Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Лигнификация ксилемы в процессе её развития (обзор литературы) 9
1.1. Строение древесины хвойных 9
1.2. Ультраструктура и одревеснение клеточной стенки 11
1.3. Образование и строение годичного слоя 13
1.4. Развитие ксилемных производных камбия 14
1.5. Фенольные соединения 19
1.5.1. Фенолкарбоновые кислоты в растительной клетке 19
1.5.2. Химия и структура лигнина 22
1.5.3. Биосинтез лигнина 24
1.6. Каллусные культуры как модельные системы для изучения процесса лигнификации клеточной стенки 33
Глава 2. Объекты и методы исследования 38
2.1. Материал исследования 38
2.2. Выделение и анализ фенолкарбоновых кислот 39
2.3. Выделение и анализ лигнина 42
2.4. Получение и анализ каллусных культур 45
Глава 3. Фенолкарбоновые кислоты при формировании годичного слоя в стволах сосны обыкновенной 49
3.1. Изменение ФК при развитии первичных стенок трахеид 49
3.2. Изменение ФК в ранних и поздних трахеидах 54
3.3. Изменение индивидуального состава ФК по ходу развития трахеид .61
Заключение к главе 71
Глава 4. Особенности лигнификации ранней и поздней ксилемы сосны обыкновенной 73
4.1. Отложение лигнина в ранней и поздней ксилеме 73
4.2. Состав и структура лигнина 76
4.3. Эфирные связи в макромолекулах лигнина 79
4.4. Молекулярно-массовое распределение макромолекул 80
Заключение к главе 82
Глава 5. Изучение процесса лигнификации в культуре клеток сосны обыкновенной (Pinus sylvesrtis) 84
5.1. Изучение условий культивирования каллуса 84
5.2. Лигнификация и анализ каллуса 92
5.2.1. Гистохимический анализ 95
5.2.2 Химический анализ 96
Заключение к главе 104
Заключение 107
Выводы 111
Приложения 113
Список литературы 117
- Развитие ксилемных производных камбия
- Изменение ФК при развитии первичных стенок трахеид
- Состав и структура лигнина
- Химический анализ
Введение к работе
Актуальность исследования. Лигнификация является одним из главных процессов, сопровождающих развитие клеток ксилемы древесных растений. Проблема процесса лигнификации привлекала и привлекает исследователей по разным причинам. С одной стороны важно понять сам процесс лигнификации, приводящий к укреплению ткани и появлению ее механической прочности, чтобы управлять этим процессом. С другой, важно найти пути оптимальной делигнификации древесины, поскольку лигнин является одним из наиболее значимых факторов, ограничивающих превращение биомассы растений в целлюлозу или биотопливо. Интерес части исследователей направлен на получение растений с либо низким содержанием лигнина, либо его легкой доступностью химической деградации [Sticklen, 2008; Weng et al., 2008a; Mansfield, 2009].
Изучение механизма биосинтеза лигнина и условий сочетания структурных фенилпропановых единиц в его макромолекулах связано в основном с синтезом дегидрополимеров in situ, предложенном еще Фрайденбергом [Freudenberg, 1959]. Другим направлением, активно используемым в последнее время, является исследование лигнификации в культуре ткани. Ее применяют как модельную систему для изучения путей биосинтеза предшественников лигнина – оксикоричных кислот и ферментов, участвующих в процессе [Запрометов, 1993; Li et al., 2000; Dixon et al., 2001; Krknen et al., 2002; Mller et al., 2003; 2005; 2006].
Значительно меньше работ, в которых биогенез лигнина рассматривается непосредственно в развивающейся ткани растений [Donaldson, 1991, 1992; Grunwald at all., 2002; Terashima et al., 1986; Terashima, Fokushima, 1988; Terashima et al., 1988]. При этом в основном используются разные варианты методов спектроскопии.
Ранняя и поздняя ксилема образуются при разных условиях обеспеченности развивающихся тканей водой [Zahner et al., 1964]. Различия в условиях формирования клеток ксилемы раннего и позднего слоя годичного прироста сосны обыкновенной [Антонова, Стасова, 1993; Антонова, 1999] должны влиять на процесс лигнификации, интенсивность его отложения в ксилеме и структуру полимера. Такие различия были обнаружены ранее при изучении отложения лигнина на этапах созревания клеток ранней и поздней ксилемы в стволах лиственницы сибирской [Antonova et al, 2007]. Связано ли это с биогенетической особенностью вида или характерно и для других хвойных следует проверить. Изучение лигнификации на последовательных стадиях развития клеток ранней и поздней ксилемы сосны обыкновенной до сих пор не проводилось.
Кроме того, важно установить, насколько будут адекватными процессы лигнификации in vivo и in vitro, т.е. в культуре тканей.
Данная работа является продолжением исследований ксилогенеза сосны обыкновенной, проводимой в Институте леса.
Цели и задачи исследования – изучить процесс отложения лигнина, его структуру и состав предшественников - оксикоричных кислот - на последовательных стадиях развития клеток ранней и поздней ксилемы при формировании годичных приростов в стволах сосны обыкновенной и сравнить процессы лигнификации in vivo и in vitro (в культуре ткани).
В задачи работы входило изучение:
содержания и состава фракций фенолкарбоновых кислот в ходе поэтапного развития клеток ранней и поздней ксилемы,
содержания лигнина на последовательных этапах созревания трахеид,
состава и соотношения фенилпропановых единиц в структуре препаратов лигнина, а также его макромолекулярной характеристики,
отработка условий культивирования каллуса сосны обыкновенной,
содержания и структуры лигнина в каллусной культуре ткани при разных условиях культивирования,
содержание низкомолекулярных метаболитов в каллусной массе при разных условиях культивирования.
Научная новизна исследования. Впервые показаны различия в динамике накопления лигнина в ходе созревания ранних и поздних трахеид сосны обыкновенной. Впервые проведено поэтапное сравнение макромолекулярных характеристик и структуры препаратов лигнина, выделенных из разных по степени развития клеток ранней и поздней ксилемы сосны обыкновенной. Впервые получены данные по содержанию и составу фенолкарбоновых кислот, и в частности оксикоричных кислот, как соединений, играющих важную роль в росте и развитии клеток, а также являющихся предшественниками лигнина в ходе развития первичных и вторичных стенок ранних и поздних трахеид. Впервые проведено сравнение структуры лигнина, продуцированного в ранней и поздней ксилеме сосны обыкновенной in vivo и in vitro.
Защищаемые положения:
Отложение лигнина в ходе образования раннего и позднего слоя годичного прироста идет с разной интенсивностью и динамикой,
Лигнины последовательных этапов созревания ранних и поздних трахеид различаются по составу фенилпропановых структурных единиц, что коррелирует с изменением состава оксикоричных кислот – предшественников лигнина.
Лигнин сосны обыкновенной, полученный в условиях in vitro по составу структурных единиц ближе к лигнину ранней ксилемы.
Теоретическое и практическое значение.
Полученные данные по составу и соотношению структурных единиц, скорости отложения, структуре макромолекул лигнина, а также динамике и фракционному составу его предшественников на разных этапах дифференциации ранних и поздних трахеид послужат фундаментальным вкладом в понимание процесса лигнификации и ксилогенеза хвойных.
Сравнительное изучение процесса лигнификации сосны обыкновенной in vivo и in vitro позволит также внести вклад в понимание механизма лигнификации, определить факторы, влияющие на процесс, и наметить биотехнологические пути регулирования этого процесса, в частности, применяя генную инженерию.
Апробация работы. Материалы исследований были представлены на VII Международном симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2009), на IV всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009), на XXIII IUFRO WORLD CONGRESS (Seoul, 2010), на научных чтениях памяти профессора А. А. Яценко-Хмелевского «Структурно-функциональные исследования растений в приложении к актуальным проблемам экологии и эволюции биосферы» (Санкт-Петербург, 2009), на конференции молодых ученых Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН «Исследование компонентов лесных экосистем Сибири» (Красноярск 2009, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах текста, содержит 31 рисунков, 7 таблиц и 3 приложения. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего ссылки на 187 источников, из которых 139 на иностранных языках.
Развитие ксилемных производных камбия
Онтогенез ксилемных производных камбия включает несколько этапов: рост клеток растяжением, формирование вторичной оболочки, лигнификацию и утрату протопласта. Время дифференциации клеток зависит от вида растения, типа клеток и условий вегетации и может проходить от нескольких недель, до нескольких месяцев.
Развитие трахеид в фазу роста растяжением. По окончании цикла деления клетка переходит в следующее состояние, которое называют «рост растяжением». В это время происходит поверхностный рост оболочки. Внешние размеры трахеид зависят от степени развития первичной клеточной стенки. В фазу роста растяжением длина трахеальных производных камбия увеличивается по сравнению с исходной длиной веретеновидных инициалей в среднем на 20 % [Крамер, Козловский, 1983].
Увеличение дифференцирующейся трахеиды в длину оказывается локализованным в клеточных верхушках, которые проникают между смежными дифференцирующимися трахеидами, где межклеточный слой еще не лигнифицирован и, вероятно, пластичен [Wardrop, Cronshaw, 1958].
Определяя прирост радиального размера клеток в зависимости от их расположения в зоне при формировании древесины в 50-60-летних деревьях сосны обыкновенной, Г.Ф. Антонова и В.В. Шебеко [1985] показали, что наиболее интенсивно развитие радиального диаметра трахеид идет в первой трети зоны роста растяжением, уменьшаясь к концу зоны.
Развитие первичной клеточной стенки в фазе характеризуется продолжительностью и скоростью роста клеток. Продолжительность развития в фазе роста растяжением значительно меняется в течение сезона для индивидуальных трахеид радиального ряда клеток формирующегося годичного слоя ксилемы и различна в побегах и стволовой части деревьев сосны обыкновенной в полосе средней Сибири [Антонова, Шебеко, 1979; Антонова и др., 1983].
Факторы внешней среды влияют на условия развития клеток в зоне и соответственно на радиальный размер трахеид. Сильная положительная корреляция радиального расширения с температурой воздуха обнаружена Стасовой [1991] для однолетних побегов сосны обыкновенной. Однако влияние в значительной мере опосредуется положением дерева в древостое. Так, при развитии трахеид в побегах сосны, растущей на вырубке, существует оптимум температуры, за пределами которого скорость расширения уменьшается. Например, диаметр проростков сосны обыкновенной больше при температурах 17.5 - 22.5 С, чем при 27.5 С [Denne, 1971]. Это объясняется усилением обезвоживания тканей при высоких температурах, торможением фотосинтеза, усилением дыхания и увеличением расхода фотоассимилятов на процесс.
К одной из причин ограничения роста клеток относят образование под действием стеночных пероксидаз диферуловых мостиков между полисахаридами клеточной стенки [Fry 1987], которое регулируется аскорбатом [Zarraetal. 1999].
Развитие трахеид в фазу вторичного утолщения. Клетка, покидая зону роста растяжением, имеет только первичную оболочку. Основная масса древесинного вещества откладывается в фазу вторичного утолщения. Сформировавшаяся вторичная клеточная стенка занимает до 98 % объема клеточных стенок трахеид сосны [Meier, Wilkie, 1959].
Развитие вторичного утолщения трахеид сосны обыкновенной в зоне созревания идет неравномерно [Антонова, Шебеко, 1985, Антонова, 1999] Наибольшим приростом характеризуются клетки, находящиеся в первой половине зоны, т.е. части, примыкающей к зоне роста растяжением. Падение интенсивности клеточных синтезов в радиальном направлении указывает на конкуренцию за субстраты, необходимые для синтеза компонентов вторичных клеточных стенок [Антонова, Шебеко, 1985].
Продолжительность созревания трахеид изменяется в течение сезона для различных клеток радиального ряда. В сосне обыкновенной в условиях лесостепной зоны Сибири развитие вторичного утолщения ранних трахеид идет от 10 до 20 суток, поздних — от 30 до 55 суток [Антонова, Стасова, 1992].
Скорость развития вторичной оболочки также варьирует по сезону [Антонова, Стасова, 1992]. С наибольшей скоростью вторичное утолщение проходит у ранних трахеид, развивавшихся в зоне созревания в конце июня — начале июля. Трахеиды, стенки которых развивались с наибольшей скоростью, имеют наименьшую площадь сечения оболочки, тогда как наибольшее количество вещества откладывается в поздних трахеидах, развитие вторичного утолщения которых завершилось в конце августа -начале сентября и шло со скоростью в два раза меньшей. Существует тесная зависимость между площадью поперечного сечения оболочек трахеид и продолжительностью их развития в зоне [Wodzicki, 1971; Антонова, 1999].
Сопоставление таких показателей развития в зоне, как ширина зоны и площадь поперечного сечения оболочек трахеид показывает, что количество биомассы в клетках древесины сосны зависит в конечном итоге от ширины зоны созревания [Антонова, Шебеко, 1986]. Иначе говоря, чем шире зона, т.е. чем больше клеток содержится в ней, тем больше биомассы накапливается в виде вторичной клеточной стенки [Антонова, 1999]. Это подтверждается увеличением ширины зоны созревания при появлении в ней поздних трахеид.
Сравнение темпов изменения положения клеток в зонах развития может быть использовано для определения типа образующейся древесины. В случае превышения темпа развития в зоне радиального расширения над таковым в зоне созревания образуется ранняя, древесина. И наоборот, когда в зоне роста растяжением он меньше, чем в зоне созревания, формируются поздние трахеиды [Антонова, Шебеко, 1979; Антонова, 1999].
Лигнификация и разрушение протопласта. Вторичное утолщение сопровождается лигнификацией ткани. При лигнификации, благодаря возникновению сетки лигнина и ее связей с гемицеллюлозами, изменяется плотность пространственной структуры стенки трахеид [Эриныш, 1977]. С отложением лигнина, осуществляется переход матрикса в неподвижное состояние и, таким образом прекращается, рост клетки [Wardrop, 1964; Vanholmeetal., 2010].
Утолщение клеточной стенки и её лигнификация обычно разобщены во времени [Donaldson, 2001]. Анатомическими исследованиями доказано, что лигнификация наступает только тогда, когда в клетках уже началось формирование вторичной клеточной стенки, т.е. имеется матрикс, в котором позднее формируются глобулы лигнина.
При изучении формирования ксилемы в стволах сосны обыкновенной в Сибири Г.Ф. Антонова и В.В. Шебеко [1985] отметили, что лигнификация начинается в углах уже 2-4-го ряда клеток от начала созревания, что соответствует 74 — Vg всех клеток зоны вторичного утолщения. Они предположили, что продолжительность лигнификации только немногим меньше общей продолжительности созревания, что согласуется с данными П. Крамера и Т. Козловского [1983]. Уордроп и Блант [Wardrop, Bland, 1958] предполагают, что лигнификация в последних стадиях происходит дополнительно как во вторичных слоях, так и в срединной пластинке. Отложение лигнина происходит исключительно во время вторичного утолщения. В результате лигнификации срединная пластинка и первичная оболочка как бы сливаются в единую структуру, называемую сложной срединной пластинкой.
Вследствие обезвоживания оболочки, снижения содержания веществ матрикса в процессе их химического распада освобождается объем, замещаемый лигнином. Отложенный лигнин может образовывать ковалентные связи с веществом матрикса или микрофибриллами целлюлозы, он увеличивает сопротивление оболочек к сжатию.
Процесс вторичного утолщения заканчивается дезинтеграцией протопласта и выходом клетки в зону зрелой древесины. Лизис протопласта в созревающих ксилемных элементах идет очень быстро. Всего 2-5 сут. протекает автолиз протопласта в трахеидах ствола сосны обыкновенной [Wodzicki, Brawn, 1973]. Однако точная продолжительность процесса неизвестна. Т. Wodzicki [1971] считает лизис протопласта важным физиологическим процессом, поскольку раннее или позднее окончание фазы созревания значительно влияет на толщину вторичных клеточных стенок. Разрушение протопласта связано со структурными изменениями, начинающими происходить в какой-то момент в цитоплазме и захватывающими очень быстро весь протопласт. Автолизу подвергаются вакуолярные мембраны, цитоплазматические органеллы, плазмалемма. На последней стадии разрушаются ядра [Wodzicki, Brawn, 1973]. В ранних трахеидах этот процесс занимает больше времени, чем в поздних [Wodzicki, 1971].
Изменение ФК при развитии первичных стенок трахеид
Динамику фенололкарбоновых кислот в ходе роста радиального размера трахеид в период формирования первичных стенок ранних трахеид исследовали в начале июня. В этот период зона роста растяжением содержала большое количество клеток, и ее удалось разделить на две части. Одна из них примыкала к камбиальной зоне (Кам) и её клетки находились в первой фазе роста (Рост 1), а другая - к зоне созревание (D) и её клетки находились во второй фазе (Рост 2), соответственно, когда скорость роста снижается [Антонова, Шебеко, 1985]. В этот период также присутствовали нелигнифицированные клетки в начале вторичного утолщения D1. Анализ ФК всех зон был проведен, чтобы оценить их содержание и состав перед началом отложения лигнина.
Общее содержание ФС на этапах развития трахеид в формирующемся слое ксилемы в начале июня, рассчитанное на сухой вес и на клетку, представлено на рис. 6.
Как показывают данные, содержание ФС варьирует в зависимости от этапа развития и метода расчета. Так минимальное содержание ФС отмечается при расчете на сухую навеску на втором этапе роста растяжением (Рост2), а при расчете на клетку в камбиальной зоне (Кам). С переходом ксилемных производных камбия к росту растяжением количество ФС в клетках возрастает более чем в три раза, но уже во второй фазе роста значительно снижается. С началом образования вторичной клеточной стенки (D1) их количество снова увеличивается.
Содержание свободных и связанных форм ФК также изменяется в зависимости от этапа развития первичной клеточной стенки клеток (рис. 7) и их динамика сходна с общей динамикой ФС (см. рис. 6).
При обоих методах расчета минимальное количество свободных и связанных фенолкарбоновых кислот наблюдалось в Кам. В фазу роста содержание ФК снижается от первой стадии ко второй, а в D1 их уровень вновь повышается, достигая максимума при расчете на клетку. Уровень связанных ФК превышает уровень свободных более чем в шесть раз на всех этапах формирования первичной стенки трахеид.
Содержание как общих ФС, так и фракций свободных и связанных ФК (см. рис. 6,7) увеличивается с началом роста первичных стенок и уменьшается во второй фазе роста трахеид. Эти изменения соответствуют динамике роста клеток в зоне. Интенсивность радиального роста трахеид сосны обыкновенной максимальна на первых этапах их роста, а затем снижается в ходе этого роста [Антонова, Шебеко, 1985].
Снижение свободных ФК на втором этапе роста растяжением связано, очевидно, с их расходом на образование под действием пероксидазы диферуловых мостиков между полисахаридами клеточной стенки, вследствие чего скорость роста клеток снижается. Образование поперечных связей между гемицеллюлозами клеточных стенок за счет диферуловых мостиков усиливает структуру первичных стенок и уменьшает их способность к растяжению [Fry, 1983; 1986; Waldron et al., 1997; Zarra et al., 1999]. В Кам и Рості содержание свободных ФК в составе общих ФС было практически одинаковым и составляло 12,5 и 12.8 % соответственно. Это указывает на синхронизацию синтеза и связывание/утилизацию свободных ФК на начальных этапах развития структуры первичных стенок. Поскольку свободные ФК являются ядами для клетки, в начальные периоды роста стенок, по-видимому, поддерживается определенный уровень таких ФК. Хотя количество свободных ФК в клетках второй фазы роста уменьшалось (см. рис. 7 а), их относительное содержание в составе общих ФС увеличивалось (22.5 %), а в начале отложения вторичных стенок оно вновь снижалось (17 %).
Изменение уровня свободных ФК в ходе роста растяжением согласуется с варьированием уровня аскорбата, определенного на тех же образцах [Антонова и др., 2009]. Благодаря высокому уровню аскорбата в начальный период роста растяжением, который действовал как антиоксидант, образование фенольных мостиков между гемицеллюлозами первичных стенок под действием пероксидазы тормозилось. Во второй фазе роста преобладали окислительные процессы, и уровень аскорбата понижался при одновременном повышении дегидроаскорбата, т.е. пока аскорбат был доступен для перекиси водорода, процессы сшивки в стенке тормозились [Takahama, 1993; Takahama, Oniki, 1997].
ФК определялись как объединенный пул симпласта и апопласта. Хотя основные события, связанные с синтезом фенолкарбоновых кислот, также как и перевод ФК в гликозилированные формы, происходят в клетке, благодаря чему она защищается от избыточного количества свободных ФК, связанные ФК частично могут транспортироваться в апопласт. Расщепляясь в апопласте под действием гидролаз, они пополняют апопластный пул свободных ФК, которые в свою очередь под действием пероксидазы «сшивают» полисахариды клеточных стенок. Однако нельзя исключить переноса через мембраны мономерных форм ФК. Например, упоминалось, что для транспорта мономеров в клеточную стенку монолигнолы, производные оксикоричных кислот, предпочтительнее, чем их гликозиды Pavin, 1991].
Динамика ФК со сложноэфирными и простыми эфирными связями при развитии ранней ксилемы в начале июня тоже зависит от этапа развития клеток (рис. 8). Разные методы расчета показывают при этом разную динамику кислото- и щелочелабильных ФК, особенно со сложноэфирными связями. Общие тенденции варьирования для простых и сложных эфиров сохраняются. Количество как кислотолабильных, так и щелочелабильных ФК, при расчете на клетку имеют наименьшее значение в Кам, в Рості происходит их увеличение, а в Рост2 - снижение. Максимального уровня они достигают перед лигнификацией (D1).
Уровень щелочелабильных ФК в клетках значительно ниже, чем кислотолабильных. Количество последних превышает пул первых в два-пять раз. Пул простых эфиров повышался от Кам к Рості на 75,5 %, а пул сложных эфиров на 56 %. В Рост 2 количество простых и сложных эфиров уменьшалось неравномерно. Пул простых снизился на 47 %, а сложных -только на 26 %. Это означает, что при создании структуры первичных стенок в основном используются ФК, входящие в состав простых эфиров. В свою очередь это свидетельствует о преимущественном, в сравнении с эстеразами, постепенном увеличении активности гидролаз во второй фазе роста.
Перед лигнификацией пул сложных эфиров ФК увеличиваются на 30 %, а простых - на 67 % по сравнению со второй фазой роста. Несмотря на неравномерное варьирование количества эфиров ФК в ряду развивающихся клеток, отношение сложных и простых форм постепенно уменьшается с 0.55 до 0.2 от Кам к D1, показывая, что по мере роста и развития трахеид в составе спирторастворимых фенолов начинают постепенно преобладать ассоциированные ФК с простыми эфирными связями. Таким образом, клетка регулирует образование гликозидов и сложных эфиров кислот и их использование.
Очевидно, что изменение разных фракций ФК в зоне роста растяжением обусловлены скоростью роста первичных стенок трахеид, а перед началом лигнификации - подготовкой к процессу полимеризации предшественников лигнина.
Состав и структура лигнина
Препараты лигнина, выделенные из ранней и поздней ксилемы разных этапов созревания трахеид различаются содержанием и составом фенилпропановых единиц (таблица 3).
Основным альдегидом в продуктах щелочного окисления ТГЛ-П был ванилин, производное гваяцилпропановых структурных единиц лигнина. Его содержание, как в ранней, так и в поздней ксилеме увеличивалось по мере дифференциации трахеид. В продуктах щелочного окисления лигнина из ранней и поздней ксилемы наряду с ванилином присутствовал сирингилальдегид, производное сирингильных структур, и в чуть меньшем количестве п-оксибензальдегид, производное п-оксифенилпропановых единиц полимера.
Наряду с альдегидами в препаратах лигнина были идентифицированы также оксикоричные кислоты — феруловая, синаповая ий- кумаровая.
Вероятно, остатками этих оксикоричных кислот макромолекулы лигнина связаны с полисахаридами клеточной стенки. На всех стадиях процесса, как в ранней, так и поздней ксилеме доминировала ванилиновая, её количество увеличивалось как в ранней, так и в поздней ксилеме. Также отмечалось высокое содержание феруловой кислоты. В ранних трахеидах её количество увеличивалось по ходу отложения лигнина, а в поздних — она менялась незначительно, увеличиваясь в зрелых клетках. П-кумаровая кислота была в наименьшем количестве, и её содержание изменялось незначительно по ходу дифференциации клеток. Присутствие п-кумаровой кислоты способствует конденсации гваяцилпропановых единиц лигнина [Terashima, Fokushima, 1988].
В макромолекулах лигнина ранней древесины количество п-оксифенилпропановых единиц увеличивалось по мере созревания трахеид, а в поздней, напротив, - уменьшалось (рис. 21). Поскольку п-кумаровый спирт способен образовывать большее количество радикалов, он в наибольшей степени подвержен конденсации. Это согласуется со скоростью накопления лигнина в ранней и поздней ксилеме.
Количество сирингильных и гваяцильных единиц лигнина меняется по-разному по мере отложения лигнина, и их отношение тоже изменяется как в процессе созревания клеток, так и в зависимости от типа образующейся древесины (рис. 22). В трахеидах ранней ксилемы в ходе созревания это соотношение постепенно растет, тогда как в поздней, наоборот, снижается
Увеличение отношения сирингильных единиц к гваяцильным в ходе лигнификации ранней ксилемы показывает, сначала более активно в процесс вовлекаются гваяцильные структуры. Если сопоставить эти данные с изменением индивидуальных ОК в период формирования первичных клеточных стенок (см. рис. 14), то можно предположить, что преобладание синаповой кислоты во всех фракциях ОК, связано с более активным расходом феруловой на начальных стадиях процесса, что согласуется с рис. 21. В связи с тем, что синаповая кислота менее активна для полимеризации, можно объяснить низкую интенсивность отложения лигнина на самых ранних этапах лигнификации в ранней ксилеме.
По мере отложения лигнина что в ранней ксилеме начинают преобладать сирингильные структуры, тогда как в поздней, напротив, начинают превалировать гваяцильные структурные единицы. Эти согласуюется с динамикой ОК в период лигнификации разных типов ксилемы (см. рис. 16), указывая на специфичность использования отдельных форм ОК в лигнификации. Сопоставляя эти данные можно предположить, что основным превращениям на пути образования монолигнолов в ранней ксилеме подвергаются сложные, а в поздней - простые эфиры ОК.
Разная степень вовлечения предшественников лигнина в биосинтез связана с разной активностью этих фенилпропановых единиц. Это в свою очередь может объяснить разную скорость отложения лигнина в ранней и поздней ксилеме.
Таким образом, с помощью метода щелочного окисления показано, что лигнины ранней и поздней древесины сосны отличаются содержанием и составом фенилпропановых единиц, а значит и структурой макромолекул лигнина. Соотношение гваяцил- , сирингил- и п-оксифенилпропановых единиц, из которых гваяцильные структуры составляют основу макромолекул лигнина, меняется в ходе лигнификации ранней и поздней древесины.
Химический анализ
В препаратах каллуса образцов 14-16 определяли общее содержание углеводов, фенольных соединений, АК и ДАК. В образцах 11т, 14-16, 20, 21, 24, 25 определяли содержание низкомолекулярного (спирторастворимого) и высокомолекулярного.(растворимого в щелочи) лигнина по указанным выше методикам. Кроме того, состав структурных единиц препаратов лигнина из образцов 14-16 характеризовали методом щелочного окисления с оксидом меди по [Hartley 1971].
Спирторастворимые вещества
Анализ спирторастворимых метаболитов (рис. 28) показал, что состав экстрактивных веществ меняется в зависимости от условий культивирования каллуса и степени дифференциации клеток. Минимальное количество углеводов отмечалось в образце 14с, но содержание фенольных соединений (преимущественно фенолкарбонових кислот) было максимальным. По мере старения и лигнификации клеток каллуса (обр. 14т) уровень углеводов увеличивался, а фенолов, наоборот, снижался.
В каллусах, культивирующихся на среде с 5 % содержанием сахарозы (образцы 15с и 15т), содержание углеводов в «светлой» и «темной» частях практически одинаково, а в образцах 16 углеводы преобладали в «светлой» части. Количество фенолов в образцах 15 и 16 по мере лигнификации каллусных клеток изменяется сходным образом. ФК содержится меньше в активно делящихся клетках, а в «темной» части каллуса они начинают преобладать.
Данные по содержанию аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот (табл. 7) показывают, что в активно делящейся части каллуса, культивированного при 3 % концентрации сахарозы (обр. 14с) отношение АК/ДАК низкое (0,055), т.е. преобладали процессы окисления. В лигнифицированной части (обр 14т) АК не было обнаружено, что, вероятно, связано с её расходом в процессе окислением до ДАК и подавлением синтеза АК. Количество последнего, напротив, очень высокое.
В образцах, культивировавшихся на средах с более высокой концентрацией сахарозы (15с и 15т) содержание АК на порядок выше, чем в образце 14с. Это обусловлено повышенным содержанием сахарозы в питательной среде, что приводит к образованию уроновых кислот в каллусе, являющихся субстратами для синтеза АК.
Отношение АК/ДАК в 15с (0,264) выше, чем в 15т (0,164). Повышенное содержание АК (23,1 мг % от сух веса) в 15с,по сравнению с 15 т (10,6 мг % от сух веса) может оказывать воздействие на лигнификацию каллуса в 15 с. Высокое содержание АК отрицательно влияет на дегидрогенную полимеризацию предшественников лигнина и тем самым на его биосинтез [Takahama, Oniki, 1997]. В образцах 16с и 16т уровень АК и ДАК не измерялся, поскольку применение поливинилпирролидона в питательных средах затрудняет количественное определение фенольных соединений и аскорбиновой кислоты в каллусе.
Содержание и состав лигнина
Содержание спирторастворимой (т.е. низкомолекулярной) фракции лигнина в каллусной биомассе показано на рис. 29 а.
Как уже говорилось, образцы каллуса различались онтогенетическим развитием: Результаты показали; что каллусная биомасса масса со «светлыми», активно делящимися клетками содержала низкомолекулярный лигнин, но его количество отличалось от лигнина в темной каллусной массе с лигнифицированными клетками. Во всех образцах количество спирторастворимого лигнина в растущих «светлых» клетках было в 2,5-3 раза ниже, чем дифференцирующихся «темных».
В образцах каллуса с лигнифицированными клеточными стенками наименьшее содержание низкомолекулярного лигнина наблюдалось в 14т, которые культивировались на среде с 3 % содержанием сахарозы. Максимальное количество спирторастворимого лигнина отмечалось в образце 15т, культивированном на среде с 5 % концентрацией сахарозы. Его содержание превышало содержание лигнина в образцах 14т примерно в 2 раза. Каллус, выращенный на среде с концентрацией сахарозы 5 % и добавлением поливинилпирролидона (16т), по содержанию спирторастворимого лигнина занимал промежуточное положение между каллусом, культивированным на среде с 3 % (14т) и 5 % (15т) концентрацией сахарозы.
Из «светлых» частей каллуса тоже были выделены препараты высокомолекулярного лигнина (ТГЛ-П), но его содержание также было ниже, чем в «темных» клетках. Минимальная разница наблюдалась в образцах 14 и составляла 1.3, максимальная - в образцах 16, которые различались по содержанию этой фракции лигнина в два раза. Низкое содержание лигнина в «светлой» части каллуса может объясняться тем, что в этой части каллуса могли присутствовать клетки, находящиеся на начальном этапе его отложения.
Как и в случае с низкомолекулярным лигнином (ТГЛ-І), количество фракции ТГЛ-П было наименьшим в образцах, культивированных на среде с 3 % содержанием сахарозы, и составляло для 14с 6,15 %, а для 14т 8 % от веса сухой биомассы клеточных стенок. Наибольшее количество фракции ТГЛ -II наблюдалось в каллусах, выращенных на среде с концентрацией сахарозы 5 %. Его содержание в образцах 15с и 15т превышало почти 2-2,5 раза образцы каллуса 14с и 14т. Каллусы, культивированные на среде с 5 % содержанием сахарозы и поливинилпироллидоном (16с и 16т), занимали промежуточное положение между образцами 14 и 15 по содержанию щелочерастворимого лигнина. В делящихся клетках (16с) его количество составляло 9,45 %, а в лигнифцированных (16т) - 17.7 %.
Таким образом, при увеличении концентрации сахарозы количество лигнина обеих фракций в клетках каллуса возрастает. Использование поливинилпироллидона для культивирования культур каллуса показало, что он положительно влияет на прирост биомассы, и при некоторых условиях, по-видимому, подавляет лигнификацию.
Количество высокомолекулярного лигнина также всегда превышает количество низкомолекулярного в 4-6 раз в зависимости от стадии онтогенеза клеток и условий культивирования.
Изменение условий лигнификации. Чтобы получить клетки с равномерным онтогенетическим развитием, была увеличена длительность выращивания каллуса примерно до-двух месяцев (образцы 19т-25т). Кроме того, частично изменяли состав питательной среды и условия освещенности. Образцы 11т и 19т культивировались в темноте, остальные - при 16 часовом световом дне. При культивировании обр. 24т в среду была добавлена феруловая кислота (0,5 ммоль/л). Образец 25т культивировался на среде с добавлением феруловой и аскорбиновой кислот.
Результаты анализа препаратов лигнина представлены на рис 30.
Данные показывают, что увеличение длительности выращивания приводит к повышению содержания обеих фракций лигнина в каллусных тканях. С увеличением длительности культивирования с 3 недель до 2 месяцев на одинаковой питательной среде (содержание сахарозы 5 %) количество низкомолекулярного лигнина в обр. 21т увеличивается на 43 %, а высокомолекулярного - на 11 % по сравнению с обр. 15т.
