Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Природные антиоксиданти и здоровье человека 11
2.1.1. Флавоноиды 13
2.1.2. Каротиноиды 28
2.2. Система антиоксидантной защиты организма 32
3. Обоснование целей и выбор методов исследований 43
4. Экспериментальная часть 50
4.1.Материалы и методы исследования 50
4.1.1. Модельные системы окисления 50
4.1.1.1. Свободнорадикальное окисление люминола 50
4.1.1.2. Перекисное окисление липидов микросом 52
4.1.2. Экспериментальные животные 54
4.1.3. Экспериментальные рационы 54
4.1.4. Изучение влияния ликопина и флавоноидов на антиоксидантный статус крыс 56
4.1.4.1. Изучение влияния ликопина на антиоксидантный статус крыс 56
4.1.4.2. Изучение влияния ОПЦ на антиоксидантный статус крыс...56
4.1.4.3. Изучение влияния дигидрокверцетина на антиоксидантный статус крыс 56
4.1.4.4. Изучение влияния силимарина на антиоксидантный статус крыс 57
4.1.5. Изучение влияния ликопина и флавоноидов на защитно-адаптационный потенциал крыс при алиментарных микотоксико-зах 57
4.1.5.1. Изучение влияния ликопина на защитно-адаптационный потенциал крыс при микотоксикозе, вызванном фумонизинами...57
4.1.5.2. Изучение влияния ОПЦ на защитно-адаптационный потенциал крыс при микотоксикозе, вызванном фумонизинами 58
4.1.5.3. Изучение влияния дигидрокверцетина на защитно-адаптационный потенциал крыс при микотоксикозе, вызванном Т-2 токсином 58
4.1.6. Подготовка материала для исследования 59
4.1.7. Биохимические методы исследования 59
4.1.8. Другие методы исследования 64
4.2.Результаты исследований и их обсуждение 65
4.2.1. Оценка антиоксидантной активности ликопина и флавоноидов в модельных системах in vitro 65
4.2.1.1. Оценка антиоксидантной активности ликопина и флавоноидов в системе НЬ-Н202-люминол 65
4.2.1.2. Оценка антиоксидантной активности ликопина и флавоноидов в системе индуцированного перекисного окисления липидов микросом печени крыс 78
4.2.2. Изучение влияния ликопина и флавоноидов на антиоксидантный статус крыс 96
4.2.2.1. Изучение влияния ликопина на антиоксидантный статус крыс 96
4.2.2.2. Изучение влияния ОПЦ на антиоксидантный статус крыс 104
4.2.2.3. Изучение влияния дигидрокверцетина на антиоксидантный статус крыс 109
4.2.2.4. Изучение влияния силимарина на антиоксидантный статус крыс 114
4.2.3. Изучение влияния ликопина и флавоноидов на защитно-адаптационный потенциал крыс при алиментарных микотоксико-зах 119
4.2.3.1. Изучение влияния ликопина на защитно-адаптационный потенциал крыс при микотоксикозе, вызванном фумонизинами.Л 19
4.2.3.2. Изучение влияния ОПЦ на защитно-адаптационный потенциал крыс при микотоксикозе, вызванном фумонизинами 127
4.2.3.3. Изучение влияния дигидрокверцетина на защитно-адаптационный потенциал крыс при микотоксикозе, вызванном Т-2 токсином 133
5. Заключение 141
6. Выводы 148
7. Список цитированной литературы
- Система антиоксидантной защиты организма
- Перекисное окисление липидов микросом
- Другие методы исследования
- Изучение влияния ОПЦ на защитно-адаптационный потенциал крыс при микотоксикозе, вызванном фумонизинами
Введение к работе
Актуальность темы
Воздействие неблагоприятных физических и химических факторов окружающей среды на организм человека часто сопровождается интенсификацией процессов свободно-радикального окисления, и, как следствие, приводит к повреждению белков, липидов, нуклеиновых кислот, других макромолекул и мембранных структур клетки. В защите организма от влияния токсических факторов окружающей среды одно из центральных мест на всех этапах эволюционного развития занимает универсальная антиоксидантная система, существующая во всех типах клеток и представленная ферментативным и неферментативным звеньями. Нарушение работы этой системы сопровождается накоплением экзогенных и эндогенных прооксидантов, что ведет к окислительному повреждению клеточных структур и развитию окислительного стресса [4, 7, 59, 189].
На поддержание активности системы антиоксидантной защиты на адекватном функциональном уровне оказывают влияние различные алиментарные факторы, и, если действие таких пищевых антиоксидантов, как токоферолы, аскорбиновая кислота, /3-каротин и селен изучено достаточно детально, антиоксидантная эффективность многих других минорных компонентов пищи, к числу которых относят индолы, изотиоцианаты, флавоноиды и каротиноиды, требует специальных исследований [9, 12, 41, 52]. Наибольший интерес в этом плане представляют флавоноиды и каротиноиды. Известно, что эти природные соединения играют определенную роль в системе антиоксидантной защиты, благодаря способности служить эффективными перехватчиками радикалов. Помимо этого имеются сведения о способности флавоноидов и каротиноидов оказывать модулирующее действие и на другие звенья этой системы, в частности, индуцировать активность ключевых ферментов антиоксидантной защиты и проявлять сберегающее действие по отношению к витаминам С и Е. Флавоноиды могут выступать и в качестве хелаторов ионов металлов переменной ва лентности, что позволяет им ингибировать процессы ПОЛ на разных стадиях [15,56,79,94, 152,225].
Среди загрязнителей окружающей среды, обладающих прооксидантными свойствами, широкой распространенностью и высокой токсичностью выделяются природные контаминанты пищевых продуктов и кормов - микотоксины, вторичные метаболиты микроскопических (плесневых) грибов [53, 111, 217]. Результаты многолетних наблюдений свидетельствуют, что в России наиболее часто обнаруживаемыми являются микотоксины, продуцируемые грибами рода Fusarium - в том числе трихотеценовые микотоксины и фумонизины [30, 314]. Токсинообразование на различных субстратах в природных условиях - явление мало предсказуемое и полное предотвращение накопления микотоксинов в пищевых продуктах и поступления в организм человека практически невозможно. В связи с этим, важное значение приобретает изыскание путей снижения токсичности, поступивших в организм токсинов. Одним из направлений может выступать пища и ее компоненты в качестве регулятора всех звеньев системы ан-тиоксидантной защиты.
Цель и задачи исследования Цель работы: оценка эффективности природных антиоксидантов в различных системах окисления in vitro и в экспериментах in vivo. Задачи исследования:
На экспериментальных моделях in vitro исследовать влияние природных антиоксидантов - ликопина, дигидрокверцетина, силимарина, силибинина и олигомерных проантоцианидинов на параметры хемилю-минесценции системы НЬ-Н202-люминол и резистентность микросом печени к ПОЛ, индуцированному системой НАДФН-Fe2 ;
Изучить влияние ликопина, олигомерных проантоцианидинов, дигидрокверцетина и силимарина на антиоксидантный статус крыс и резистентность микросом к индуцированному ex vivo ПОЛ;
На моделях алиментарных микотоксикозов (вызванных фу-монизинами и трихотеценовым микотоксином Т-2 токсином) изучить влияние ликопина, олигомерных проантоцианидинов и дигидрокверцети-на на защитно-адаптационный потенциал крыс.
Научная новизна
Получены новые данные о биохимических механизмах регуляции функциональной активности системы антиоксидантной защиты природными биологически активными веществами, такими как ликопин и флавоноиды.
Обнаружено выраженное ингибирующее действие ликопина и флавонои-дов как на свободно-радикальное окисление люминола, так и на уровень индуцированного ПОЛ микросом печени in vitro. При этом на модели НЬ-Н202-люминол наиболее выраженная ингибирующая активность обнаружена у олигомерных проантоцианидинов (ОПЦ), и значительно меньшая - у других анти-оксидантов (катехин дигидрокверцетин силимарин ликопин силибинин). В то же время, на модели ПОЛ микросом, индуцированного системой НАДФН-Fe , ПОЛ ингибировалось в наибольшей степени ликопином, и в меньшей степени флавоноидами (ОПЦ силимарин силибинин дигидрокверцетин).
Показано, что ликопин in vivo оказывает выраженное активирующее действие на систему антиоксидантной защиты крыс, что характеризуется повышением антиоксидантной емкости плазмы (АОЕ) крови, подавлением образования продуктов ПОЛ в печени, увеличением активности глутатионтрансферазы в ци-тозоле печени. Отсутствие при этом изменений активности каталазы, глутати-онпероксидазы и глутатионредуктазы позволяет предположить, что антиокси-дантное действие ликопина связано с его прямым антирадикальным эффектом, а не с влиянием на ключевые ферменты антиоксидантной защиты.
Обнаружено in vivo выраженное активирующее действие флавоноидов на систему антиоксидантной защиты крыс, характеризующееся повышением АОЕ плазмы крови и цитозоля печени.
Впервые показана способность флавоноидов (ОПЦ, дигидрокверцетина и силимарина) при включении в корм крыс, оказывать подавляющее действие на индуцированное ex vivo ПОЛ микросом печени.
В работе дана количественная характеристика антиоксидантной активности отечественных препаратов ликопина и дигидрокверцетина in vitro и получены экспериментальные доказательства их стимулирующего действия на систему антиоксидантной защиты in vivo.
Практическая значимость работы
В работе показана способность каротиноидов (ликопина) и флавоноидов (ОПЦ, дигидрокверцетина) снижать выраженность токсических эффектов приоритетных природных загрязнителей продовольственного сырья и пищевых продуктов, таких как фумонизины и Т-2 токсин.
Полученные данные могут быть использованы при гигиеническом обосновании величин потребности в пищевых биологически активных веществах (ликопине и флавоноидах) и адекватных уровней их поступления с рационом питания.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы доложены на Пленуме Межведомственного Научного Совета по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации «Угрозы здоровью человека: современные гигиенические проблемы и пути их решения» (Москва, 2002 г.), Первом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (г. Москва, 2003 г.), Международной конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (г. Смоленск, 2003 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 3 статьи в научных рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обоснования цели и выбора методов исследования, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, включает 68 таблиц и иллюстрирована 54 рисунками.
Указатель литературы включает 60 отечественных и 280 зарубежных источников.
Система антиоксидантной защиты организма
Кислород является самым широко распространенным химическим элементом биосферы [16] и абсолютно необходим для жизни, участвуя во всех жизненно важных биохимических процессах в организме. Парадоксально, но кислород также участвует во многих токсических реакциях и поэтому представляет постоянную угрозу всему живому. В ходе эволюции у человека выработалась сложная система защиты от такого отрицательного воздействия кислорода. К сожалению, защитные системы организма человека не вполне совершенны; они ограничивают вред, приносимый кислородом, но не исключают его полностью. Многочисленные исследования демонстрируют, что окислительные повреждения тканей организма с годами накапливаются, и зачастую служат прямой причиной старения человеческого организма и многих заболеваний, включая сердечно-сосудистые, онкологические заболевания, катаракту, возрастные иммунологические изменения, а также дегенеративные заболевания нервной системы, к которым в первую очередь относят болезнь Альцгеймера и паркинсонизм [250].
В последние десятилетия был сделан значительный шаг в понимании взаимосвязи между окисленными метаболитами и развитием заболеваний. В то же время, становится все более ясно, что этих явлений можно избежать, задержать или ограничить их развитие путем укрепления антиоксидантных защитных механизмов организма при помощи питания [189].
Считается, что большинство потенциально вредных воздействий кислорода на живую клетку связано с образованием и активностью активированных кислородных метаболитов (АКМ), действующих в качестве оксидантов, то есть веществ, являющихся донорами кислорода другим соединениям. По определению [16], под АКМ понимают высокореакционные, преимущественно радикальные, кислородные соединения, образующиеся в живых организмах в результате неполного восстановления молекулярного кислорода или изменения спина одного из его электронов, находящихся на внешних орбиталях. Генерация АКМ является обязательным атрибутом естественного существования аэробных организмов. Цитотоксический эффект АКМ, образующихся в фагоцитах и Т-киллерах обеспечивает элиминацию патогенных микроорганизмов и собственных дефектных клеток [16, 123, 293; 296]. АКМ могут быть представлены как вещества радикальной и нерадикальной природы, к которым относятся супероксидный анион-радикал О 2, синглетный кислород 0 2, озон 03, гид-роксильный радикал ОН , пергидроксильный радикал Н02 , пероксид водорода Н202, гипогалоиды НОСІ, HOBr, НОІ, пероксильный радикал R02 , алкок-сильный радикал RO , оксид азота NO , алкильный радикал R (рис. 2.7).
Все формы АКМ перманентно синтезируются в организме, являются частью нормальных метаболических процессов и/или возникают вследствие внешних воздействий (таб. 2.2) и обладают большой химической реактивностью. Некоторые типы реакций образования наиболее распространенных АКМ представлены на рис 2.8.
В то же время АКМ, синтезируемые фагоцитами и Т-киллерами, обладают бактерицидным и противоопухолевым действием. Считается, что именно с одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода, продуктом чего является супероксидный анион-радикал, начинаются цепные реакции окисле ния органических молекул. Образование супероксид-анион радикала (О 2) происходит в реакциях, катализируемых НАДФН-оксидазой фагоцитов, ксан-тиноксидазой, митохондриальной цитохром-с-оксидазой и микросомальными монооксигеназами при присоединении одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии. Супероксид-анион радикал имеет среднюю реакционную способность, обладает небольшим периодом полужизни и плохо мигрирует через мембраны, т.к. имеет заряд. В клетках он является промежуточным продуктом многих реакций. В дальнейшем он может взаимодействовать с протоном, что приводит к переходу его в более реакционно-способный пергид-роксильный радикал (НОг ), или гидроксильный радикал (ОН). Пероксид водорода (Н202) считается окислителем средней силы. В эукариотических клетках вырабатывается главным образом при участии ферментов, локализованных в пероксисомах - оксидазами аминокислот, ксантиноксидазой и др. Пероксид водорода выступает в роли источника гидроксильного радикала в реакции Фентона (рис 2.8).
Самым активным среди всех АКМ является гидроксильный радикал (ОН). Его активность такова, что он способен разрывать любую С-С или С-Н связь, поэтому ему отводится главная роль в повреждении биомолекул.
Высокая окислительная способность приписывается также синглетному кислороду (О ), мишенью которого служат в основном соединения, содержащие двойные связи, такие как ПНЖК. Образование синглетного кислорода происходит в фотосенсибилизирующих реакциях с участием каталазы, СОД, в реакциях с участием других АКМ [16].
Образование АКМ в процессе жизнедеятельности организма в норме сбалансировано эндогенными и экзогенными антиоксидантами, участвующими в регуляции степени интенсивности окислительных процессов. Помимо низкомолекулярных антиоксидантов, таких как витамин Е, С, глутатион и др., в организме существует комплекс ферментов антиоксидантной защиты, действие которых, как правило, направлено на трансформацию АКМ в менее активные соединения.
В группу ферментов антиоксидантной защиты входят супероксиддисму-таза (СОД), катализирующая реакцию дисмутации супероксид-анион радикала в пероксид водорода, каталаза, его разлагающая, глутатионпероксидазы (ГП), глутатионтрансферазы (ГТ), инактивирующие органические пероксида [16].
Супероксиддисмутаза в организме представлена 4-мя изоформами (медь-цинковая, марганцевая, железосодержащая и экстрацеллюлярная), функции которых связаны с ускорением дисмутации супероксид-анион радикала в пероксид водорода. Супероксид-анион радикал способен самостоятельно дис-мутировать, однако спонтанный процесс сопровождается параллельным образованием более реакционных радикалов - синглетного кислорода и гидро-ксильного радикала. Поэтому основная роль СОД - ускорение этой реакции, что снижает степень вероятности образования побочных продуктов [16, 127]. Преобразование супероксид-анион радикала в пероксид водорода под действием СОД протекает в 2 этапа:
Перекисное окисление липидов микросом
Для сравнительной оценки антирадикальной активности различных препаратов в данной модельной системе, их сравнивали с антирадикальной активностью аскорбиновой кислоты. Концентрации аскорбиновой кислоты составляли 2, 4, 6, 8, 10, 12мкМ.
Кинетические параметры ХЛ обсчитывали при помощи компьютерной программы «Microsoft Excel 2002». Статистическую обработку получаемых данных производили с использованием программы «Statgraphics ver. 2.7».
Результаты представлены как средние величины, рассчитанные по данным 3-х независимых экспериментов. Микросомы выделяли из печени крыс-самцов Вистар, с массой тела 100-150 г как указано в разделе 4.1.6. ПОЛ мембран микросом индуцировали системой НАДФН-Fe . Окислительную модификацию липидов оценивали по накоплению ТБК-реактивных продуктов ПОЛ и по степени изменения активности ферментов, отличающихся по топологии в мембране эндоплазматического ретикулума (микросом) [71, 256].
Для определения влияния ПОЛ на накопление МДА и активность микро-сомальных ферментов реакционную среду, содержащую 40 мМ ТРИС-НС1 буфер рН 7.4, суспензию микросом в количестве 1 мг белка/мл, НАДФН в концентрации от 0.025 до 2.0 мМ, 12 мкМ Fe(NH4)2 (S04)2 и 0.2 мМ Na4 Р20 7, инкубировали при 37 С в течение 10 мин. при постоянном встряхивании. Реакцию останавливали 30% ТХУ для определения ТБК-реактивных соединений или 5 мМ ЭДТА - для определения активности ферментов.
Для оценки влияния изучаемых соединений на скорость индуцированного ПОЛ, суспензию микросом в 40 мМ ТРИС-НС1 буфере рН 7.4 (1 мг белка/мл) предварительно инкубировали с возрастающими концентрациями указанных ниже препаратов при 37 С в течение 10 мин. при постоянном встряхивании.
Конечные концентрации ликопина составляли 0.25, 0.50, 2.50, 5.00, 10.00, 25.00 мкг/мл (соответственно 0.5, 1, 5, 10, 20 и 50 мкМ); дигидрокверцетина -1.0, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0 мкг/мл (соответственно 3, 16, 32, 80, 160 мкМ); силима-рина- 2.5, 5.0, 10.0, 25.0 мкг/мл (соответственно 5, 10, 25, 50 мкМ); силибинина - 5.0, 10.0, 25.0, 50.0 (соответственно 10, 20, 50, 100 мкМ); стандартизованного препарата экстракта ОПЦ из виноградных косточек - 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0 мкг/мл (соответственно 0.7, 1.5, 7.5, 15.0, 37.5, 75.0 мкМ ОПЦ в экв. кате-хина). В качестве стартового реагента в инкубационную среду, содержащую также 12 мкМ Fe(NH4)2 (S04)2 и 0,2 мМ Na4 РгО 7, вносили НАДФН в конечной концентрации 0.025 мМ, и повторно инкубировали при 37 С в течение 10 мин. при постоянном встряхивании. После остановки реакции 30% ТХУ определяли количество образовавшихся ТБК-реактивных соединений.
Для изучения влияния ликопина, дигидрокверцетина, силибинина, и ОПЦ на изменения активности ферментов, вызванные окислением липидов микро-сомальной мембраны, препараты этих соединений добавляли в реакционную среду, содержащую суспензию микросом в 40 мМ ТРИС-НС1 буфере рН 7.4 (1 мг белка/мл), в количестве 10, 50, 50, 10 мкг/мл (20, 160, 100, 15 мкМ) соответственно, инкубировали при 37 С в течение 20 мин. при постоянном встряхивании, после чего индуцировали ПОЛ микросом внесением 0.025 мМ НАДФН и инкубировали 10 мин. при тех же условиях. Для оценки количества образовавшихся ТБК-реактивных продуктов реакцию останавливали добавлением 30% ТХУ, а для определения активности ферментов - 5 мМ ЭДТА.
Для определения ТБК-реактивных соединений, сразу после остановки реакции ТХУ, инкубационную смесь центрифугировали при 6000 об/мин. в течение 10 мин. на центрифуге «ОПн», к 1 мл надосадка добавляли 0.2 мл 0.6 н НС1, 0.8 мл 0.12 М ТБК и нагревали в течение 10 мин. при 100 С. После охлаждения, концентрацию образовавшегося малонового диальдегида (МДА) измеряли при длине волны 532 нм и рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции 1,56 105М"1см"1.
Активность UDP-глюкуронозилтрансферазы (ГлТ) определяли с р-нитрофенолом в качестве субстрата [98] без добавления детергента или в присутствии 0,1% Тритона Х-100 (только в эксперименте с ликопином), скорость гидроксилирования бенз(а)пирена - по методу [118].
Результаты представлены как средние величины по данным 3-4 независимых экспериментов. В работе использовали половозрелых крыс-самцов породы Вистар. Крыс содержали в клетках по 3-4 особи в каждой в условиях естественного освещения при температуре 18-22 С и относительной влажности воздуха 60-80% на подстилке из древесных стружек. Животные ежедневно получали порцию корма в одно и то же время, питьевую воду животные получали без ограничений. Наблюдение за состоянием животных, поедаемостью корма и массой тела проводили ежедневно.
Другие методы исследования
На рисунке 4.10. схематично представлены возможные изменения параметров ХЛ при внесении в реакционную среду гипотетического антиоксиданта: удлинение латентного периода и снижение максимальной амплитуды ХЛ. Увеличение продолжительности латентного периода ХЛ модельной системы в присутствии низкомолекулярных антиоксидантов связывают с их взаимодействием с феррил-радикалами и гидроксил-радикалами, инициирующими окисление люминола, а снижение максимальной интенсивности ХЛ - со способностью восстанавливать промежуточный продукт реакции - семихинонрадикал люминола и супероксиданион-радикал, т.е. прерывать окислительные цепи [50].
Как видно из табл. 4.4 и рис. 4.1, добавление наименьшей из использованных концентрации ликопина - 1.0 мкМ, тормозило окисление люминола, что проявлялось в возрастании латентного периода ХЛ, и снижении интенсивности ХЛ на 10%. Дальнейшее увеличение концентрации ликопина в системе вызывало дозозависимое линейное увеличение латентного периода и снижение интенсивности ХЛ. При максимальной используемой концентрации - 10 мкМ, СРО люминола тормозилось практически полностью.
Результаты изучения антиоксидантных свойств дигидрокверцетина приведены в табл. 4.5. и на рис. 4.2. При максимальной (из использованных) концентрации, 16 мкМ, развитие ХЛ подавлялось полностью. Динамика увеличения латентного периода ХЛ при увеличении концентрации дигидрокверцетина также носила линейный характер, в отличие от характера кривой изменений интенсивности ХЛ.
Результаты изучения влияния «Диквертина» - другого использованного нами препарата дигидрокверцетина, на параметры люминол-зависимой ХЛ практически не отличались от данных, полученных при использовании препарата дигидрокверцетина (табл. 4.6).
Результаты оценки антиоксидантной активности силимарина, представлены в табл. 4.7. и на рис. 4.3. Силимарин в концентрациях выше 0.25 мкМ вызывал выраженное, зависимое от концентрации снижение окисления люминола системой НЬ-Н202, что отражалось как на характере изменения латентного периода ХЛ, так и максимальной амплитуды ХЛ.
В отличие от силимарина, силибинин в низких концентрациях - 0.12-1.20 мкМ, не оказывал какого-либо влияния на латентный период развития ХЛ, и лишь в максимальных концентрациях (12 и 25 мкМ) приводил к задержке развития ХЛ, равной по степени наблюдаемой при использовании силимарина в тех же концентрациях (таб. 4.8, рис. 4.4.).
Не выявлено различий в действии силибинина и силимарина на величину максимальной амплитуды ХЛ. Оба препарата в концентрации выше 1.5 мкМ подавляли интенсивность ХЛ более чем в 2 раза, а в концентрации 25 мкМ -полностью.
Как видно из данных, представленных в таблице 4.9., высокая антиоксидантная активность ОПЦ виноградных косточек проявлялась уже при концентрации 0.75 мкМ экв. катехина, что выражалось в задержке развития ХЛ до 70 с, а также снижением интенсивности ХЛ на 25%. Последующее увеличение концентрации препарата в реакционной смеси вызывало дозозависимое увеличение длительности латентного периода ХЛ, а также снижение ее интенсивности (рис. 4.5).
В связи с тем, что концентрацию ОПЦ выражали в молярных эквивалентах катехина, изучали также влияние катехина на параметры ХЛ в системе СРО люминола.
Как видно из таблицы 4.10., катехин, как и ОПЦ проявляет высокую антирадикальную активность в данной модельной системе. Так, при самой малой из использованных концентраций, 1.75 мкМ интенсивность ХЛ подавлялась на 25%, что сопровождалось задержкой развития ХЛ на 100 с. Дальнейшее увеличение концентрации катехина вызывало удлинение латентного периода и снижением интенсивности ХЛ практически в линейной зависимости (рис. 4.6).
В работе Клебанова Г.И. с соавт., 1999 [22], было показано, что аскорбиновая кислота оказывает пролонгирующее действие на длительность латентного периода прямо пропорционально концентрации, не оказывая при этом влияния на интенсивность ХЛ. В связи с этим, для сравнения антиоксидантной активности изучаемых биологически активных соединений, была рассчитана (по величине латентного периода) активность 1 мкМ каждого их них в мкМ экв. аскорбиновой кислоты. Для этой цели определяли влияние различных концентраций аскорбиновой кислоты на основные параметры ХЛ. На рисунке 4.7 изображен ряд кривых ХЛ в системе СРО люминола при добавлении различных концентраций аскорбиновой кислоты. Как видно из рис. 4.7 и табл. 4.11, увеличение концентрации аскорбиновой кислоты в реакционной среде характеризовалось прямым пропорциональным удлинением латентного периода с ростом концентрации аскорбиновой кислоты, при этом интенсивность ХЛ достоверно не изменялась. Это позволило использовать кривую, представленную на рис. 4.8 в качестве калибровочной кривой для расчета антиоксидантной активности изучаемых Фл и ликопина в системе НЬ-Н202-люминол в аскорбатных эквивалентах (табл. 4.12, рис. 4.9).
Изучение влияния ОПЦ на защитно-адаптационный потенциал крыс при микотоксикозе, вызванном фумонизинами
Как видно из данных, представленных в табл. 4.13., НАДФН в концентрации от 0,025 до 0,100 мМ вызывал четкое дозозависимое возрастание накопления МДА, а концентрациях выше 0,100 мМ наблюдалось лишь незначительное усиление образования МДА. Согласно [161], уровень ПОЛ микросом in vitro может оцениваться как адекватный показатель окислительных изменений.
Индукция ПОЛ и накопление МДА в микросомах сопровождалось изменением активности микросомальных ферментов - бензпиренгидроксилазы и UDP-глюкуронозилтрансферазы. Как видно из табл. 4.14. и рисунка 4.11, накопление МДА до концентрации 18,24 нмоль/мг белка, приводило к снижению бензпиренгидроксилазной активности на 82% и возрастанию активности UDP-глюкуронозилтрансферазы более чем в 6 раз. Дальнейшее увеличение концентрации МДА не вызывало значительных изменений в бензпиренгидроксилазной активности и приводило к небольшому снижению активности UDP-глюкуронозилтрансферазы.
Инкубация микросом с ликопином приводила к возрастанию их устойчивости к ПОЛ, индуцированному НАДФН-Fe2 (таб. 4.15.). Минимальная концентрация ликопина, при которой наблюдали существенное уменьшение (на 39%) накопления продуктов ПОЛ составляла 5 мкМ. При концентрации ликопина 7 мкМ образование МДА снижалось на 50%, при 10 мкМ - до 32%, а при концентрации 50 мкМ подавлялось практически полностью (рис. 4.12.).
Предварительная инкубация микросом с 20 мкМ ликопина вызывала достоверное усиление спонтанного (неиндуцированного) ПОЛ и накопление МДА в концентрации, не оказывающей влияния на активность ферментов. В микросомах, предварительно проинкубированных с ликопином, индуцированное НАДФН окисление липидов тормозилось в 4 раза, а активность ферментов не отличалась достоверно от уровня контроля. Определяемая в присутствии Три 79 тона Х-100 «полная» активность ГлТ не изменялась ни при индукции ПОЛ, ни при воздействии ликопина (табл. 4.16, рис. 4.13).
Дигидрокверцетин в концентрации 3 мкМ (табл. 4.17.) приводил к снижению накопления МДА на 10% , в концентрации 32 мкМ уровень МДА снижался на 30%), а наибольшая концентрация - 160 мкМ, задерживала развитие ПОЛ на 63%о. Концентрация дигидрокверцетина, необходимая для снижения ПОЛ на 50%) от исходного уровня составляла 115 мкМ (рис. 4.14.).
Прединкубация микросом с 160 мкМ дигидрокверцетина вызывала достоверное снижение уровня спонтанного ПОЛ (табл. 4.18.), но достоверных изменений в активности ферментов при этом не регистрировалось. Индукция ПОЛ микросом в присутствии дигидрокверцетина значительно подавлялась, что проявлялось в снижении накопления МДА в 2.8 раза и восстановлении активности ферментов (табл. 4.18, рис. 4.15).
Уже наименьшая концентрация силимарина - 2.5 мкМ вызывала значительное подавление образования ТБК-реактивных продуктов (на 36% ), при концентрации 20 мкМ накопление МДА снижалось на 54% и не изменялось значительно при дальнейшем увеличении концентрации (табл. 4.18). Подавление ПОЛ на 50%) наблюдалось при добавлении в систему 15 мкМ препарата (рис. 4.16).
В отличие от силимарина, силибинин оказывал существенное влияние на индукцию ПОЛ лишь в концентрациях превышающих 20 мкМ. Так, при этой концентрации накопление МДА уменьшалось лишь на 20% (табл. 4.19, рис. 4.17).
Индукция ПОЛ микросом, предварительно проинкубированных со 100 мкМ силибинина (табл. 4.20) приводила к значительному снижению уровня накопления МДА, что сопровождалось восстановлением уровня гидроксилирова-ния БП до 64% от контрольного уровня, и практически полным восстановлением активности ГлТ относительно контроля (рис. 4.18).
ОПЦ виноградных косточек оказывали выраженное дозозависимое торможение ПОЛ микросом, индуцированное НАДФН. Так, накопление МДА при индукции ПОЛ микросом в присутствии 0.5 мкг/мл ОПЦ (0.7 мкМ экв. катехи-на) снижалось достоверно на 9% (табл. 4.21), а при концентрации 15 мкМ экв. катехина - более чем в 2 раза. При более высоких концентрациях ОПЦ практически полностью блокировали накопление МДА (рис. 4.19.). Концентрация ОПЦ, вызывающая подавление скорости ПОЛ на 50%, оцениваемой по накоплению МДА, составила 7,5 мкг/мл (11 мкМ экв. катехина).
Инкубация микросом в присутствии 10 мкг/мл ОПЦ виноградных косточек (15 мкМ экв. катехина) вызывала снижение накопления МДА, что сопровождалось усилением активности UDP-глюкуронозилтрансферазы на 87% от контрольного уровня. Влияние ОПЦ виноградных косточек на скорость НАДФН-зависимого ПОЛ микросом характеризовалось более чем двукратным снижением накопления МДА, что сопровождалось практически полным восстановлением активности БПГ, активность UDP-глюкуронозилтрансферазы при этом снижалась до значения, определяемого при инкубации в присутствии 10 мкг/мл ОПЦ без НАДФН (табл. 4.22, рис. 4.20).
Для сравнения антиоксидантной активности изучаемых соединений в данной модели была рассчитана концентрация каждого из них, вызывающая снижение накопления МДА на 50%. Как видно из табл. 4.23 и рис. 4.21, наибольшую антиоксидантную активность в системе индуцированного ПОЛ микросом проявлял ликопин, подавляя накопление МДА на 50% уже при концентрации 7 мкМ. Сравнимые результаты были получены и при оценке влияния ОПЦ (11 мкМ экв. катехина) и силимарина (15 мкМ) на уровень МДА. Силиби-нин и дигидрокверцетин тормозили накопление МДА в микросомах на 50% в значительно больших концентрациях - 80 и 115 мкМ соответственно.
