Введение к работе
Актуальность темы.
Система гемостаза обеспечивает целостность кровеносной системы в организме человека. Выделяются три составляющих: тромбоцитарный гемостаз, плазменный гемостаз и сосудистый гемостаз. Все три составляющие необходимы для эффективного предотвращения кровопотери: агрегировавшие в месте повреждения тромбоциты обеспечивают прочность сгустка, образованная в результате работы плазменной системы свертывания фибриновая полимерная сеть скрепляет клетки и предотвращает просачивание жидкости, вазоконстрикция сосудов перераспределяет ток крови, уменьшая его в месте повреждения.
На данный момент хорошо изучены все компоненты системы свертывания с точки зрения биохимии - известны константы реакции, условия протекания реакций и др. Однако, так как система состоит более чем из 100 элементов, связанных между собой множеством реакций, сложно предсказать ее работу в целом и влияние на нее отдельных параметров. В медицинском аспекте это проявляется в том, что до сих пор неясно, почему, например, дефицит одного белка системы приводит к сильнейшей кровоточивости, а другого - остается незамеченным организмом. Более половины смертей в мире имеют в качестве непосредственной причины нарушения свертывания крови тромбозы или кровотечения. Поэтому изучение работы системы гемостаза является важной биофизической и медицинской задачей.
Система свертывания должна обладать пороговыми свойствами, чтобы избежать случайного возникновения тромбов и запускаться только в случае наличия повреждения. Под порогом по активации свертывания здесь и далее понимается минимальное ненулевое количество активатора свертывания, вызывающего образование фибринового сгустка. Существуют указания на такое свойство в системе свертывания крови (Kastrup et al. PNAS 2006; Pokhilko Thromb. Res. 2000; Okorie et al. Blood, 2008). Однако до сих пор не были проведены эксперименты, в которых зарегистрировали пороговые значения активатора свертывания. Во всех проведенных ранее исследованиях в образце цельной крови или плазмы без добавления активатора свертывания происходило формирование сгустка.
Пороговое поведение системы свертывания связывают с наличием в ней положительных обратных связей. Положительная обратная связь позволяет системе свертывания самостоятельно усиливать свою работу за счет того, что продукт реакции влияет на собственное производство. В системе свертывания основным таким регулятором является тромбин - последний фермент каскада реакций, превращающий растворимый белок фибриноген в нерастворимый полимеризующийся фибрин. Тромбин вступает в реакции, приводящие к еще большей наработке самого тромбина в
системе. В математических моделях, описывающих работу систем типа системы свертывания, активно изучается функция таких обратных связей. Показано, что они позволяют ускорить на порядки работу системы и обеспечить избирательную чувствительность системы к запускающему сигналу - свертывание начинается только при получении сигнала выше определенного уровня. Из клинических примеров хорошо известно, что отсутствие того или иного фактора системы свертывания, участвующего в своей положительной обратной связи, по-разному влияет на здоровье человека. Так, при тяжелой форме гемофилии А больные нуждаются в постоянном восполнении недостающего элемента системы свертывания, а при гемофилии С заболевание проявляет себя только при серьезных травмах. При этом степень кровоточивости не всегда коррелирует с уровнем дефицитного фактора, так что пациенты с одинаковым исходным уровнем фактора нуждаются в индивидуальном подборе терапии.
В данной работе изучались пороговые свойства системы свертывания человека и исследована роль положительных обратных связей в экспериментах in vitro с использованием математического моделирования. Целью работы являлось изучение пороговых свойств системы свертывания крови и роли положительных обратных связей активации факторов V (фУ), VII (фУП), VIII (фУШ) в активации свертывания и формировании фибринового сгустка в системе in vitro. Отличительной особенностью работы является исследование пороговых свойств в системах in vitro с различной пространственной организацией: активация свертывания в объеме (пространственно-однородная система), на поверхности и от единичных клеток (пространственно-распределенные системы). Пространственно-распределенная система свертывания in vitro имитирует рост сгустка от стенки сосуда. В такой системе реакции свертывания запускаются на поверхности с тканевым фактором (ТФ) и распространяются вглубь тонкого неперемешиваемого слоя плазмы. Поверхность с клетками, вызывающими свертывание крови, позволяет выяснить роль единичных клеток в формировании фибринового сгустка. Математическая модель системы свертывания позволила обнаружить вероятные элементы регуляции в системе и спроектировать эксперименты, проверяющие теоретические представления. Клинически наиболее актуальной частью работы было исследование влияния замещающей терапии фУШ при гемофилии А. Исследовалась корреляция пространственного роста сгустка с частотой кровотечений и уровнем фУШ.
Цель работы: Изучить пороговые свойства свертывания крови и роль положительных обратных связей в формировании фибринового сгустка в системе in vitro.
Задачи исследования: 1. Исследовать пороговые свойства при активации свертывания свободной от
тромбоцитов плазмы крови в пространственно-однородной системе.
Исследовать пороговые свойства при активации свертывания свободной от тромбоцитов плазмы крови в пространственно-распределенной системе при активации поверхностью с равномерно иммобилизованным тканевым фактором.
Сравнить формирование фибринового сгустка при активации свертывания от равномерно иммобилизованного на поверхности тканевого фактора и от клеток, экспрессирующих тканевый фактор.
Выявить роль положительных обратных связей в процессе активации и формирования фибринового сгустка.
Изучить динамику формирования сгустка у пациентов с гемофилией А при введении им фактора VIII.
Научная новизна. Показано существование порога в свободной от тромбоцитов плазме крови по концентрации ТФ (в пространственно-однородной системе) и плотности активатора на поверхности (в пространственно-распределенной системе). Впервые экспериментально измерена величина порога по активации свертывания. Показано, что положительная обратная связь активации фV тромбином позволяет системе свертывания осуществить быстрый переход из неактивного состояния к образованию плотного фибринового сгустка при небольших изменениях концентрации и плотности ТФ. При переходе от гомогенной постановки к пространственно-распределенной меняется вклад отдельных реакций в процесс свертывания плазмы крови. Впервые установлена зависимость параметров роста сгустка в пространстве от плотности и распределения ТФ. Показано, что рост сгустка зависит от локальной плотности активатора, а не от его количества. При этом даже единичный фибробласт -клетка с большой плотностью ТФ на мембране - способен эффективно активировать свертывание крови. Впервые экспериментально показана значимость положительной обратной связи активации фVII фактором Ха. В экспериментах с плазмой больных гемофилией А было показано, что при введении пациентам фЛ^Ш изменяются параметры роста сгустка в пространственно-распределенной системе. Динамика этих изменений, коррелирует с клиническим проявлением заболевания.
Научно-практическое значение. Полученные в работе данные о регуляции системы свертывания могут быть применены в области лечения и создания новых препаратов для пациентов с дефицитом факторов свертывания. В работе показано, что учет пространственных неоднородностеи в свертывании позволяет проводить оценку и подбор терапии при восполнении недостающих компонентов системы свертывания. Это позволяет поддерживать систему свертывания пациентов вблизи нормальных показателей свертывания на протяжении всего времени между двумя инъекциями препарата.
Положения, выносимые на защиту:
Система свертывания крови обладает порогом при активации тканевым фактором, равномерно распределенным по объему и по поверхности.
Тканевый фактор, сосредоточенный на пятнах, вызывает свертывание, а то же его количество, распределенное равномерно по поверхности - не вызывает свертывания.
Порог при активации свертывания в пространственно-однородной системе регулируется положительной обратной связью активации фУ тромбином, а порог по активации и чувствительность к распределению активатора в пространственно-распределенной системе регулируются положительными обратными связями активации фУ тромбином и фУП фактором Ха.
Скорость роста сгустка в пространстве коррелирует с клиническим течением гемофилии А.
Апробация работы. Работа прошла апробации: 12 апреля 2010 года на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН и 19 апреля 2010 года на заседании проблемной комиссии "Биохимия, биофизика и реология крови" в Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический Научный Центр РАМН.
Результаты диссертационной работы были представлены: Шестая ежегодная молодежная конференция ИБХФ РАН-вузы "Биохимическая физика" (Москва, Россия, Ноябрь 24-27 2006 г), III Всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, Россия, Февраль 1-3 2007 г), XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Женева, Швейцария, Июль 6-12 2007), Fouth International Symposium on Computation Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Method Resources (Moscow, Russia, September 1-5 2007), 11 Международная конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века"(Пушино, Россия, Октябрь 29 - Ноябрь 2 2007), II International Conference "Mathematical Biology and Bioinformatics" (Pushchino, Russia, September 7-13, 2008), XXII Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Бостон, США, Июль 11-16 2009).
Публикации. По материалы диссертационной работы опубликовано 10 научных работ. Статей в рецензируемых журналах - 1; публикаций в трудах конференций и съездов - 9
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов, главы 3 - описание экспериментальных результатов, главы 4 - обсуждения результатов), выводов и
библиографического указателя, включающего 240 источников. Работа выполнена на базе Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф., д.б.н. Атауллаханов Ф.И.) и Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией к.б.н. Пантелеев М.А.).
