентная микроскопия 69

2.2.3. Гель-электрофорез с последующим вестерн-блоттингом 72

2.3. Экспериментальные подходы 73

2.3.1. Антиортостатическое вывешивание грызунов 73

2.3.2. Системное введение препарата «Коринфар» 75

2.3.3. Эксперимент «7-суточная «сухая» иммерсия» человека 76

Глава З. Результаты экспериментов 81

3.1. Анализ структуры поверхности волокон камбаловидной мышцы крысы в группе «Контроль» 81

3.2. Динамика изменения массы мышцы, диаметра волокон и водосодержания в условиях опорной разгрузки у крысы

3. Динамика изменения поперечной жесткости разных участков демембранизированных волокон и волокон с проницаемой сарколеммой различных мышц крысы в условиях опорной разгрузки 91

3.3.1. Камбаловидная мышца крысы 91

3.3.2. Икроножная мышца (медиальная головка) крысы 96

3.3.3. Передняя большеберцовая мышца крысы. 99

.4. Динамика изменения массы мышцы, диаметра волокон и водосодержания в условиях опорной разгрузки у монгольской песчанки 102

.5. Динамика изменения поперечной жесткости разных участков демембранизированных волокон и волокон с проницаемой сарколеммой различных мышц монгольской песчанки в условиях опорной разгрузки 104

3.5.1. Камбаловидная мышца монгольской песчанки 104

3.5.2. Икроножная мышца (медиальная головка) монгольской песчанки 108

3.5.3. Передняя большеберцовая мышца монгольской песчанки 111

.6. Динамика изменения диаметра волокон камбаловидной мышцы у человека в условиях опорной разгрузки в эксперименте «7-суточная «сухая» иммерсия» 114

.7. Динамика изменения поперечной жесткости разных участков демембранизированных волокон и волокон с проницаемой сарколеммой камбаловидной мышцы человека в условиях опорной разгрузки в эксперименте «7-суточная «сухая» иммерсия» 115

3.8. Результаты эксперимента с препаратом «Коринфар». Динамика изменения массы мышцы, диаметра волокон и водосодержания в условиях опорной разгрузки крыс в эксперименте с препаратом «Коринфар» 119

3.9. Динамика изменения поперечной жесткости разных участков демембранизированных волокон и волокон с проницаемой сарколеммой различных мышц крысы в условиях опорной разгрузки в эксперименте с препаратом «Коринфар» 121

3.9.1. Камбаловидная мышца крысы в эксперименте с препаратом «Коринфар»... 121

3.9.2. Икроножная мышца (медиальная головка) крысы в эксперименте с препаратом «Коринфар» 125

3.9.3. Передняя большеберцовая мышца крысы в эксперименте с препаратом «Коринфар» 128

3.10. Резюме 131

Глава 4. Математическое моделирование экспериментов по измерению жесткости мышечных волокон 138

4.1. Точное решение задачи Герца для шарового жесткого штампа и трансверсально изотропного несжимаемого полупространства 138

4.2. Строение саркомера и модель его упругих свойств в различных состояниях 141

4.3. Приближенное решение задачи Герца для кантилевера АСМ и мышечного волокна 150

Глава 5. Содержание цитоскелетных белков и ионов кальция в волокнах мышц голени в условиях опорной разгрузки 155

5.1. Динамика изменения содержания десмина в различных мышцах в условиях опорной разгрузки 155

5.2. Динамика изменения содержания альфа-актинина-1 в различных мышцах в условиях опорной разгрузки 160

5.3. Динамика изменения базального содержания ионов кальция в волокнах различных мышц в условиях опорной разгрузки 165

5.4. Сравнение изменений содержания десмина, альфа-актинина-1 и ионов кальция в разных мышцах различных животных и человека в условиях опорной разгрузки 169

Обсуждение 179

Определение локальной поперечной жесткости различных участков мышечного волокна 181

Локальная поперечная жесткость различных участков мышечного волокна в контроле 184

Оценка вклада упругих характеристик различных участков мышечного волокна в измеренную локальную поперечную жесткость с помощью математического моделирования 191

Камбаловидная мышца в условиях опорной разгрузки 196

Быстрые мышцы в условиях опорной разгрузки 210

Резюме результатов эксперимента 223

Эксперимент «7-суточная «сухая» иммерсия» 224

Снижение жесткости волокон с проницаемой сарколеммой и содержание альфа-актинина-1 230

Базальное содержание ионов кальция в мышечных

волокнах 231

Эксперимент с системным введением препарата «Коринфар» 233

Видовые особенности монгольской песчанки 242

Заключение 244

Выводы 253

Список цитируемой литературы

• Атомная силовая микроскопия
• Атомная силовая микроскопия
• Динамика изменения поперечной жесткости разных участков демембранизированных волокон и волокон с проницаемой сарколеммой различных мышц крысы в условиях опорной разгрузки
• Строение саркомера и модель его упругих свойств в различных состояниях

Введение к работе

Актуальность проблемы

Снижение функциональных возможностей мышечной системы в условиях невесомости (Kozlovskaya I. et al., 1988; McDonald K.S., Fitts R.H., 1995; Toursel Th. et al., 2002; Григорьев А.И. и др., 2004) до сих пор является одной из основных медицинских проблем, препятствующих длительному космическому полету. Кроме того, эта же проблема является крайне актуальной и при восстановлении травматологических и неврологических больных. До недавних пор принято было считать, что атрофические изменения, возникающие в мышечной ткани, связаны лишь с ее функциональной разгрузкой как органа (Booth F.W., Kelso J.R., 1973; Desplanches D. et al. 1990; Caiozzo V.J. et al. 1996). Поэтому поиск путей предотвращения негативных последствий микрогравитации для мышц шел в направлении активации сократительной активности. Тем не менее, большинство предложенных методов профилактики атрофических изменений являются паллиативными, поскольку их основная задача заключается не в предотвращении запуска атрофических изменений, а в их компенсации.

В целом, механизм первичного восприятия внешнего механического, в том числе и гравитационного, стимула клетками скелетных мышц (мышечными волокнами) до сих пор остается неясным. Накопленные в мировой литературе данные свидетельствуют о том, что изменения величины и направления вектора силы тяжести оказывают прямое влияние не только на мышечные волокна, но и на клетки других типов, например, на мезенхимальные стволовые клетки и на клетки эндотелия аорты (Rijken P.J. et al., 1992; Infanger M. et al., 2007; Buravkova L.B. et al., 2010), несмотря на малость их размеров. Возможно, механизм, обусловливающий запуск изменений в клетке в ответ на изменение внешних механических условий, может быть универсальным для клеток любого типа и обеспечивается подмембранным цитоскелетом. Однако процессы, обеспечивающие клеточный ответ на внешний механический стимул, изучены недостаточно. Это связано как с экспериментальными трудностями, так и с отсутствием интегративных подходов к исследованию этой проблемы клеточной биофизики.

Особый интерес в связи с этим представляют мышечные клетки, которые специализированы к генерации механического напряжения и противодействию гравитационному полю при поддержании позы. В условиях функциональной нагрузки мышечные клетки находятся в напряженном состоянии, которое отсутствует при опорной разгрузке, частным случаем которой является и гравитационная разгрузка. При этом имеет место и изменение уровня нервной активации. По-видимому, суперпозицией этих двух факторов (изменение механического напряжения и нервно-мышечной активности) в условиях отсутствия функциональной нагрузки определяется адаптационный ответ мышечных клеток, но их вклад, вероятно, различен.

Закономерным следствием изменения внешних механических условий будет изменение механических характеристик клеток, таких как прочность, устойчивость, жесткость. Однако прочность и устойчивость в большей степени характеризуют целостность клетки как физического объекта. Поэтому в биофизических исследованиях механических характеристик клеток принято исследовать именно жесткость. Поскольку мышечные клетки имеют особое строение и доминирующую ось, их обычно называют мышечными волокнами и исследуют продольную жесткость. Но проблема восприятия внешнего механического стимула мышечными волокнами при таком подходе не нашла своего решения, что может быть связано с невозможностью оценить состояние мембраны с кортикальным цитоскелетом (сарколеммы) при продольном нагружении вследствие их малого, по сравнению с сократительным аппаратом, вклада в значение модуля упругости в продольном направлении.

В целом механическое волокно представляет собой трехмерную конструкцию, что дает возможность исследовать его свойства не только в продольном, но и в поперечном направлении, используя для этого атомную силовую микроскопию - АСМ (Nyland L.R., Maughan D.W., 2000; Mathur A.B. et al., 2001; Collinsworth A.M. et al., 2002; Defranchi E. et al., 2005; Akiyama N. et al., 2006). Однако сложная организация мышечного волокна (структурно-функциональное взаимодействие сократительного аппарата, состоящего из саркомеров, и клеточной мембраны вместе с подмембранным кортикальным цитоскелетом - сарколеммы) позволяет предположить, что поперечная жесткость различных участков сарколеммы и сократительного аппарата, а именно, в области Z-диска, М-линии и участка между ними отличаются друг от друга. Более того, в литературе не представлено каких-либо сведений о динамике изменения упругих характеристик мышечных волокон при поперечном нагружении в условиях опорной разгрузки.

Существующие методы анализа результатов измерений поперечной жесткости мышечных волокон с использованием атомной силовой микроскопии сводятся обычно к вычислению обобщенного модуля упругости с применением решения различных модификаций контактной задачи Герца для изотропных тел (Weisenhorn A.L. et al., 1993; Radmacher M. et al., 1996; Shin D., Athanasiou K., 1999; Mathur A.B. et al., 2001; Collinsworth A.M. et al., 2002). Однако подобный подход не дает информации о вкладе модулей упругости различных участков волокна в интегральные механические характеристики. Разработка адекватной математической методики анализа результатов экспериментов по определению поперечной жесткости различных участков сократительного аппарата может помочь в выявлении механизмов изменения механических характеристик мышечных волокон в условиях опорной разгрузки.

Сократительный аппарат связан с сарколеммой через целый ряд белков, доминирующим из которых является десмин, относящийся к семейству белков, формирующих промежуточные филаменты (Ervasti J.M., 2003; Capetanaki Y. et al., 2007).

Однако роль десмина в изменениях свойств мышечных волокон в условиях гравитационной разгрузки практически не изучена. Кроме того, поскольку в сарколемме отсутствуют активные сократительные элементы, ее поперечная жесткость в расслабленном волокне отражает состояние структуры кортикального цитоскелета, что особенно интересно в условиях опорной разгрузки. Одним из ключевых белков, обеспечивающих структурную целостность подмембранного цитоскелета, является альфа-актинин-1. Исследование динамики изменения содержания этого белка в мышечных волокнах в условиях отсутствия опоры представляет интерес в связи с имеющимися в литературе данными об увеличении базального содержания Са²⁺ в волокнах камбаловидной мышцы в условиях функциональной разгрузки (Ingalls C.P. et al., 1999, 2001; Пономарева Е.В. и др., 2008). Более того, ничего не известно о динамике базального содержания Са²+ в других мышцах, чей уровень нервной активации при отсутствии опоры либо не меняется, либо даже увеличивается.

Таким образом, проведение эксперимента, направленного на определение поперечной жесткости волокна различных мышц, разработка методики математического анализа, позволяющего вычислить модуль Юнга различных участков, оценка вклада внесаркомерных цитоскелетных белков в состояние структуры и анализ содержания ионов кальция как одного из вторичных посредников могли бы помочь в поиске универсальных механизмов механорецепции.

Целью данной работы являлось определение биофизических механизмов изменения механических свойств волокон скелетных мышц при опорной разгрузке. Для достижения этой цели был поставлен ряд следующих конкретных задач:

1. Разработать методику экспериментального определения локальной поперечной жесткости различных участков мышечного волокна.

2. Разработать методику математического анализа, позволяющую определить вклад упругих характеристик различных участков мышечного волокна в измеренную локальную поперечную жесткость.

3. Экспериментально определить динамику изменения поперечной жесткости волокон различных мышц в ходе опорной разгрузки.

4. Определить динамику изменения содержания десмина в волокнах различных мышц в ходе опорной разгрузки.

5. Определить динамику изменения содержания немышечной изоформы альфа-актинина-1 в волокнах различных мышц в ходе опорной разгрузки.

6. Определить динамику изменения базального содержания ионов кальция в волокнах различных мышц в ходе опорной разгрузки.

Положения, выносимые на защиту 1. На основе атомной силовой микроскопии осуществлено дифференциальное определение локальной поперечной жесткости различных участков сарколеммы и сократительного

аппарата мышечных волокон в расслабленном, активированном кальцием и ригорном состояниях.

6. 1. Разработанная методика математического анализа результатов измерений локальной поперечной жесткости дает возможность оценить, какие именно изменения послужили причиной изменения поперечной жесткости сократительного аппарата в тех или иных условиях (деградация цитоскелетных белков, снижение вероятности образования поперечных мостиков).

   2. Существуют структуры, связывающие М-линию с сарколеммой и формирующие выпуклости поверхности, аналогичные костамерам Z-диска.

   3. Снижение сократительной активности в условиях функциональной разгрузки приводит к снижению содержания десмина и уменьшению поперечной жесткости сократительного аппарата, в то время как увеличение сократительной активности приводит к поддержанию его структуры.

   4. В условиях опорной разгрузки поперечная жесткость сарколеммы снижается вне зависимости от типа мышцы и ее сократительной активности; при этом содержание альфа-актинина-1 и базальный уровень ионов кальция в цитоплазме волокон различных мышц увеличиваются.

   Научная новизна исследования Впервые получены следующие результаты.

   6. 4. 1. На основании атомной силовой микроскопии разработан способ определения локальной поперечной жесткости мышечных волокон, защищенный патентом РФ. Экспериментально определена поперечная жесткость различных участков сарколеммы и сократительного аппарата мышечных волокон в расслабленном, активированном кальцием и ригорном состояниях в контрольных условиях и в динамике опорной разгрузки у крысы, монгольской песчанки и человека.

         2. Разработана методика математического анализа данных атомной силовой микроскопии, позволяющая оценить, изменение каких именно свойств мышечного волокна приводит к изменению локальной поперечной жесткости различных участков сократительного аппарата.

         3. Экспериментально определена динамика изменения содержания десмина в камбаловидной, медиальной головке икроножной и передней большеберцовой мышцах на различных сроках опорной разгрузки у крысы, монгольской песчанки и человека.

         4. Показано, что имеет место изменение содержания альфа-актинина-1 в камбаловидной, медиальной головке икроножной и передней большеберцовой мышцах на различных сроках опорной разгрузки у крысы, монгольской песчанки и человека.

         5. Показано увеличение базального содержания кальция через сутки опорной разгрузки, причем вне зависимости от типа мышцы и ее активности.

         Научная и практическая значимость исследования

         Полученные в работе результаты имеют принципиальное значение для понимания механизмов восприятия внешнего механического стимула клетками скелетных мышц.

         Новые экспериментальные данные о механических характеристиках мышечных волокон в условиях опорной разгрузки, содержании цитоскелетных белков и ионов кальция дают возможность сформировать новый подход к фундаментальной проблеме механочувствительности мышечных клеток.

         Разработанный интегративный подход, включающий в себя экспериментальный способ оценки механических характеристик мышечного волокна и методику математического анализа результатов измерений, позволяет получать информацию о состоянии разных внутриклеточных структур при экстремальных и патологических состояниях.

         Результаты исследования могут помочь в раскрытии механизмов патогенеза различных нервно-мышечных заболеваний. Кроме того, они могут способствовать поиску путей предотвращения развития гипогравитационного синдрома, сохранению работоспособности мышц после длительных космических полетов.

         Апробация работы

         Основные материалы диссертационной работы были представлены на I Международной конференции «Математическая биология и биоинформатика» (Пущино, Россия, 2006), на международном симпозиуме «Biological motility: achievements and perspectives» (Пущино, Россия, 2008), на 37-й Европейской мышечной конференции (Оксфорд, Великобритания, 2008), на конференции «Научное наследие академика Л.А. Орбели. Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиология экстремальных состояний», (Санкт-Петербург, Россия, 2008), на V, VI Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности «Системные и клеточные механизмы в физиологии двигательной системы», (Москва, Россия, 2009, 2011), на рабочих совещаниях «Биомеханика 2009», «Биомеханика 2011 » (Санкт-Петербург, Россия, 2009, 2011 ), на международном симпозиуме «30^th Annual International Gravitational Meeting» (Сиань, Китай, 2009), на международном симпозиуме «17^th IAA Humans in Space Symposium» (Москва, Россия, 2009), на 38-й Европейской мышечной конференции (Лилль, Франция, 2009), на международном симпозиуме «Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies» (Пущино, Россия, 2010), на международном симпозиуме «31^th Annual International Gravitational Meeting» (Триест, Италия, 2010), на 39-й Европейской мышечной конференции (Падуя, Италия, 2010), на XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, Россия, 2010).

         Публикации

         По теме диссертации опубликовано 45 работ, среди которых 1 патент, получивший бронзовую медаль на 37-ом Международном салоне изобретений, новой техники и технологий (Женева, Швейцария, 2009), 18 статей в отечественных и международных рецензируемых журналах (в том числе 12 публикаций в отечественных журналах из «Перечня ведущих рецензируемых научных журналов и изданий» ВАК и 5 публикаций в международных журналах из Перечня ВАК), а также тезисы докладов в материалах отечественных и международных конференций.

         Исследования, проведенные в рамках диссертационной работы, поддержаны программой фундаментальных исследований ГНЦ РФ - ИМБП РАН, рядом грантов РФФИ, в том числе грантом 10-04-00106-а, грантами Отделения биологических наук РАН, Целевой программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальная наука - медицине», государственными контрактами с Роскосмосом и ЦСКБ «Прогресс».

         Благодарности. Автор выражает огромную благодарность научному консультанту д.ф.-м.н. Андрею Кимовичу Цатуряну; сотрудникам лаборатории миологии ГНЦ РФ - ИМБП РАН и особенно Э.Г. Алтаевой, Е.В. Пономаревой, В.А. Курушину; сотрудникам ОМРБ ПИЯФ и особенно В.В. Исаеву-Иванову, Д.В. Лебедеву.

         Объем и структура диссертации

         Атомная силовая микроскопия

         Однако для того, чтобы эти конформационные изменения были значимыми необходимо, чтобы они превышали уровень теплового шума; кТ составляет приблизительно 4 пНнм, сравнивая с характерными деформациями на уровне 1 — 10 нм, сила должна быть не меньше, чем 4 пН. Это сравнимо с величиной силы, генерируемой одной миозиновой головкой при мышечном сокращении (Finer J.T. et al., 1994), что повышает уверенность в правильности сделанных оценок Н. Huang et al. (2004).

         К настоящему времени уже вполне ясно, что клетки могут трансдуцировать внешнее механическое воздействие, используя различные механизмы, в частности, механочувствительные ионные каналы.

         Одним из наиболее хорошо . охарактеризованных механочувствительных каналов является бактериальный MscL, представляющий собой пору большого диаметра с низкой ионной селективностью. Этот канал обладает крайне высокой проводимостью — около 103 пСм (Hamill О.Р., Martinac В., 2001) и может регулироваться натяжением мембраны, что было продемонстрировано в экспериментах использованием патч-кламп. Увеличение натяжения мембраны, контролируемое путем варьирования глубины всасывания в пипетку, вызывает увеличение проводимости канала, в случае, когда силы, действующие на канал превышают определенную величину (Hamill О.P., Martinac В., 2001). Авторы показали, что напряжение в этом случае составляет 10""Па м, то есть чуть ниже, чем напряжения, приводящие к разрыву (6 10"" Па м), что может иметь большое физиологическое значение, например, при разбухании бактериальной клетки вследствие осмотического шока. Результаты молекулярно-динамического моделирования (Chang G. et al., 1998), основанного на данных о кристаллической структуре MscL, показывают, что подобные изменения натяжения мембраны приведут к формированию поры диаметром, примерно, 0,5 нм (Gullingsrud J. et al., 2001). В то же время, эксперименты in vitro показывают, что диаметр открытой поры составляет 3 — 4 нм (Perozo Е. et al., 2002), хотя остается вопрос об адекватности результатов подобного рода экспериментов ситуации in vivo.

         В других случаях механизм не столь очевиден, например регуляция входящего кальциевого тока в стереоцилиях волосковых клеток внутреннего уха. До сих пор не вполне ясно, каким образом напряжение на кончике реснички передается к ионному каналу: через внеклеточные взаимодействия или через внутриклеточный цитоскелет (Hamill О.Р.,-Martinac В., 2001). В случае эндотелиальных клеток было показано, что механочувствительные ионные каналы могут обусловливать изменения внутриклеточных концентраций ионов (Malek A.M., Izumo S., 1996), но остается непонятным каким образом эти каналы активируются.

         Таким образом, можно сказать, что конформационные изменения различных белков могут претендовать на роль механосенсора, но прямых доказательств этого практически нет. Хотя, существует как минимум один пример того, что биохимическая реакция обусловлена конформационными изменениями белков. Как обсуждалось выше, свернутые домены фибронектина могут быть выявлены при действии растягивающей молекулу силы, ведя к формированию фибрилл. Этот процесс исследовался экспериментально и методами динамического молекулярного моделирования (Craig D. et al., 2001; Gao M. et al., 2002) и, как результат, было показано, что сила 3—5 пН достаточная для разворачивания доменов и последующая сила величиной 5 пН может привести к удлинению молекулы в пять раз по сравнению с исходной длиной (Vogel V. et al., 2001; Gao M. et al., 2002). Эти уровни силы сравнимы с теми, которые, согласно оценкам, могут инициировать механотрансдукцию.

         Гораздо меньше известно о различных внутриклеточных белках (например, киназы Src-семейства, винкулин, niDia, ROCK), которые также могут быть своеобразным «молекулярным переключателем», претерпевая конформационные изменения в ответ на внешнюю силу (Geiger В. et al., 2001). По сути, любой белок, участвующий в механотрансдукции от внеклеточных контактов внутрь клетки может быть механосенсором и стимулировать разворачивание обеих изоформ интегринов (Chicurel М.Е. et al., 1998) и ассоциированных с ними белков (Zhong .С. et al., 1998). Белки фокально-адгезивного комплекса также выступают в роли преимущественных кандидатов на роль механосенсора. Это становится особенно явным в; свете полученных экспериментальных данных, показывающих, что растяжение обработанных детергентом клеток (для удаления клеточной мембраны) на податливом субстрате может приводить к усилению связи между фокально-адгезивной киназой и паксиллином в области фокальной адгезии (Sawada Y., Sheetz М.Р., 2002). Поскольку клеточная мембрана была удалена в этих экспериментах, то ионные каналы не участвовали в формировании подобного ответа.

         Атомная силовая микроскопия

         В качестве специфического ингибитора кальциевых каналов L-типа использовали производное 1,4-дигидропиридина — нифедипин в виде препарата «Коринфар». Нифедипин оказывает антиангинальное и гипотензивное действие. Уменьшает ток внеклеточного кальция внутрь кардиомиоцитов и гладкомышечных клеток коронарных и периферических артерий; в высоких дозах ингибирует высвобождение ионов кальция из внутриклеточных депо. В терапевтических дозах нормализует трансмембранный ток ионов кальция, нарушенный при ряде патологических состояний, прежде всего при артериальной гипертензии. Время наступления клинического эффекта — 20 минут и его длительность — 4-6 часов. Кумулятивный эффект отсутствует.

         Препарат давали с водой в дозировке 10 мг в сутки на 1 кг веса животного. Введение препарата начинали за десять дней до эксперимента. Далее животные были разделены на три группы (таблица 2): «Контроль+нифедипин», вывешивание на фоне нифедипина «l-HS+нифедипин» и «З-НБ+нифедипин». В каждой группе было по 8 животных.

         Во всех экспериментах с животными каждую из исследуемых мышц вырезали от сухожилия до сухожилия, взвешивали и в зависимости от серии помещали либо в раствор (в расслабляющий для последующего измерения поперечной жесткости.методом АСМ или в раствор Рингера для теплокровных для определения базального содержания ионов кальция с помощью флуоресцентной микроскопии), либо немедленно замораживали при температуре жидкого азота для анализа содержания белков.

         Все процедуры с животными были одобрены комиссией по биомедицинской этике Государственного научного центра Российской Федерации Института медико-биологических проблем Российской академии наук. Процедуры экстирпации осуществляли под действием нембутала (в дозировке 10 мг/кг веса тела животного),. а также усыпление животных путем его передозировки (100 мг/кг веса тела животного).

         Эксперимент проводился в ТНЦ РФ - ИМБП РАН в 2008 году под руководством члена-корреспондента РАН И.Б. Козловской.

         Исследования проводили с участием здоровых добровольцев-мужчин в возрасте 20-30 лет с массой тела 60 — 80 кг (12 человек) с одновременным тестированием одного человека. В течение 7 суток перед воздействием и 7 суток после него осуществляли экспериментальные исследования и медицинский контроль. Испытуемый в течение 7 суток находился в условиях «сухой» иммерсии. Температуру водной среды поддерживали постоянной на уровне 33 С. Испытуемый был отделен от воды водонепроницаемой пленкой. Каждый вечер испытуемый поднимался из ванны на 15 минут для гигиенических процедур. Дежурная бригада, состоящая из врача, лаборанта и техника или инженера, обеспечивала трехразовое питание, а также круглосуточный контроль состояния испытуемых. В свободное от процедур и экспериментов время испытуемые имели возможность заниматься чтением, работать на портативном компьютере, смотреть телевизор, разговаривать по телефону и т.д.

         Испытуемые были разделены на 3 группы (рис. 18). 1). «7-HS (иммерсия)» — группа, находящаяся в условиях «чистой» иммерсии. 2). «7-HS+KOP» — иммерсионного воздействия вместе с применением компенсатора опорной разгрузки (совместная разработка Института медико-биологических проблем РАН и ООО «Звезда»), который использовали для стимуляции опорных зон- стоп. Действующим фактором КОР являются импульсы давления на тело, равные 0,20+0,15 кг/см", в зонах скопления телец Фатер-Пачини. В комплект КОР входили пневмостельки, размещенные в фиксирующей обуви, которые и передают импульсы давления на тело. В иммерсии стимуляцию производили 6 раз по 20 мин в начале каждого часа в режимах: 10 мин стимуляции в режиме медленной ходьбы (75 шаг/мин) и 10 мин стимуляции в режиме быстрой ходьбы (120 шаг/мин) в течение 6 часов в дневное время суток. 3). «7-HS+3C» — иммерсионного воздействия с применением высокочастотной электромиостимуляции. Тренировочная программа состоит из изотонических сокращений четырехглавой мышцы бедра (ЧБМ), трехглавой мышцы голени (ТМГ) и передней болынеберцовой мышцы (ПБМ) в ответ на прямое электрическое раздражение. Макет стимулятора представляет собой источник переменного синусоидального тока звуковой (несущей) частоты 2000 Гц, заполняющего прямоугольные импульсы с частотой 50 Гц (полная амплитуда модуляции) длительностью 10 мс.

         Динамика изменения поперечной жесткости разных участков демембранизированных волокон и волокон с проницаемой сарколеммой различных мышц крысы в условиях опорной разгрузки

         Волокна с проницаемой сарколеммой Поперечная жесткость различных участков проницаемых волокон (таблица 16) камбал ОБИДНОЙ мышцы монгольской песчанки изменялась гораздо раньше, чем поперечная жесткость сократительного аппарата — уже через сутки опорной разгрузки. Кроме того, если для контрольной группы после первых суток вывешивания сохранялся эффект увеличения жесткости волокон при активации сокращения в области проекции Z-диска и М-линии, то далее, с увеличением длительности гипокинезии эта тенденция не проявлялась.

         Изменения поперечной жесткости различных участков сократительного аппарата волокон икроножной мышцы монгольской песчанки (таблица 17) были аналогичны таковым у крысы, но значительно менее выражены, хотя и достоверны. Так, увеличение жесткости сократительного аппарата между Z-диском и М-линией происходило через сутки опорной разгрузки, как и у крысы. Однако возвращение значения этого параметра к уровню контроля у крысы наблюдалось к седьмым суткам вывешивания, а у песчанки — к третьим. Увеличение жесткости Z-диска и М-линии тоже было достоверным лишь в первые сутки гипокинезии, а к третьим суткам уровень поперечной жесткости не отличался от контроля. Волокна с проницаемой сарколеммой

         Поперечная жесткость проницаемого волокна в области между проекциями Z-диска и М-линии снижалась относительно уровня контроля только в первые сутки разгрузки, но далее не отличалась от контрольных значений (таблица 18). В проекции Z-диска у монгольской песчанки в отличие от крысы наблюдалось увеличение поперечной жесткости с первых по седьмые сутки разгрузки. При этом в области М-линии заметных изменений не отмечалось ни на каких сроках вывешивания. Кроме того, поперечная жесткость проницаемого волокна в области проекции Z-диска достоверно увеличивалась при активации по сравнению с расслабленным состоянием в течение всего изученного периода разгрузки, а после семи суток вывешивания наблюдалась разница и между активированным и ригорным состояниями.

         Демембранизированные волокна Таблица 19. Поперечная жесткость (в пН/нм) различных участков демембранизированных волокон передней большеберцовой мышцы монгольской песчанки в расслабленном, активированном кальцием (рСа=4,2) и ригор-состояниях на разных сроках опорной разгрузки.

         Уровень значений поперечной жесткости различных участков сократительного аппарата волокон передней болыпеберцовой мышцы монгольской песчанки (таблица 19) практически не отличался от такового у крысы (таблица 10). При этом изменения жесткости, появлявшиеся в ходе опорной разгрузки, были, как и для камбаловидной мышцы, для медиальной головки икроножной мышцы не столь явно выражены и быстрее нивелировались. Увеличение жесткости сократительного аппарата между Z-диском и М-линией, наблюдаемое через сутки опорной разгрузки, начинало уменьшаться к третьим суткам и значения рассматриваемого параметра не отличались от контрольных значений через двенадцать суток вывешивания. Аналогичные отличия в динамике разгрузки наблюдались и в области Z-диска, однако здесь поперечная жесткость отличалась от группы контроля только в расслабленном состоянии, в то время как при активации сокращения и в ригоре достоверных отличий от контрольных значений в аналогичных состояниях не было обнаружено. Поперечная жесткость в области М-линии в отличие от середины полусаркомера и Z-диска увеличивалась относительно контроля через сутки опорной разгрузки, а уже через трое суток отличий не было выявлено.

         Волокна с проницаемой сарколеммой Поперечная жесткость проницаемых волокон (таблица 20) в группе «Контроль» менялась аналогично изменениям жесткости демембранизированных волокон в той же группе.

         Поперечная жесткость (в пН/нм) различных участков глицеринизированных волокон передней большеберцовой мышцы монгольской песчанки в расслабленном, активированном кальцием (рСа=4,2) и ригор-состояниях на разных сроках опорной разгрузки.

         Однако изменений поперечной жесткости волокна между проекциями Z-диска и М-линии при активации сокращения как в контрольной группе, так и в ходе опорной разгрузки не наблюдается. В то же время, поперечная жесткость проницаемого волокна в проекции Z-диска и М-линии увеличивалась при активации сокращения и в состоянии ригора по сравнению с активированным состоянием.

         Динамика изменения поперечной жесткости различных участков волокна с проницаемой сарколеммой в ходе опорной разгрузки была различной. Так, в области между Z-диском и М-линией имело место снижение жесткости уже через одни и трое суток опорной разгрузки, в области проекции М-линии — повышение наблюдали через сутки и лишь в расслабленном состоянии. В области проекции Z-диска поперечная жесткость была увеличена относительно контроля через сутки и оставалась повышенной вплоть до седьмых суток вывешивания;

         Демембранизироеанные волокна Поперечная жесткость различных участков сократительного аппарата волокон камбаловидной мышцы человека (таблица 22) менялась сходным с крысой образом. Через семь суток функциональной разгрузки имело место согласованное снижение жесткости всех участков демембранизированных волокон более чем в три раза; при этом сохранялась динамика увеличения жесткости при активации сокращения и в ригоре.

         Применение компенсатора опорной разгрузки приводило к своеобразному, хотя и не универсальному эффекту поддержания жесткости различных участков сократительного аппарата. Так, жесткость сократительного аппарата между Z-диском и М-линией оставалась на уровне фоновых значений, как в расслабленном, так и в активированном состоянии и была несколько снижена в ригоре. Жесткость М-линии не отличалась от контрольных значений ни в одном из рассмотренных состояний. Жесткость Z-диска в активированном состоянии не отличалась от ее значения в контроле, а в расслабленном и в ригорном состояниях была снижена, но, тем не менее, достоверно превышала ее значения в группе «7-HS (иммерсия)».

         В группе, где в качестве протекторного воздействия использовали электростимуляцию, значения поперечной жесткости различных участков сократительного аппарата занимали промежуточное положение между значениями для группы «чистой иммерсии» и фоновыми значениями, отражая те же тенденции к увеличению жесткости при активации сокращения и в ригоре (за исключением жесткости М-линии в активированном состоянии).

         Волокна с проницаемой сарколеммой Поперечная жесткость проницаемых волокон между проекциями Z-диска и М-линии у человека существенно выше, нежели у крысы. Через семь суток опорной разгрузки в иммерсионной ванне жесткость всех участков волокон с проницаемой сарколеммой в расслабленном, активированном и ригорном состояниях падала более чем в три раза (таблица 23).

         Строение саркомера и модель его упругих свойств в различных состояниях

         Полученные значения модуля Юнга расслабленного глицеринизированного волокна камбаловидной мышцы крысы на уровне 22±3 кПа для участка волокна между проекциями Z-диска и М-линии корреспондировали с данными, представленными в литературе: 61±5 кПа для волокон мышей линии CD1 (Defranchi Е. et al., 2005) и 24,7±3,5 кПа для С2С12 миобластов взрослых мышей линии СЗН (Mathur А.В. et al., 2001), хотя в указанных источниках авторы не дифференцировали различные участки волокна. A.M. Collinsworth et al. (2002) изучали механические характеристики мышечных клеток на различных стадиях дифференцировки: от миоцитов до мышечных волокон и обнаружили существенное увеличение модуля Юнга на 8-ой день после начала дифференцировки. Так, для недифференцированных миобластов модуль упругости составляет Е=11,5±1,3 кПа, а на 8-10-ый день дифференцировки -Е=45,3±4,0 кПа. При этом, вязкость, которую оценивали по гистерезису, формируемому при прямом и обратном ходе кантилевера при снятии силовых кривых, не менялась в ходе дифференцировки. Предположение авторов о связи изменения модуля упругости и формированием тубулиновых микротрубочек не нашло подтверждения в экспериментах, поскольку после обработки колхицином (в концентрации 0,4 мкг/мл в течение 2-х часов) или таксолом (10 мкМ в течение 2-х часов) модуль Юнга и вязкость мышечных клеток не изменились. Поскольку и колхицин, и таксол являются агентами, разрушающими тубулиновый цитоскелет, то можно заключить, что он не вносит решающий вклад в жесткость клеток. Однако обработка цитохалазином D (в концентрации 3-мкМ в течение 5-30 минут) или блеббистатином (в концентрации 50 мкМ в течение 5-30 минут) приводила к существенному снижению модуля упругости, не изменяя при этом вязкостные свойства. Цитохалазин D является метаболитом плесневых грибов (Tanenbaum S.E. et al., 1978), который блокирует рост актиновых нитей, связываясь с их быстро растущим концом (Maclean-Fletcher S., Pollard T.D., 1980; Brown S.S., Spudich J.A., 1982; Bonder E.M., Mooseker M.S., 1986) и может разрезать уже собранные актиновые филаменты, обладая наибольшей активностью среди этого семейства препаратов (Urbanic Е., Ware B.R., 1989). Блеббистатин является низкомолекулярным соединением, специфически ингибирующим активность миозина II типа (Kovacs М. et al., 2004). В связи с этим, авторы связывали изменение упругих характеристик мышечных клеток в ходе дифференцировки с развитием актин-миозиновой системы. Следует отметить, что A.M. Collinsworth et al. (2002) не анализировали вклад белков внесаркомерного цитоскелета в поперечную жесткость мышечных волокон, хотя обработка цитохалазином D могла привести к разрушению и кортикального слоя актиновых филаментов.

         Такое предположение согласуется с данными K.D. Costa et al. (2006), которые исследовали механические характеристики клеток эндотелия аорты человека (НАЕС). Измерения проводили в контактном режиме в жидкости, глубина продавливания составляла 200 нм. Авторы обнаружили два типа клеток, различающихся по своему модулю Юнга: одни имели1 модуль упругости 5,6±3,5 кПа, а другие — 1,5±0,76 кПа. Однако после обработки цитохалазином В (в концентрации. 4 мкМ) различий в механических характеристиках клеток обнаружено не было и их модуль Юнга составлял 0,89±0,46 кПа, то есть достоверно ниже, чем до обработки актин-разрушающим агентом. Следовательно, представленные этой группой исследователей данные вполне согласуются с данными А.В. Mathur et al. (2001), которые также исследовали клетки эндотелия, но только пупочной вены, а не аорты человека. Эти-авторы также показали, что в данном случае механические свойства немышечных клеток определяются подмембранным кортикальным цитоскелетом.

         Таким образом, опираясь на разработанный метод, нам удалось дифференцированно определить локальную поперечную жесткость различных участков демембранизированных волокон и волокон с проницаемой сарколеммой в различных состояниях. Мы показали, что жесткость демембранизированного волокна в области середины полусаркомера и М-линии увеличивалась более интенсивно при активации сокращения и переходе в ригорное состояние, чем жесткость Z-диска. Тем не менее, жесткость Z-диска в любом из исследованных состояний превышала жесткость середины полусаркомера и М-линии, что может свидетельствовать о более плотной упаковке белков в этой области саркомера. Однако жесткость различных участков волокон с проницаемой сарколеммой увеличивалась не столь интенсивно при активации сокращения и переходе в ригор. Более заметным этот процесс становился в проекциях Z-диска и М-линии. Учитывая, что именно в этих местах структурная связь между сократительным аппаратом и сарколеммой более выражена (согласно анализу поверхности мышечных волокон), то возможно увеличение жесткости глицеринизированного волокна в данных точках было обусловлено передачей напряжения с сократительного аппарата. Сделанные заключения справедливы как для волокон медленной камбаловидной мышцы, так и для волокон быстрых мышц вне зависимости от вида животного. По-видимому, такое увеличение жесткости сократительного аппарата при активации сокращения и ригоризации волокна было связано с увеличением числа замкнутых мостиков, однако в отсутствие математического метода трактовки экспериментальных результатов не представлялось возможным оценить вклад этого процесса в изменение измеряемой величины.

         Оценка вклада упругих характеристик различных участков мышечного волокна в измеренную локальную поперечную жесткость с помощью математического моделирования Для анализа вклада изменений упругих характеристик каждого участка сократительного аппарата была построена математическая модель, позволяющая трактовать результаты АСМ-измерений.

         Опираясь на результаты М. Ciavarella et al. (2002), показавших, что замена функции Грина к{в) в решении задачи Герца о внедрении жесткого шарового штампа в ортотропное полупространство на ее среднее, «квазиизотропное» значение h0 приводит к незначительным (менее 4%) ошибкам относительно точного решения, мы использовали следующий подход для определения вклада различных упругих модулей в изменение поперечной жесткости. С одной стороны h0 был выражен через упругие модули, а с другой - через измеренную поперечную жесткость. Таким образом, мы получили выражение комбинаций упругих констант через экспериментально найденную жесткость. Ряд сделанных предположений позволил существенно уменьшить число меняющихся параметров, что дало возможность трактовать полученные экспериментальные данные в терминах изменения механических свойств отдельных структур волокна.

         Похожие диссертации на Биофизические механизмы изменения механических свойств волокон скелетных мышц при опорной разгрузке

         

         Закономерности и механизмы изменения кристаллографической текстуры оболочечных труб из сплава Zr-1%Nb при термической ползучестиСое Сан Тху

         Физические механизмы структурных изменений слюд в зависимости от состава и внешних воздействийЛиопо, Валерий Александрович

         Исследование изменений свойств приповерхностныхслоев фосфида индия под действием атомов водорода тепловых энергийГорбенко, Виталий Иванович

         

         Исследования особенностей изменения свойств нефтегазовых сред методом высокочастотной диэлькометрии Шагапова Рида Раисовна

         

         Влияние термообработки на необратимые изменения свойств аморфных магнитных металлических сплавов Докукин Максим Евгеньевич

         

         Изменение свойств структурно-неоднородных материалов под действием импульсов тока большой плотности.Пахомов Александр Борисович

         Изменение свойств монокристаллов Si и Ge и приборов, изготовленных на их основе, под действием импульсов СВЧ поляАбдурахимов, Даврон Ерматович

         

         Закономерности изменения свойств аморфных металлических сплавов на основе Co, Pd, Zr в условиях изохронного отжига и локального лазерного воздействияЯковлев, Алексей Владимирович

         

         Закономерности изменения неупругих свойств сплава Ti49.5Ni50.5 после магнетронного осаждения и ионной модификации покрытий из молибдена и тантала на его поверхностиНейман Алексей Александрович

         

         Изменение механических свойств, состава и структуры нержавеющих сталей после больших доз облучения в исследовательских реакторах Голованов Виктор Николаевич