Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор 11
Антиоксидантные свойства эфирных масел и методы их определения 11
Методы оценки антиоксидантных и антирадикальных свойств ЭМ 13
Ингибирование образования диеновых конъюгатов 18
Ингибирование обесцвечивания В-каротина 19
Оценка ингибирования ПОЛ по содержанию ТБК активных продуктов 20
Ингибирование образования летучих низкомолекулярных продуктов ПОЛ 21
Ингибирование окисления низших альдегидов эфирными маслами 23
Методы исследования антирадикальной активности 25
ГЛАВА II. Материалы и методы исследований 42
2.1.Эфирные масла. Реактивы и стандарты 42
2.2. Лабораторные животные 42
2.3. Газохроматографический (ГЖХ) и хромато-масс-спектрометрический анализ (ГХ-МС) эфирных масел и метиловых эфиров высших жирных кислот 43
2.4. Получение метиловых эфиров жирных кислот 44
2.5. Методика определения антиоксидантных свойств эфирных масел в модельной системе ингибирования автоокисления гексаналя 44
2.6. Методика определения антиоксидантных свойств эфирных масел по степени ингибирования обесцвечивания (3-каротина 45
2.7. Методика определения антиоксидантных свойств эфирных масел по степени ингибирования образования диеновых конъюгатов в модельной системе автоокисления метиллинолеата 45
2.8. Методика определения антирадикальных свойств эфирных масел по реакции восстановления дифенилпикрилгидразил радикала 46
2.9. Методика определения степени спонтанного гемолиза эритроцитов 47
2.10. Методики определения интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ)
в биологических образцах по содержанию ТБК-АП продуктов 48
Определение содержания ТБК-АП в мембранах эритроцитов 48
Определение содержания ТБК-АП в гомогенатах тканей печени и мозга 49
2.11. Методики определения микровязкости липидных слоев мембран эритроцитов методом ЭПР-спектроскопии 50
2.12. Определение активности ферментов антиоксидантной защиты в гомогенате печени мышей 52
Методика определения активности супероксиддисмутазы (СОД) 52
Методика определения активности глутатионпероксидазы (ГП) 54
Методика определения активности глутатион-Б-трансферазы (ГТ) 55
2.13. Определение влияния эфирных масел на состояние иммунной системы 56
2.14. Определение цитотоксичности эфирного масла орегано 57
ГЛАВА III. Результаты и их обсуждение 58
3.1. Изучение антиоксидантних и антирадикальных свойств эфирных масел в модельных системах 58
3.1.1. Изучение антиоксидантных свойств индивидуальных эфирных масел 59
и их смесей в модельных системах 59
3.1.2. Ингибирование окисления природных жирных кислот ЭМ орегано 66
3.1.3. Определение антирадикальных свойств эфирных масел 70
3.2. Биологическое действие эфирных масел. Влияние приема малых доз эфирных масел на биохимические показатели органов мышей 100
3.2.1. Влияние эфирного масла орегано на рост и развитие культуры трансформированных клеток почки китайского хомячка 101
3.2.2. Влияние эфирных масел на биохимические параметры эритроцитов 103
3.2.3. Влияние приема эфирных масел на биохимические показатели печени и мозга мышей 105
3.2.4. Влияние приема эфирных масел на активность антиоксидантных ферментов в печени мышей 107
3.2.5. Влияние приема эфирных масел на состав жирных кислот в липидах печени и мозга мышей 111
3.2.6. Влияние эфирных масел на иммунную реактивность и устойчивость мышей к воздействию ионизирующей радиации 123
Выводы 130
Литература
- Ингибирование образования диеновых конъюгатов
- Методика определения антиоксидантных свойств эфирных масел по степени ингибирования обесцвечивания (3-каротина
- Определение содержания ТБК-АП в мембранах эритроцитов
- Биологическое действие эфирных масел. Влияние приема малых доз эфирных масел на биохимические показатели органов мышей
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из острейших проблем настоящего времени является возрастающее негативное действие вредных факторов окружающей среды, которое приводит к развитию патологических состояний, «омоложению» многих заболеваний, ускорению старения. Большая роль в развитии таких процессов принадлежит активным свободным радикалам, которые есть везде и всегда и их роль в организме чрезвычайно высока. В 50-е годы прошлого столетия была предложена теория свободнорадикального старения, получившая признание и развитие в многочисленных работах зарубежных и отечественных исследователей, в первую очередь Н.М. Эмануэля и его школы [Эмануэль Н.М., 1975]. Эта теория до настоящего времени считается одной из самых перспективных, объясняющей механизмы старения и связанных с ним патологических процессов. Согласно этой теории старение организма вызвано ростом молекулярных повреждений, вызываемых свободными радикалами, а также нарушением функции системы антиоксидантной защиты организма [Бурлакова Е.Б., 2007]. С участием свободных радикалов осуществляется огромное число нужных организму химических превращений, но при их избытке происходит нарушение жизненно необходимых процессов и разрушение важных связей и структур. Радикалы могут изменять свойства биологических мембран, их проницаемость, структуру, влиять на функциональное состояние клеток и поддержание гомеостаза организма в целом. В основе этих нарушений лежат процессы окислительной модификации белков и ДНК, а также перекисного окисления липидов (ПОЛ), которые носят каскадный характер.
Управление окислительно-восстановительными реакциями в организме осуществляется системой антиоксидантной защиты, включающей ферменты, витамины, пептиды и другие эндогенные антиоксиданты. Благодаря таким системам в здоровом организме подавляющее большинство «излишних» свободных радикалов нейтрализуется еще до того, как они успеют повредить те или иные компоненты клетки. Так, из каждого миллиона образующихся супероксидных радикалов от ферментной защиты ускользает не более четырех [Анисимов В.Н., 2003]. Избыточное образование радикалов и снижение активности защитных антиоксидантных систем способствует развитию окислительного стресса. Решением проблемы может быть употребление эффективных и безопасных дополнительных экзогенных антиоксидантов (АО) [Эмануэль Н.М., 1975]. Интересным и перспективным классом природных биологически активных соединений являются эфирные масла (ЭМ) пряно-ароматических растений, употребляемых в пищу. Их безопасность и полезные для здоровья свойства были известны еще с древних времен. В ряде работ было показано, что многие масла содержат АО и способны ингибировать окислительные процессы в модельных системах [Koroch A.R. et al., 2007; Maffei M.E. et al., 2011; Ruberto G. et al., 2000]. Однако выявление реальной антиоксидантной эффективности эфирных масел на основе обобщения имеющихся литературных данных является сложной задачей, так как это свойство зависит от состава модельных систем, от природы субстрата и метода определения. Проведенная в научных кругах в начале 21 века дискуссия не решила проблему стандартизации методов определения АО свойств веществ, но рекомендовано проводить оценку их антиоксидантной эффективности в одних и тех же условиях и несколькими методами [Frankel E.N. et al., 2008; Antolovich M. еt al., 2002]. Поэтому экспериментальное изучение современными методами АО свойств эфирных масел и механизма их действия в модельных системах является актуальной задачей. Крайне важным вопросом является экспериментальная оценка влияния приема эфирных масел на биохимические процессы, протекающие в живых организмах. Таких исследований крайне мало, но только они могут выявить наличие биологической активности у препаратов и их реального влияния на организм. Более того, комплексное изучение свойств эфирных масел в модельных системах и живых организмах позволит выявить связи между составом масел, их антиоксидантными и антирадикальными свойствами, способностью проявлять биологическую активность, оказывать влияние на биохимические процессы в живых организмах, изучить возможные механизмы реализации биологического действия ЭМ, что представляет значительный научно-практический интерес.
Целью исследования являлось изучение антиоксидантных и антирадикальных свойств эфирных масел в модельных системах, определение влияния регулярного длительного приема малых доз эфирных масел на биохимические показатели мышей линии Balb, на их иммунитет, а также изучение механизмов биоантиоксидантного действия эфирных масел.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
-
Определение кинетических параметров реакции компонентов эфирных масел со свободным стабильным радикалом – дифенилпикрилгидразилом.
-
Изучение механизма антирадикального действия эфирного масла и его отдельных компонентов.
-
Сравнение АО свойств композиций ЭМ различного состава в модельных реакциях ингибирования:
-
автоокисления природных полиненасыщенных ЖК;
-
автоокисления гексаналя;
-
обесцвечивания -каротина в системе автоокисления метиллинолеата;
-
образования диеновых конъюгатов.
-
-
Исследование цитотоксичности эфирного масла орегано на культуре трансформированных клеток почки китайского хомячка линии B11-dii FAF28.
-
Изучение влияния эфирных масел при их длительном систематическом приеме в малых дозах мышами линии Balb in vivo на следующие параметры:
-
степень спонтанного гемолиза эритроцитов;
-
микровязкость липидов мембран эритроцитов;
-
интенсивность ПОЛ в эритроцитах и клетках печени и мозга;
-
состав жирных кислот (ЖК) в печени и мозге;
-
активность антиоксидантных ферментов в печени;
-
иммунную реактивность и устойчивость мышей к воздействию ионизирующей радиации.
-
Научная новизна. Впервые в экспериментах in vivo получены данные о действии систематического приема малых доз эфирных масел гвоздики, орегано и смеси масла лимона и экстракта имбиря на биохимические показатели в тканях и органах мышей линии Balb. Установлено, что ЭМ действовали как эффективные биоантиоксиданты: их прием увеличивал устойчивость мембран эритроцитов к гемолизу, снижал интенсивность ПОЛ в мембранах эритроцитов и в тканях печени и мозга мышей, увеличивал активность эндогенных антиоксидантных ферментов в печени мышей. Впервые установлено, что изученные эфирные масла увеличивали устойчивость липидов печени и мозга мышей к окислению. Приоритетными являются исследования, проведенные в области изучения иммуностимулирующих и радиопротекторных свойств ЭМ в экспериментах in vivo. Установлено, что изученные ЭМ незначительно влияли на иммунокомпетентные органы интактных мышей, но проявляли себя как эффективные иммуномодуляторы, поддерживающие иммунный статус мышей при повреждающем действии ионизирующей радиации.
Практическое значение работы. В результате исследований установлены зависимости между составом эфирных масел и их антирадикальным и антиоксидантным действием, эти данные могут быть основой для получения композиций с заранее заданными свойствами. Выявлена прямая корреляция между антирадикальными свойствами ЭМ в модельных экспериментах и их влиянием на биохимические показатели органов мышей, принимавших малые дозы ЭМ. Установлено, что максимальной эффективностью в качестве радиопротектора и активатора ферментного звена антиоксидантной защиты обладало эфирное масло гвоздики, содержавшее около 78% эвгенола. Найдено, что самым эффективным ингибитором перекисного окисления липидов в тканях печени и мозга являлась композиция, содержавшая экстракт имбиря. Проведенное исследование не выявило токсического действия ЭМ при их систематическом приеме в малых дозах с питьевой водой в течение 6 месяцев, это подтверждает безопасность выбранных доз ЭМ и позволяет рассматривать ЭМ, как новый класс перспективных биоантиоксидантов. Данные, полученные при изучении in vivo и in vitro свойств индивидуальных эфирных масел и их композиций различного состава, могут быть использованы при разработке специальных пищевых добавок для профилактики различных патологий, вызываемых окислительным стрессом или вредным воздействием свободных радикалов, а также для увеличения продолжительности жизни. При вдыхании, при нанесении на кожу или при употреблении с водой или едой компоненты эфирных масел попадают в кровь и во внутренние органы, где и проявляют свое благотворное действие, поэтому результаты исследований могут стать научной базой такого эмпирического направления народной медицины как ароматерапия.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Эфирные масла и экстракт имбиря, содержащие фенолы, обладали высокой антирадикальной эффективностью в модельной реакции со свободным радикалом.
2. Прием малых доз эфирных масел снижал интенсивность ПОЛ в органах и тканях мышей и увеличивал активность антиоксидантных ферментов печени.
3. Биоантиоксидантные свойства исследуемых ЭМ in vivo и их антирадикальная эффективность в модельных системах зависели от состава ЭМ.
4. Прием мышами эфирных масел в малых дозах существенно снижал повреждающее действие ионизирующего излучения на иммунную систему.
Апробация работы. Результаты и основные положения диссертации доложены и обсуждены на VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва. 2010); X и ХI Международных ежегодных молодежных конференциях ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва. 2010, 2011); Int. Conference “Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine”. S.Petersburg. 2011); Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва. 2012); VI Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (С-Петербург. 2012); VIII Международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва. 2012); Международной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул. 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология растительного сырья, качество и безопасность продуктов питания» (Иркутск. 2012).
Финансовая поддержка работы. Работа выполнена в ИБХФ РАН рамках планов научно-исследовательских работ Института по теме «Природные и синтетические антиоксиданты. Синтез, кинетические характеристики, механизм действия в системах различной степени сложности, синергизм, специфическая активность, прикладные проблемы. Изучение антиоксидантной активности эфирных масел и ароматизаторов», и при финансовой поддержке ОХНМ Президиума РАН в 2009-2011 гг. «Исследование биологической активности эфирных масел пряно-ароматических растений» и в 2012-2013 гг. «Исследование антирадикальных и антиоксидантных свойств натуральных эфирных масел и экстрактов пряно-ароматических растений, обладающих физиологической активностью».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 работ, 13 статей в журналах и в сборниках научных трудов (из них 8 в изданиях, рекомендованных ВАК), 16 тезисов докладов в сборниках материалов конференций. Получен патент на изобретение № 2475258 от 20.02.13.
Личный вклад автора. Представленные в диссертации экспериментальные данные получены либо лично автором, либо при его непосредственном участии на всех этапах исследований, включая планирование и проведение эксперимента, обработку, оформление и публикацию результатов. Обсуждение, обобщение и интерпретация некоторых экспериментальных данных, формулировка основных положений диссертации, составляющих ее новизну и практическую значимость, проведены в соавторстве с руководителями работы.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 148 страницах печатного текста, содержит 31 рисунок и 15 таблиц. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 210 источников.
Ингибирование образования диеновых конъюгатов
Все существующие и используемые в настоящее время для научных исследований методы определения антиоксидантной способности веществ можно разделить на две группы в соответствии с механизмом реакций. В основе методов первой группы лежат реакции, связанные с переносом атома водорода (ПАВ), второй - реакции с переносом электрона (ПЭ). Энергия диссоциации связи и потенциал ионизации являются двумя основными факторами, определяющими механизм реакций и эффективность антиоксидантов.
К методам, основанным на реакции переноса атома водорода (ПАВ), относятся следующие: ORAC - oxygen radical absorbance capacity (способность абсорбировать кислородные радикалы), TRAP - total radical trapping antioxidant parameter (параметр, отражающий способность антиоксидантов улавливать все радикалы), Crocin bleaching assay (ингибирование обесцвечивания кроцина), IOU - inhibited oxygen uptake (ингибирование поглощения кислорода), Inhibition of linoleic acid oxidation (ингибирование окисления линолевой кислоты), Inhibition of LDL oxidation (ингибирование окисления липопротеинов низкой плотности). Методы, в основе которых лежит перенос электрона (ПЭ): - ТЕ АС - Trolox equivalent antioxidant capacity (параметр, отражающий количество милимолярного раствора тролокса, имеющего ту же «антиоксидантную емкость», что и 1,0 тМ раствор исследуемого вещества), FRAP - ferric ion reducing antioxidant parameter (тест по способности восстанавливать Fe3+), DPPH diphenylpicrylhydrazyl (ДФПГ-тест), Copper (II) reduction capacity ( тест по способности восстанавливать Си +) , Total phenols assay by Folin-Ciocalteu reagent (определение уровня содержания фенольных соединений с помощью реактива Фолина-Чокальтеу). Реже для оценки АО способности используют методы хемолюминисценции и электро-хемолюминисценции. Очень часто реакции протекают по обоим механизмам, и их дифференцирование является сложным и неоднозначным. К примеру, методы с использованием реагента Фолина-Чикалтеу (метод Лоури) или ДФПГ радикала, также оценка антиоксидантной способности с использованием Тролокс - эквивалента (ТЕАС) в одних работах [15, 16] были отнесены к реакциям с механизмом ПЭ, в то время как в работе [17] они классифицировались как реакции с обоими механизмами (ПЭ и ПАВ). Очень часто невозможно объяснить истинный механизм действия антиоксидантов [16].
Большинство синтетических свободных радикалов, такие как 2,2-азобис(2-амидинопропан дихлорид) - ААРН, 2,2-азобис(2-амидинопропан дигидрохлорид) - АВАР, 2,2-азобис(2,4-диметилвалеронитрил) - AMVN, 2,2-азинобис(3-этилбензотиазолин-6 сульфонат) - ABTS, 2 ,7 - дихлорфлюоресцеин диацетат - DCFH-DA взаимодействуют с антиоксидантами по механизму ПАВ. Антиоксиданты - доноры водорода обрывают радикальные цепи путем уничтожения активных кислородных радикалов. Самыми известными антиоксидантами, которые нейтрализуют активные свободные радикалы, являются аскорбиновая кислота, токоферолы, мочевая кислота, глутатион и флавоноиды. Реакции по механизму ПАВ протекают, в основном, быстро (секунды, минуты), в растворах и зависят от рН среды.
Методы, основанные на реакциях с переносом электрона (ПЭ-методы) также зависят от кислотности среды (величин рН) и связаны с процессами депротонирования и с потенциалом ионизации химически активных функциональных групп. Как правило, при возрастании рН происходит депротонирование АО, электронно-донорная способность увеличивается, и потенциал ионизации падает [17]. Реакции по механизму ПЭ довольно медленные и требуют продолжительного времени, поэтому обычно измеряют относительное изменение концентрации радикала, а не кинетику или общую антиоксидантную емкость. ПЭ методы сильнее зависят от растворителя по сравнению с ПАВ, так как растворитель стабилизирует заряженные частицы [18].
Возникает вопрос о том, какой механизм, ПЭ или ПАВ, более полно отражает защитное действие антиоксидантов. В работах [18, 19], описаны методы, основанные на функциональной теории, с помощью которых авторы работ рассчитали энтальпию диссоциации связи в газовой фазе и потенциал ионизации для молекул, принадлежащих к классу фенольных антиоксидантов, в том числе токоферолов, катехинов, аминофенолов, и стильбенов, связанных с ресвератролом. Полученные результаты показали, что в большинстве случаев доминирует механизм ПАВ. Разумеется, реакции с переносом водорода протекают одновременно с ПЭ, но при этом реакции с ПАВ играют преобладающую роль в биологических окислительно-восстановительных реакциях [18].
Для определения способности природных веществ обрывать цепные реакции используют прямые или косвенные методы. Прямые методы основаны на изучении влияния антиоксидантов, содержащихся в исследуемом объекте (например, в пищевом продукте), на окисление тестируемой системы. Субстратом окисления могут быть липиды, липидные смеси (масла), белки, ДНК, плазма крови, липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и биологические мембраны. В зависимости от растворимости образцов используют растворы липидов или микрогетерогенные системы (мицеллы и липосомы).
Прямые методы основаны на кинетических процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ) или нецепных процессах (метод прямой конкуренции). В первом случае, антиоксидантную активность можно тестировать двумя видами ПОЛ: один из них - это авторкисление, когда процесс протекает спонтанно, с самоускорением благодаря накоплению LOOH; другой основывается на кинетической модели управляемой цепной реакции, с использованием термолабильных азосоединений: водорастворимый 2,2-азобис(2-амидинопропан) дихлорид (ААРН) и жирорастворимый 2,2-азобис(2,4-диметилвалеронитрил) (AMVN). Эти соединения разлагаются и продуцируют активные свободные радикалы при умеренной температуре с любой желаемой скоростью, которую можно легко изменять и контролировать [20]. В случаях, когда не применяют подобные термолабильные соединения, для управления содержанием свободных радикалов применяют повышение парциального давление кислорода и температуры, добавление катализаторов с металлами переходной валентности, действуют светом [18].
Самыми популярными методами исследования процесса ПОЛ являются определение концентрации образующихся при окислении ненасыщенных жирных кислот диеновых коньюгатов (поглощение при 234 нм) и определение содержания веществ, образующихся при взаимодействии тиобарбитуровой кислоты с продуктами окислительного расщепления жирных кислот (ТБК-АП) [20]. Существуют и другие методы, включая определение перекисного числа, йодного числа, определение летучих компонентов - продуктов расщепления пероксидов жирных кислот, определение низших жирных кислот [21]. В методах прямой конкуренции природные антиоксиданты конкурируют с эталонным антирадикальным агентом (флуоресцентный природный белок R-фикоэтрин, природный кроцин или флуоресцин) за пероксил-радикалы, которые образуются из добавленных в системы ААРН и AMVA [20]. Еще одним примером прямой конкуренции является метод обесцвечивания (3-каротина в ходе автоокисления линолевой кислоты [22].
Косвенные методы изучают способность антиоксиданта реагировать с некоторыми свободными радикалами, не связанными с реальным окислением [20], такими как 2,2-азинобис(З-этилбензотиазолин-б-сульфонат) (ABTS) или 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил радикал (DPPH), оба имеют различную окраску в зависимости от степени окисления. Другими примерами косвенных методов являются метод FRAP, основанный на восстановлении Fe3+ до Fe + в присутствии 2,4,6-трипиридил-з-триазина, а также методы, основанные на хемилюминесценции люминала в присутствии радикалов [17, 23].
Методика определения антиоксидантных свойств эфирных масел по степени ингибирования обесцвечивания (3-каротина
Степень гемолиза эритроцитов отражает устойчивость их мембран к спонтанному лизису, индуцированному перекисным окислением липидов кислородом воздуха [139]. Определение основано на фотометрическом измерении экстинкции (к = 540 нм) внеэритроцитарного гемоглобина, поступающего в среду [140].
Для этого эритроциты отмывали изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1:4. Смесь центрифугировали в течение 15 минут при 330 g, для исследования брали осадок (эритроциты), из которого готовили 5% эритроцитарную взвесь: к 200 ці полученной эритроцитарной массы добавляли 4 мл трис-HCl буферного раствора с рН 7.4, разведенном в соотношении 1 : 1 физиологическим раствором.
В пробирку отбирали 0,8 мл 5% эритроцитарной взвеси и 0,9 мл буфера, полученную смесь центрифугировали в течение 10 мин при 330 g (1500 об/мин), переносили в кварцевую кювету (1 см) и определяли оптическую плотность супернатанта Методики определения интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических образцах по содержанию ТБК-АП продуктов[141,142]
Общепринятой методикой оценки интенсивности процессов ПОЛ является определение содержания вторичных продуктов свободнорадикального окисления липидов - ТБК-активных соединений (ТБК-АП) [141]. Продукты окисления липидов, в основном малоновый диальдегид, при нагревании дают окрашенные азометиновые комплексы с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) с максимумом поглощения при длине волны 532 нм и их содержание определяют количественно спектрофотометрическим методом. Молярный коэффициент экстинкции комплекса равен 1,56-10 см" М"1 [142]. Этот метод мы использовали для оценки интенсивности ПОЛ в различных образцах тканей органов мышей.
Определение содержания ТБК-АП в мембранах эритроцитов [143,144] Содержание ТБК-АП в эритроцитах определяли в тех же пробах, что и гемолиз. После измерения степени гемолиза эритроцитов супернатант контрольных и опытных образцов возвращали в пробирки с оставшимся после центрифугирования осадком. Затем туда же добавляли 1 мл 20 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), 0,3 мл НС1 (5Н) и 1,2 мл 0,7% -ного раствора ТБК. Пробирки помещали на 30 минут в кипящую водяную баню. После кипячения их охлаждали в холодной воде 3-5 мин, образовавшийся осадок отделяли центрифугированием в течение 30 минут при 330 g. Сразу после центрифугирования отбирали по 2 мл супернатанта в чистую кварцевую кювету ( 1 см) и на спектрофотометре СФ-2000 (ЗАО «ОКБ Спектр») измеряли оптическую плотность опытной пробы против холостой пробы при двух длинах волн: 532 и 570 нм. Содержание ТБК-АП рассчитывали по формуле 2.6:
Математическую обработку результатов осуществляли с помощью программ Microsoft Excel 2007 и Sigma Plot 10. Стандартное отклонение средних величин из 3-х измерений не превышало 5% (относительных). Определение содержания ТБК-АП в гомогенатах тканей печени и мозга [144] Навески тканей свежеполученных или хранившихся при 3-5С в течение 3-7 дней печени (1 г) и мозга (0,5 г) животных контрольной и опытных групп гомогенизировали вручную с 2 мл 10%-ного раствора ТХУ и 0,25 мкл 0,01%-ного раствора дибунола в стеклянном гомогенизаторе стеклянным пестиком. Гомогенаты делили на 2 параллельных образца, каждый центрифугировали в течение 10 мин при 5000 g (8000 об/мин), в чистые пробирки отбирали полученные супернатанты, добавляли к ним по 1,36 мл 0,7%-ного раствора ТБК и фиксировали вес полученных проб. Пробы вьщерживали в кипящей водяной бане в течение 15 мин. После кипячения их охлаждали в холодной воде (3-5 мин), переносили в кварцевые кюветы с толщиной 1 см и измеряли оптическую плотность опытных проб против холостой пробы при двух длинах волн: 532 и 570 нм на спектрофотометре СФ-2000 (ЗАО «ОКБ Спектр»).
В основе метода лежит определение молекулярной подвижности парамагнитных стабильных органических радикалов методом ЭПР спектроскопии. Органические радикалы встраиваются в биомембраны и их молекулярная подвижность изменяется в зависимости от свойств и состава компонентов биомембран. В качестве органических радикалов, которые называют спиновыми зондами, очень часто используют нитроксильные радикалы, которые остаются стабильными в течение длительного времени. Общим структурным элементом нитроксильных радикалов является парамагнитный фрагмент N - О; включённый в большинстве случаев в шести или пятичленный цикл и экранированный четырьмя метальными группами. На рис. 2.1 приведены формулы двух радикалов, 2,2,6,6-тетраметил-4-каприлоилоксилпиперидин-1-оксила (зонд 1) и 5,6-бензо-2,2,6,6-тетраметил-1,2,3,4-тетрагидро-у-карболин-3-оксила (зонд 2), которые были использованы для изучения свойств липидов в мембранах эритроцитов. Эти зонды имеют разную структуру и поэтому его «информативные» парамагнитные группы оказываются либо в липидной, либо в липопротеиновой зоне мембраны [145].
Определение содержания ТБК-АП в мембранах эритроцитов
Из полученных кинетических кривых построены графики зависимости степени восстановления радикала за 30 мин от концентрации масла. Эти графики были линейны, по ним определили концентрацию масла, при которой степень восстановления радикала составляла 50% (ЕС50), полученные величины приведены в табл. 3.5. Порядок величин ЕС50 определяет степень активности масел и как видно, АРА уменьшается в порядке, приведенном на рис.3.9. Так, для эфирного масла гвоздики и душистого перца эти величины бьши 12 и 20 мг/л. Следует отметить, что примерно такие же величины мы получили для стандарта - ионола, а также для олеорезина имбиря и смеси эфирного масла лимона и олеорезина имбиря. Для эфирных масел орегано, тимьяна, чабера и мускатного ореха величины ЕС50 были на порядок больше и составляли около 300 мг/л. В остальных группах эти величины были еще больше, разница в активности всех изученных масел составляла три порядка.
Для кинетических кривых с концентрацией, близкой к ЕС50 мг/л, найдено время, при котором в реакцию вступало 50% радикала, это параметр ТЕС50 а также получены величины антирадикальной эффективности АЕ, все три характеристики приведены в табл.3.5. Величина антирадикальной эффективности АЕ связывает ЕС50 и TECSO И является количественной характеристикой антирадикальной активности препаратов. Как видно из табл.3.5, ЭМ гвоздики и душистого перца, а также олеорезина имбиря, не только не уступают по своей АРА ионолу, но даже превосходят его.
Таким образом, для 13 эфирных масел, олеорезина имбиря, его смеси с эфирным маслом лимона и ионола в модельных системах определены концентрации антиоксиданта и время, необходимые для восстановления 50% радикала, а также величины антирадикальной эффективности АЕ. По этим данным, высокой и очень высокой антирадикальной активностью обладали эфирные масла, в состав которых входили фенолы: эвгенол - эфирные масла гвоздики и душистого перца, карвакрол и тимол - масла орегано, тимьяна, чабера, сафрол и миристицин - эфирное масло мускатного ореха. В олеорезине имбиря и в его смеси с ЭМ лимона антирадикальные свойства обеспечивали гингеролы и гингероны, также фенолсодержащие соединения.
Для определения кинетических характеристик взаимодействия радикала с компонентами эфирных масел мы использовали следующий подход. На рис. 3.10. схематично приведена кинетическая кривая при концентрации ЕС50. Из этой кривой видно, что реакция радикала с эфирным маслом имеет две фазы: первую - быструю, она заканчивается тогда, когда самые активные антирадикальные компоненты практически полностью вступят в реакцию, и вторую медленную. Плавное уменьшение концентрации свободного радикала во второй фазе говорит о наличии в субстрате компонентов с низкой антирадикальной активностью. Если кинетическая кривая выходит на насыщение, это говорит о полном исчезновении антирадикальных веществ и о конце реакции, в этом случае можно рассчитать концентрацию активных соединений в изучаемом образце. Для других кривых, не выходящих на насыщение, концентрация активных антирадикальных веществ в эфирном масле рассчитывается в единицах, эквивалентных концентрации радикала из их кинетической кривой по точке пересечения двух касательных - для быстрой и медленной фазы. Из рис. 3.10. можно увидеть, каким образом проводится расчет. Для этого определяются линейные уравнения 1 и 2 (рис. ЗЛО.).
Графическое определение концентрации антирадикальных компонентов природных экстрактах по кинетической кривой восстановления дифенилпикрилгидразил радикала. Прямая 1 описывается уравнением 1, прямая 2 уравнением 2, точка пересечения 3 прямых 1 и 2 определяет время расходования самых активных АР соединений и время достижения этой фазы реакции
Коэффициент при X в уравнениях - это скорости реакций на первой быстрой и второй медленной стадии. Для изученных нами эфирных масел в системах с концентрацией масел, приведенных в табл.3.5., рассчитаны скорости первой и второй стадий реакции. Оказалось, что скорость второй реакции меньше, чем первой для ионола в 10 раз. Для эфирных масел разница в скорости этих реакций составляет 30-50 раз, для олеорезина имбиря - 70 раз. Медленная вторая стадия реакции для масел и олеорезина продолжается до 5-10 суток, а для ионола она заканчивается через 5 часов. Наличие длительного, то есть пролонгированного антирадикального действия, которое характерно для многих сложных по составу природных экстрактов с антиоксидантнои активностью является с нашей точки зрения огромным достоинством таких препаратов.
Для экспериментального определения общего порядка реакции (п , + п R) строится график зависимости скорости реакции от концентрации восстановленного радикала (рис. 3.11.) и величина & определяется как точка пересечения касательной с осью абсцисс, то есть это предельная концентрация, до которой исследуемый антирадикальный агент способен восстановить ДФПГ, так как скорость реакции в этой точке равна 0.
Концентрация восстановленного ДФПГ,1 10 нМ Рис. 3.11. Зависимость скорости реакции от концентрации восстановленного ДФПГ Для изученных эфирных масел мы получили линейные уравнения зависимости скорости восстановления радикала У от концентрации восстановленного радикала X в системе и в табл. 3.6. приведены коэффициенты уравнения и величины о
Коэффициент А равен скорости начальной стадии реакции самого активного антиоксиданта, содержащегося в эфирном масле с радикалом. В ЭМ гвоздики и душистого перца таким соединением является эвгенол и, как видно из табл. 3.6., величина А для этих ЭМ близка и в 1,6 раза больше, чем для ионола. Немного меньше скорость начальной стадии реакции у олеорезина имбиря. В 5-7 раз меньше, чем у эвгенола скорости реакции карвакрола и тимола в ЭМ чабера, орегано и тимьяна, и миристицина в ЭМ мускатного ореха, их величины/! составляют 35-51, тогда как максимальная величина А для ЭМ гвоздики была 290 (табл. 3.6.).
Биологическое действие эфирных масел. Влияние приема малых доз эфирных масел на биохимические показатели органов мышей
Как видно, прием ЭМ оказывал крайне слабое влияние на соотношение ЖК в печени мышей. Доля насыщенных, моно- и полиненасыщенных жирных кислот в контрольной группе и в группе мышей, принимавших ЭМ лимона с экстрактом имбиря, были практически одинаковы, то есть эта смесь не влияла на метаболизм жирных кислот в печени мышей. ЭМ гвоздики снижало суммарное содержание насыщенных и увеличивало суммарное содержание полиненасыщенных ЖК только на 1,5 %. ЭМ орегано снижало содержание насыщенных и полиненасыщенных и увеличивало содержание мононенасыщенных ЖК, причем за счет увеличения содержания олеиновой кислоты, но все эти различия не превышали 1,5%, то есть были весьма незначительны.
Клетки, которые теряют олеиновую кислоту, прекращают рост, так как они не могут инициировать репликацию ДНК хромосом. Увеличение содержания олеиновой кислоты важно для клеточной пролиферации [198- 201] и говорит об интенсивном росте клеток. Это было отмечено при частичном удалении печени и в процессе ее восстановления. Проведенные нами исследования показали, что ни одно из изученных эфирных масел не оказывало влияния на метаболизм ЖК в печени мышей. Это важно, так как свойства клеточных мембран, например, вязкость, изменяются даже при малом изменении состава жирных кислот и в ряде случаев это может приводить к развитию заболеваний [202-204]. Так, в работе [203] было показано, что снижение уровня линолевой кислоты и увеличение содержания арахидоновой и олеиновой выше нормы в печени крыс свидетельствовало о развитии у этих животных гипертензии.
Таким образом, проведенное исследование показало, что прием эфирных масел практически не влиял на состав жирных кислот в липидах мозга и печени мышей. В то же время, прием эфирных масел с высокой антирадикальной активностью приводил к увеличению устойчивости мембран эритроцитов к механическому гемолизу, снижал интенсивность ПОЛ в мембранах эритроцитов, увеличивал антиоксидантный статус печени, снижал в ней уровень ПОЛ и повышал активность ее эндогенных антиоксидантных ферментов.
Влияние эфирных масел на иммунную реактивность и устойчивость мышей к воздействию ионизирующей радиации В последнее время все большее распространение получает состояние так называемых иммунодефицитов, которое обусловлено техногенным загрязнением окружающей среды, химизацией сельского хозяйства, применением в производстве пищевых продуктов различных пищевых и технологических добавок, широким употреблением фармацевтических препаратов, постоянными стрессами - все это способствует появлению иммунной недостаточности. В этих случаях возникающая разрегуляция функций отдельных звеньев иммунной системы приводит к ослаблению иммунного ответа [205]. Для урегулирования функций иммунной системы применяют иммуномодуляторы, например, некоторые природные антиоксиданты. Так, было показано, что введение экспериментальным животным природных (витамин Е) или синтетических антиоксидантов (ионол, сантохин) сопровождалось стимуляцией гуморального или клеточного иммунитета [206]. Мягким, пролонгированным иммуномодулирующим действием при практически полном отсутствии побочных реакций в диапазоне используемых низких концентраций обладают, согласно исследованиям отечественных ученых [207, 208], некоторые натуральные эфирные масла. Они способны давать положительный эффект при разбалансировке взаимодействия отдельных звеньев иммунной системы. Характер действия растительных ароматов на иммунную систему в целом и на ее отдельные звенья различен. Выраженную иммунологическую активность в отношении Т-звена иммунитета проявляли эфирные масла монарды и лавра; в отношении В-звена - эфирные масла эвкалипта, пихты, аниса, полыни лимонной. Большой интерес как иммуномодуляторы представляют эфирные масла, которые стимулируют как Т-, так и В-лимфоциты. Это - эфирные масла базилика, монарды, жасмина, гвоздики, эвкалипта, шалфея [207, 208].
Мы изучили влияние длительного приема малых доз ЭМ орегано, гвоздики и смеси эфирного масла лимона и экстракта имбиря на иммунную реактивность и устойчивость мышей к воздействию ионизирующей радиации.
Величину гуморального иммунного ответа на тимусзависимый антиген оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей на 4-е сутки после внутрибрюшинной иммунизации их эритроцитами барана в дозе 1-Ю8 клеток в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия [155, 156]. Полученные в контрольных и "опытных" группах результаты выражали в процентах от исходного уровня, принимая величину исследуемых параметров у интактных животных за 100%.
Количество АОК является одним из основных параметров иммунного ответа и по этому параметру можно выявить как иммуносупрессорное так и иммуномодулирующее действие исследуемых препаратов или малых доз облучения. В таблице 3.12. приведены результаты определения массы и клеточности селезенки и тимуса мышей контрольной группы и трех опытных. Как видно, оба показателя были одинаковы для всех групп животных, можно отметить лишь незначительное увеличение массы селезенки у мышей, принимавших ЭМ лимона и имбиря. Оценка иммунологических показателей у мышей по концентрации АОК в селезенке показала, что в группах мышей, получавших эфирные масла орегано и гвоздики, значительных различий в способности к иммунному ответу (АОК в селезенке) на эритроциты барана обнаружено не было. Но в группе мышей, получавшей вместе с питьевой водой ЭМ имбиря и лимона, количество АОК было на 15-20% ниже по сравнению с контролем (Табл. 3.12.). Также стоит отметить, что отсутствие отклонений от нормы по массе и клеточности тимуса свидетельствует о том, длительный прием ЭМ не препятствовал и не изменял естественно протекающие процессы в исследуемом органе.
Во второй серии эксперимента такие же четыре группы мышей были подвергнуты однократному воздействию ионизирующей радиации в сублетальной дозе 1 Гр. В таблице 3.13. приведены результаты определения массы и клеточности тимуса мышей контрольной группы и трех опытных, принимавших эфирные масла с питьевой водой в течение 6 месяцев не облученных и через 3 дня после их облучения. Как видно, и в контрольной, и в опытных группах облучение приводило к снижению массы тимуса в среднем на 8-10%, а также клеточности тимуса в 1,2-1,5 раза и прием ЭМ практически не влиял на этот процесс.
