Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Система гемостаза 12
1.2. Система свертывания крови 15
1.2.1. Биохимия свертывания крови 15
1.2.2. Формирование фибринового сгустка 15
1.2.3. Тромбин 18
1.2.4. Активация каскада свертывания 18
1.2.5. Ингибиторы свертывания 19
1.2.6. Кофакторы и мембранно-зависимые реакции 20
1.2.7. Доменная структура фактора VIII 21
1.2.8. Прочие петли положительной обратной связи 22
1.2.9. Путь протеина С 23
1.2.10. Контактная активагщя свертывания 23
1.2.11. Роль тромбоцитов в свертывании 24
1.2.12. Переключение активности тромбина 26
1.2.13. Взаимодействие свертывания с другими системами 29
1.2.14. Система свертывания — заключение 31
1.3. Механизмы активации тромбоцитов 32
1.3.1. Активаторы тромбоцитов и типы тромбоцитарных ответов 33
1.3.2. Рецепторы 35
1.3.3. Пути сигнализации в тромбоцитах 36
1.3.4. "Укутанные" тромбоциты 38
1.3.5. Механизмы активации тромбоцитов — заключение 39
1.4. Экспериментальные модели и методы исследования свертывания крови 40
1.4.1. Особенности свертывания in vivo и их исследование in vitro 40
1.4.2. Экспериментальные модели свертывания in vivo 43
1.4.3. Ex vivo 45
1.4.4. In vitro: классические 46
1.4.5. In vitro: учет пространственной неоднородности и потока 51
1.4.5. Экспериментальные модели — заключение 53
1.5. Математические модели свертывания крови 53
1.5.1. Классификация математических моделей 53
1.5.2. Упрощенные и феноменологические модели 55
1.5.3. Детальные модели 59
1.5.4. Модели свертывания крови -заключение 65
1.6. Методы анализа сложных систем ферментативных реакций 66
1.6.1. Классификация методов теоретической системной биологии 66
1.6.2. Методы исследования стационарных систем 68
1.6.3. Методы исследования нестационарных систем 70
1.6.4. Методы анализа - заключение 72
1.7. Постановка задачи 72
ГЛАВА 2. Материалы и методы 74
2.1. Теоретические методы 74
2.1.1. Математическая модель свертывания крови 74
2.1.2. Допущения модели 74
2.1.3. Построение модели 77
2.1.4. Численные методы для точечной модели 77
2.1.5. Численные методы для реакционно-диффузной модели 78
2.2. Экспериментальные методы 79
2.2.1. Анализ тромбоцитарных субпопуляций 79
2.2.2. Сборка комплекса внутренней теназы 81
2.2.3. Пространственная динамика свертывания крови 83
2.2.4. Кинетика генерации фибрина в точечной системе 84
ГЛАВА 3. Результаты 85
3.1. Порог по активации в свертывании крови 85
3.1.1. Выявление модулей и редукция: метод 85
3.1.2. Идентификация подзадач и выходных параметров в системе свертывания... 87
3.1.3. Анализ чувствительности в применении к начальной кинетике свертывания.. 89
3.1.4. Чувствительность и необходимость: возможные ошибки 94
3.1.5. Сравнение полоз/сителъных обратных связей в системе свертывания 95
3.1.6. Шаг А: удаление несущественных переменных и реакций 96
3.1.7. Шаг Б: редукция модели с использованием временной иерархии процессов 99
3.1.8. Исследование редуцированной системы 106
3.1.9. Исследование полной модели 111
3.1.10. Механизм переключения в системе свертывания 113
3.1.11. Заключение 119
3.2. Субпопуляции тромбоцитов и регуляция мембранно-зависимых реакций свертывания 120
3.2.1. Связывание компонентов внутренней теназы с тромбоцитами 120
3.3.1. Механизм сборки комплекса внутренней теназы 129
3.3.2. Математическое моделирование комплекса внутренней теназы 141
3.2.1. Регуляция внутренней теназы протеином S 166
3.2.2. Заключение 169
3.3. Роль внутреннего пути в пространственной динамике свертывания 170
3.3.1. Роль внутренней теназы в пространственной динамике свертывания крови 170
3.3.2. Роль фактора XI в пространственной динамике свертывания крови 172
3.3.3. Остановка роста сгустка путем протеина С 775
3.3.6. Заключение 175
3.4. Регуляция внешней теназы и ее роль в активации свертывания 178
3.4.1. Регуляция внешней теназы ингибитором пути тканевого фактора 178
3.4.2. Влияние ингибитора пути тканевого фактора на пространственную динамику роста сгустка 183
3.4.3. Заключение 184
3.5. Практические приложения исследований по регуляции динамики свертывания крови 184
3.5.1. Пространственная динамика свертывания крови при гемофилии A: Koate DVI 184
3.5.2. Пространственная динамика свертывания при гемофилии А: Агемфил А 186
3.5.3. Механизм действия активированного фактора VII 188
3.5.4. Заключение 193
ГЛАВА 4. Обсуждение 194
Выводы 199
Благодарности 201
Список литературы 203
- Активаторы тромбоцитов и типы тромбоцитарных ответов
- Классификация методов теоретической системной биологии
- Шаг Б: редукция модели с использованием временной иерархии процессов
- Регуляция внешней теназы ингибитором пути тканевого фактора
Введение к работе
Актуальность темы. Свертывание крови представляет собой сложную сеть ферментативных реакций, основой которой служит каскад последовательно активирующих друг друга сериновых протеиназ, охваченный многочисленными петлями положительных и отрицательных обратных связей (Рис. 1). Его основная задача заключается в предотвращении потери крови при повреждениях сосудистой системы.
Нарушения работы системы свертывания крови являются, прямо или косвенно, лидирующей причиной смертности и инвалидности в современном мире. Их диагностика и коррекция затруднены сложностью этого процесса, в котором задействованы десятки белков, взаимодействующих в сотнях реакций друг с другом, с клетками крови и сосудистой стенкой. Кроме того, свертывание крови является пространственно неоднородным процессом, в котором большую роль играют диффузия реагентов и перенос их кровотоком.
Препятствием для создания более совершенных методов диагностики и терапии свертывания оказывается плохое понимание его регуляции. В связи с этим представляется актуальным изучение того, как устроена система свертывания крови, и каков вклад каждого из ее компонентов в общую динамику процесса.
Рис. 1. Основные реакции плазменной системы свертывания крови. Реакции активации и инактивации факторов свертывания показаны односторонними тонкими черными стрелками. При этом фигурные стрелки показывают под действием каких именно ферментов происходит эта активация или инактивация. Обратимые реакции формирования комплексов показаны двусторонними тонкими черными стрелками. Чтобы избежать перегруженности, на схеме не показаны: связывание тромбина с тромбомодулином, активация и секреция тромбоцитов, контактная активация свертывания.
Еще на самых ранних этапах исследования свертывания появлялись гипотезы о возможных причинах его каскадного устройства (Levine, Science 1966; 152: 651-653). В последние десятилетия на пути к его пониманию было сделано несколько принципиальных шагов. В основополагающих теоретических работах М.А. Ханина и сотрудников (J Theor Biol 1989; 136: 127-134) показана роль положительных обратных связей в формировании
порогов в ферментативных каскадах. Другая их функция, регуляция пространственного распространения свертывания, предложена в серии теоретических и экспериментальных работ Ф.И. Атауллаханова и сотрудников (Биофизика 1994; 39: 97-106; Thromb Res 1996; 84: 333-344; Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 45-57). Третье возможное следствие наличия положительных обратных связей, пороговый ответ по скорости кровотока, предсказывалось Э. Белтрами и Дж. Джести (Math Biosci 2001; 172: 1-13).
Однако, до настоящего момента не предпринималось попыток целиком проанализировать и понять структуру каскада свертывания, систематически и с единых позиций изучить функции его частей. Кроме того, почти все перечисленные результаты предсказаны с помощью сильно упрощенных математических моделей, и предсказания разных исследователей во многом противоречат друг другу в зависимости от того, какие реакции включались в такие модели. За редким исключением (Ovanesov et al, Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 45-57), эти гипотезы не проверены на детальных моделях или в эксперименте.
Далее, арсенал современных методов системной биологии не содержит стандартных способов анализа сетей реакций, подобных свертыванию. Существуют хорошо разработанные подходы — такие, как анализ метаболического контроля или теория биохимических систем, — для линейных, стационарных, точечных систем реакций. Однако, методология исследования пространственно-неоднородных и нестационарных систем разработана значительно хуже.
Таким образом, в настоящий момент существует актуальная проблема исследования регуляции свертывания крови, решение которой осложняется отсутствием подходящих системно-биологических подходов.
Цель работы: Выявление и анализ механизмов регуляции свертывания крови.
Задачи исследования:
1. Построение детальной математической модели свертывания крови.
2. Экспериментальное исследование кинетики отдельных реакций и блоков системы
свертывания для тестирования модели.
Выявление в каскаде свертывания крови функциональных подсистем и их ролей.
Применение полученных результатов к исследованию методов диагностики нарушений свертывания и механизмов действия лекарственных препаратов.
Научная новизна. Разработана методика анализа сложных сетей биохимических реакций, основанная на применении функционально-ориентированного анализа чувствительности в комбинации с анализом временной иерархии процессов в системе. Построена математическая модель свертывания крови, превосходящая существующие аналоги полнотой и корректностью описания биохимических реакций и успешно прошедшая тестирование сравнением с большим набором экспериментальных данных. С их использованием выявлен механизм и динамика порогового поведения системы свертывания крови. Экспериментально показана новая роль фактора VIII в регуляции доставки субстрата к ферменту в комплексе внутренней теназы. Впервые построена механизменная модель мембранно-зависимой реакции, катализируемой комплексом внутренней теназы. Обнаружена что петля положительной обратной связи, обусловленная активацией фактора V тромбином, формирует триггерный ответ в системе свертывания. Выявлен механизм, с помощью которого внутренняя теназа регулирует пространственную динамику свертывания крови. Теоретически предсказана и экспериментально обнаружена локализация пространственного роста тромба in vitro', показано, что она определяется путем протеина С.
Установлено преимущественное связывание компонентов внутренней теназы с малой субпопуляцией, формирующейся при активации тромбоцитов. С помощью математического моделирования выявлен новый режим регуляции внешнего пути ингибитором пути тканевого фактора. С помощью теоретических и экспериментальных исследований влияния препаратов Агемфил А, Коэйт DVI, НовоСэвен на динамику свертывания крови пациентов с гемофилией A in vitro установлены зависимости их эффективности от дозы, выявлены механизмы действия, предложены стратегии по оптимизации терапии. Показано, что в системе свертывания крови могут быть идентифицированы шесть функциональных модулей и соответствующих им физиологических задач, выполняемых системой.
Научно-практическое значение. Разработанные в работе методы и построенные математические модели могут быть использованы в качестве инструментов для теоретического исследования биохимии, биофизики, фармакологии как свертывания крови, так и других сетей ферментативных реакций, а также для планирования и анализа экспериментов. Выявленные механизмы отдельных реакций свертывания крови и взаимодействия факторов системы свертывания с фосфолипидными везикулами и активированными тромбоцитами могут быть использованы для создания новых про- и антикоагулянтов. Полученные результаты по регуляции динамики свертывания крови могут быть использованы для создания новых методов диагностики нарушений гемостаза и фармакологического воздействия на систему свертывания.
Основные положения, выносимые на защиту:
1) Разработанная методика анализа сложных сетей биохимических реакций, основанная на
применении функционально-ориентированного анализа чувствительности в комбинации с
анализом временной иерархии процессов в системе, позволяет выявить в каскаде
свертывания крови функциональные подсистемы и их роли.
2) Построенная детальная математическая модель свертывания крови превосходит
существующие аналоги корректностью описания биохимии свертывания и
согласованностью с экспериментальными данными.
Фактор Villa регулирует формирование комплекса внутренней теназы посредством формирования мембранного-зависимого комплекса с фактором X и доставки фактора X к ферменту.
Активация тромбоцитов крови тромбином ведет к формированию двух субпопуляций активированных тромбоцитов, одна из которых способна кальций-зависимым образом специфически связывать компоненты внутренней теназы.
Активация фактора V тромбином, внутренний путь свертывания крови и путь протеина С формируют в системе свертывания крови триггерный ответ, способность к пространственному распространению и к локализации, соответственно.
Апробации работы. Работа прошла апробации: 22 июля 2009 г. на заседании семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН и Гематологического научного центра РАМН, 3 августа 2009 г. на заседании семинара "Молекулярное моделирование и разработка биологически активных соединений" Научно-исследовательского вычислительного центра МГУ им М.В. Ломоносова, 16 сентября 2009 г. на заседании проблемной комиссии №6 «Биохимия, биофизика и реология крови» ГУ Гематологического научного центра РАМН, 23 октября 2009 г. на заседании семинара Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.
Материалы диссертации доложены автором на следующих конференциях и съездах: конференция "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 24-26 октября 2001 г.; VII-я национальная конференция "Новое в изучении патогенеза, диагностике, профилактике и лечении патологии гемостаза", Москва, 27-29 марта 2002 г.; 1-й Всероссийский съезд гематологов. Москва, 16-18 апреля 2002 г.; Gordon Research Conference on Proteolytic Enzymes & Their Inhibitors, New London, USA, July 7-12, 2002; Vth International Congress on Mathematical Modeling, Dubna, Moscow Region, September 30-October 6, 2002; конференция "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 11-14 ноября 2002 г.; 1-я Всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", Москва, 5-6 февраля 2003 г.; 48th Annual Meeting of the Biophysical Society, Baltimore, USA, February 14-18, 2004; Workshop 'Mathematical models and methods in biology and medicine', Bedlewo, Poland, May 29 - June 3, 2005; 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference 'The Protein World', Budapest, Hungary, July 2-7, 2005; XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Geneva, Switzerland, July 6-12, 2007; Workshop on 'Modelling of Blood Diseases', Lyon, France, 5-9 Nov 2007; Gordon Research Conference on Haemostasis, Waterville Valley, USA, June 29-July 4, 2008; 3rd Workshop on Algorithms in Bioinformatics, Moscow, October 7-9, 2008; XXIInd Congress of International Society on Thrombosis and Haemostasis, Boston, USA, July 11-16, 2009.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 66 работ, в том числе 26 статей в реферируемых научных изданиях и 40 работ в материалах конференций и съездов.
Личное участие автора в получении результатов. Автором разработана методика исследования сложных сетей биологических реакций; выполнены все представленные в работе экспериментальные и теоретические исследования отдельных реакций свертывания; построена математическая модель и созданы программы для ее решения; осуществлено ее тестирование, исследование, и проведены все представленные расчеты; выполнены эксперименты по влиянию препаратов фактора VIII на пространственную динамику свертывания крови.
Обьем и структура диссертации. Диссертация изложена на 266 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и библиографического указателя, включающего 407 источников, приложений.
Активаторы тромбоцитов и типы тромбоцитарных ответов
Активация и регуляция функций тромбоцитов осуществляется с помощью сети реакций внутриклеточной сигнализации, намного превосходящей своей сложностью каскад свертывания крови. Эти каскады сигнализации изучены не очень хорошо [99]. На настоящий момент можно с уверенностью предположить, что нам известно большинство активаторов тромбоцитов, их рецепторов, а также принципиальные вторичные мессенджеры и начальные участки каскадов внутриклеточной сигнализации. На этом наше знание заканчивается: такие вторичные мессенджеры, как кальций и цАМФ, способны воздействовать на сотни зависящих от них белков, делая картину процессов, происходящих внутри тромбоцита, исключительно сложной. Звенья сигнализации, лежащие между этими мессенджерами и эффекторами тромбоцитарного ответа, пока еще не выявлены сколько-нибудь удовлетворительным образом [98,123].
Краткое описание тромбоцитов и их участия в свертывании можно найти выше, в разделе 1.2.11. В настоящем же разделе мы рассмотрим более подробно, как тромбоциты отвечают на активацию, какие существуют активаторы, и какие рецепторы и внутриклеточные сигналы управляют процессом активации. Кроме того, мы более детально остановимся на формировании тромбоцитарпых субпопуляций и его возможных последствиях для системы свертывания крови. Процесс активации тромбоцитов ассоциируется с рядом феноменов, которые могут проявляться в зависимости от силы активации [2]. Если перечислять основные ответы тромбоцитов в порядке усиления, то это будут: 1) Изменение формы. Неактивированные тромбоциты имеют дисковидную форму, которая поддерживается с помощью тубулинового кольца вдоль экватора клетки, мембранной цитоскелетной сети и внутреннего актинового цитоскелета [124]. Активация ведет к перестройке цитоскелета и, в частности, к разрушению тубулинового кольца. Тромбоциты становятся шарообразными и выпускают псевдоподии. 2) Адгезия. Тромбоциты, даже неактивированные, способны взаимодействовать с коллагеном сосудистой стенки как напрямую через гликопротеин VI или интегрин агРь так и опосредованно через фактор Виллебранда и гликопротеин Ib/IX/V или интегрин «пьРз [99]. Однако, в отсутствие активации такое связывание обратимо. В результате же активации тромбоциты приобретают способность необратимо связываться с поврежденной стенкой сосуда, в первую очередь, с волокнами коллагена и другими компонентами внеклеточного матрикса. 3) Агрегация. Тромбоциты также приобретают способность прочно связываться друг с другом через мостики, образуемые молекулами фибриногена, фактора Виллебранда или фибронектина между рецепторами, интегринами ацьРз, на соседних тромбоцитах [90]. 4) Секреция. Одним из важных процессов при активации является выброс многочисленных активных веществ, влияющих на активацию самих тромбоцитов, плазменную систему свертывания и сосудистую стенку. Существует несколько главных путей секреции [125]. Тромбоциты содержат несколько типов гранул, несущих в себе вещества, высвобождаемые при активации. В частности, плотные гранулы содержат АДФ, важный активатор тромбоцитов, а альфа-гранулы содержат большое количество фактора V в частично активной форме. Активация тромбоцитов ведет к синтезу тромбоксана А2 в цитоплазме, который затем выходит тромбоцитов сквозь мембраны, вызывая активацию тромбоцитов и вазоконстрикцию. Наконец, ряд цитоплазменных белков (такие, как тромбоцитарный фактор XIII) выходят из тромбоцитов посредством неизвестных пока механизмов [126]. Важно подчеркнуть, что различные типы секреции могут требовать активации различной силы. 5) Экспрессия фосфатидилсершга и рецепторов к факторам свертывания. Формирование прокоагулянтной активности является одним из самых сильных типов тромбоцитарного ответа и индуцируется только достаточно мощными активаторами, такими, как тромбин или коллаген [89,108]. Мембрана неактивированных тромбоцитов асимметрична: отрицательно заряженные фосфолипиды, такие как фосфатидилсерин, сосредоточены на внутреннем слое клеточной мембраны. Эта асимметрия нарушается при активации. Более детально этот процесс и его последствия для свертывания рассмотрены выше в разделе 1.2.11. Переходя к активаторам тромбоцитов, они обычно подразделяются на сильные (тромбин и коллаген) и слабые (АДФ и тромбоксан А2). Эти активаторы действуют через разные рецепторы и часто используют различные сигнальные пути [99]. Поэтому разница между ними является качественной: никакое количество слабого активатора не может вызвать такой ответ, какой вызывает сильный активатор. Данная классификация не является жесткой, и для разных ответов сила активаторов различна. Например, тромбоксан А2 способен вызвать секрецию плотных гранул, а АДФ неспособен; однако, тромбоксан не оказывает никакого влияния на образование прокоагулянтной поверхности, а АДФ оказывает, являясь важным кофактором тромбина [127,128]. 1) Коллаген. Коллаген представляет собой фибриллярный белок, являющийся важнейшим компонентом внеклеточного матрикса. Существует несколько типов коллагена, значительно отличающихся по своей способности активировать тромбоциты [129]. Коллаген играет критически важную роль в начальной стадии формирования тромбоцитарного тромба: он обнажается при повреждении сосуда и служит подложкой, на которой происходит адгезия тромбоцитов. В некотором роде, эта его функция аналогична функции тканевого фактора в плазменной системе свертывания. Коллаген является одним из сильнейших активаторов тромбоцитов, вызывая практически все виды тромбоцитарного ответа, вплоть до появления прокоагулянтной активности [130]. 2) Тромбин. Глобулярный белок, формирующийся из протромбина в ходе активации системы свертывания, тромбин был в деталях рассмотрен выше. Наряду с выполнением многочисленных функций в каскаде плазменного свертывания, тромбин является важнейшим активатором тромбоцитов [99]. Он также способен вызывать все виды тромбоцитарных ответов; в комбинации с коллагеном, он способен вызвать максимально мощную активацию. 3) АДФ. При повреждении сосуда этот адениновый нуклеотид может появляться из двух источников: выходить из разрушенных клеток и секретироваться из плотных гранул тромбоцитов при активации. Он также может получаться из АТФ (также выходящего из разрушенных клеток и плотных гранул) под действием нуклеотидаз, присутствующих в плазме и на мембранах клеток крови. АДФ не способен самостоятельно вызвать секрецию плотных гранул или прокоагулянтный ответ, однако вносит значительный вклад в прокоагулянтный ответ, вызванный иными активаторами [127]. 4) Тромбоксан А2. Тромбоксан представляет собой нестабильную производную арахидоновой кислоты, синтезирующуюся в тромбоцитах при активации [131]. Его физиологическое действие включает как активацию тромбоцитов, так и вазоконстрикцию. Он считает слабым агонистом по сравнению с АДФ, однако, в отличие от АДФ, способен вызывать секрецию плотных гранул. 5) Менее важные активаторы. Многие вещества и воздействия способны вызывать активацию тромбоцита; например, сдвиговое напряжение [132]. К числу таких слабых активаторов причисляются такие вещества, как адреналин [99]. Скорее всего, в норме он не способен вызвать активацию тромбоцитов в одиночку, так как для этого требуются концентрации намного большие, чем обычно достигаются в организме. Тем не менее, адреналин и другие слабые активаторы могут модулировать ответ тромбоцита, например, снижая порог активации для более сильных агонистов.
Классификация методов теоретической системной биологии
Наиболее общим методом исследования математических моделей любого рода для систем любого типа и уровня сложности, является анализ чувствительности [30,267]. В его основе лежит та же базовая идея, что и в АМК: изменяя параметры системы и наблюдая за ее ответом, можно сделать полезные выводы о роли различных компонентов системы в ее регуляции, о важности и неважности этих компонентов, о существенности или несущественности параметров с плохо определенными значениями.
В отличие от АМК, в анализе чувствительности существует множество способов определения коэффициентов чувствительности в зависимости от стоящей задачи: это могут быть простые производные; это могут быть производные, нормированные на среднее значение (как в уравнениях 1.2 и 1.3); или же на среднеквадратичное отклонение. Для нестационарных систем вводятся динамические, зависящие от времени коэффициенты чувствительности [31,32]. Кроме того, обобщенный анализ чувствительности допускает возмущение более чем одного параметра одновременно, позволяя выявлять взаимодействие и корреляцию между различными компонентами системы [268]. Наконец, в общем случае анализ чувствительности не ограничивается локальными возмущениями и коэффициентами-производными, а исследует поведение системы во всем диапазоне возможных значений параметров [30].
Ахиллесовой пятой метода является сама его общность: на настоящий момент не существует его вариантов, предназначенных для биологических реакционных сетей [30,268].
Вторым общим методом исследования сложных систем является редукция — упрощение исходной сложной математической модели, уменьшающее ее размер, но сохраняющее основные свойства системы [186]. Существуют две стратегии редукции, применимые к сложным системам произвольной природы: 1) Выявление несущественных компонентов системы (например, с помощью анализа чувствительности) и последующее их отбрасывание [269]. 2) Определение характерных времен для всех переменных в системе и разделение их на группы по этому признаку, выявление временной иерархии процессов в системе [270]. В своем наиболее строгом виде эта процедура опирается на теорему Тихонова [271,272] и включает в себя обезразмеривание системы, выделение малых параметров при старшей производной и разделение переменных на группы в зависимости от величин малых параметров. Для каждой группы со своим характерным временем можно считать, что более медленные переменные являются константами, в то время как более быстрые процессы (при соблюдении ряда условий) достигают квазистационарного состояния; и тогда для более "медленной" шкалы времени они описываются не дифференциальными, а алгебраическими уравнениями [273]. В идеальном случае большая система может быть редуцирована до 2-3 дифференциальных уравнений, которые гораздо проще анализировать. Важно отметить, что ценными дополнительными инструментами в редукции могут быть замена или группировка переменных; применение теоремы Тихонова к таким новым переменным может оказаться особенно удобным [186].
Кроме этих универсальных подходов, существуют некоторые специальные способы редукции, применимые только к сложным биологическим сетям особого вида: например, предназначенные для борьбы с комбинаторной сложностью, возникающей в системах внутриклеточной сигнализации из-за присутствия белков со множественными сайтами связывания [274].
Еще один способ борьбы со сложностью биологических систем — выявление в них функциональных и структурных модулей [28,275]. Вообще говоря, нет никакой гарантии, что в произвольной сложной системе в принципе возможно выделить сколько-нибудь изолированные подсистемы. Скорее наоборот, когда мы видим сложную многосоставную химическую реакцию небиологической природы, наподобие реакции Белоусова-Жаботинского, мы не вправе ожидать существования в ней модульности или иерархической структуры. Однако, сложные биологические системы принципиально отличаются от сложных систем, изучаемых в химии или физике [29,186]. Они предназначены для выполнения четко определенных функций и задач, они не образовались случайно, а являются плодом сотен миллионов лет эволюции и жесточайшего отбора (например, система свертывания почти полностью сформировалась более полумиллиарда лет назад и с тех пор почти не изменялась). И потому мы вправе ожидать, что такие системы будут устроены не случайным, а закономерным образом; и, действительно, некоторые примеры детального исследования иерархической структуры в полиферментных системах уже стали классическими [29,276].
Гипотеза о модульности в биологии пока что не поднялась в ранг теории [28], несмотря на огромный опыт наблюдения модульной структуры на всех уровнях организации биологических систем, от белков до органов и даже за пределами этого диапазона [276]. Одна из фундаментальных проблем здесь связана с тем, что у биологической модульности пока нету убедительного объяснения: подавляющее большинство математических моделей эволюционного процесса дают решения, не имеющие модульной структуры [277]. В последнее время было предложено несколько интересных сценариев происхождения модульности, таких как ее эволюционное преимущество при адаптации к новым задачам и занятии новых экологических ниш [278], при изменениях окружающей среды [277,279,280].
Отсутствие общепринятого теоретического объяснения не мешает модульной концепции успешно использоваться в решении задач по исследованию конкретных систем, в том числе на уровне полиферментных систем. Во многих работах в таких системах пытаются выделить модули с определенными функциями — "сенсоры", "переключатели", "осцилляторы", "эффекторы" [33,281]. У модульного анализа есть несколько важных достоинств: он, как сейчас предполагается, применим к практически неограниченному кругу биологических систем; он ориентирован на фундаментальную особенность, отличающую биологические системы от не-биологических; он интуитивно понятен и позволяет выразить результаты работы в удобном для восприятия и использования виде. Но пока что на его пути есть труднопреодолимое препятствие: не существует универсального, объективного и простого способа выделить модули в большой системе [33,281].
В настоящий момент существует значительное количество подходов для исследования стационарных биологических систем, но мало эффективных методов для исследования систем нестационарных и тем более пространственно неоднородных. До некоторой степени, в их исследовании могут быть использованы анализ чувствительности и редукция. Однако, в той же системе свертывания несущественных компонентов нету: за пять десятилетий ее интенсивного исследования, все несущественные компоненты уже были отброшены на основании экспериментальных исследований и клинических данных. Теорема Тихонова в общем случае неприменима к пространственно-неоднородным системам; кроме того, как будет обсуждаться ниже, в системе свертывания сразу много переменных имеет примерно одно и то же характерное время; и полноценная редукция по Тихонову оказывается неэффективной. Таким образом, мы приходим к необходимости разработать стратегию анализа сложных биологических систем, способную преодолеть указанные недостатки.
Шаг Б: редукция модели с использованием временной иерархии процессов
В данном разделе мы получили два важных результата. Во-первых, был разработан метод анализа сложных сетей ферментативных реакций. Во-вторых, применение этого метода к свертыванию крови позволило выявить положительную петлю обратной связи с участием фактора V как основной регулятор переключения в системе свертывания.
Основная идея метода основана на очевидном принципе: Если реакция/реактант А оказывает влияние на ответ системы Б, то А вносит вклад в выполнение задачи Б . Наша поправка этого утверждения звучит ...тогда А является частью модуля, ответственного за задачу Б .
Для того, чтобы сделать такую поправку, мы должны допустить, что сложные биологические сети могут быть представлены в виде комбинации модулей, каждый из которых ответственен за свою подзадачу. Несмотря на то, что в целом такое представление еще остается гипотезой, оно подкрепляется многочисленными работами как в области исследований свертывания [11,15,84,174,291], так и в системной биологии в целом [33,281]. Новизной в нашем утверждении является использование функционально-ориентированного анализа чувствительности и редукции временной иерархии для выявления этих модулей и упрощения модели.
Тот факт, что фактор V регулирует переключение в системе свертывания, хорошо согласуется с представлениями, что положительные обратные связи играют ведущую роль в создании взрывных ответов в свертывании [6,20,21], а также с их давно доказанной ролью в создании разного рода переключателей [305]. Наша работа добавляет к этому следующее: 1) выявление конкретной формы этого переключения; 2) выявление конкретной обратной связи, ответственной за феномен; 3) экспериментальное подтверждение.
Важная разница между нашими исследованиями и предыдущими заключается в том, что положительная обратная связь приводит к сигмоидальному ответу системы, но не генерирует "истинный" переключатель в виде параметрической бифуркации или бистабильности. Это связано с различием в допущениях модели. Предыдущие исследователи этого вопроса предполагали, что запускающий сигнал свертывания не убывает, но фактор Va быстро ингибируется в реакции первого порядка [6,22,53]. Напротив, мы считаем, что внешняя теназа ингибируется, а фактор Va аккумулируется: это и учет потребления предшественников активных факторов приводят к тому, что ноль остается единственным стационарным состоянием в редуцированной модели, где оставлена только одна положительная петля обратной связи.
Ключевые реакции свертывания крови требуют отрицательно заряженных фосфолипидных мембран, которые обеспечивают оптимальную взаимную ориентацию и переносят взаимодействие ферментов, субстратов, кофакторов из трехмерного пространства в двухмерное (т.н. редукция размерности) [108]. В число таких реакций входят активация фактора X внешней [306] и внутренней [66] теназами, активация протромбина протромбиназой [307], активация факторов V, VII, VIII фактором Ха [64,74,308], активация фактора XI тромбином [183] и другие. В присутствии фосфолипидов скорости этих реакций могут ускоряться до 100000 раз [309]. Несмотря на то, что в определенных условиях могут выступать липопротеины плазмы [61,310-312], а также почти любые клетки крови и сосудистой стенки [92,313] могут поддерживать реакции свертывания, основным физиологическим источником прокоагулянтных фосфолипидов в нормальном гемостазе считаются активированные тромбоциты крови [39,89,182].
Для того, чтобы построить достоверную детальную модель свертывания для решения задач данной работы, нам необходимо было разработать математические модели отдельных реакций; и в этом отношении самым сложным было моделирование мембранно-зависимых реакций. Их механизмы довольно плохо изучены, и математические модели ранее создавались только для некоторых из них. Чтобы решить эту проблему, нам пришлось провести серию теоретических и экспериментальных исследований регуляции этих реакций, прежде всего, активации фактора X внутренней теназой. Именно она описана в данной подглаве.
В общей логике настоящей работы данный раздел относится к задаче 2 (построение математической модели); тем не менее, его сложность и объем вынудили нас вынести его в отдельную подглаву.
Формулировка задачи. Связывание факторов свертывания с тромбоцитами является первым шагом во всех мембранно-зависимых реакциях, так что его знание совершенно необходимо для любого последующего анализа их механизмов и регуляции. В частности, связывание компонентов внутренней теназы с тромбоцитами было предметом ряда исследований, использующих радиоактивно меченные факторы свертывания [238-240,314-317] или же проточную цитометрию тромбоцитов, проинкубированных с белками и флуоресцентно меченными антителами к ним [101,102,126,142,179,318]. Результаты этих экспериментов противоречивы, и вопрос о гетерогенности тромбоцитов по отношению к связыванию факторов свертывания по-прежнему остается открытым.
Чтобы разрешить этот вопрос, мы исследовали связывание компонентов внутренеей теназы с тромбин-активированными тромбоцитами в широком диапазоне концентраций тромбина. Чтобы избежать возможной потери феномена субпопуляций по причине нестабильности прокоагулянтной активности тромбоцитов [297], связывание флуоресцеин-меченных факторов свертывания с активированными тромбоцитами измерялось напрямую с помощью проточной цитометрии.
Тромбоцитарные субпопуляции при активации тромбином различаются по связыванию факторов свертывания и аннексина V. Тромбоциты активировались увеличивающимися концентрациями тромбина (0-100 нМ), и их прокоагулянтная поверхность далее характеризовалась по связыванию флуоресцентно меченных факторов X, VIII, 1Ха или АС-меченного аннексина V (маркера, связывающегося с фосфатидилсерином) с помощью проточной цитометрии. В присутствии факторов свертывания (Рис. 3.12) или аннексина V (см. ниже) наблюдались две четко различимые субпопуляции активированных тромбоцитов.
В контрольных экспериментах в отсутствие кальция, где использовался EDTA в концентрации 10 мМ, наблюдалась только субпопуляция тромбоцитов с низким связыванием (данные не показаны), в соответствии с предыдущими работами для фактора 1Ха[101].
Характеристики субпопуляций. Рис. 3.13 А показывает долю тромбоцитов с повышенным связыванием факторов свертывания и аннексина V как функцию концентрации тромбина. Высокосвязывающая субпопуляция тромбоцитов для каждого лиганда составляла примерно один и тот же процент от полной популяции тромбоцитов при каждой концентрации тромбина, достигая 4% при 100 нМ тромбина. Несмотря на то, что две субпопуляции отчетливо наблюдались в широком диапазоне концентраций активатора, последующие эксперименты проводились при концентрации 100-200 нМ тромбина, чтобы получить достаточное количество (несколько сотен) высокосвязывающих событий в каждом анализе.
Определение количества молекул каждого фактора, в среднем связывающихся с тромбоцитом, дало 15000-25000 молекул на тромбоцит для высокосвязывающей субпопуляции и 1500-2000 молекул на тромбоцит для низкосвязывающией субпопуляции при 100 нМ тромбина (Рис. 3.13Б).
Регуляция внешней теназы ингибитором пути тканевого фактора
Физиологическое свертывание крови является пространственно неоднородным. Поэтому для понимания его регуляции необходимо использовать реакционно-диффузные экспериментальные системы. Переход от гомогенных моделей гемостаза к пространственным способен внести коррективы в представления о ролях реакций каскада свертывания. Чтобы проанализировать вклады различных реакций свертывания в пространственное формирование сгустка, была использована математическая модель, развитая в данной работе. Модель не только позволила сделать предсказания экспериментов и проанализировать их результаты, но также смогла визуализировать изменения в распределении активности факторов свертывания и проанализировать их вклад в динамику свертывания.
Чтобы проанализировать роль обратных связей в формировании сгустка, было проанализировано свертывание в плазмах, дефицитных по факторам VIII и XI. Формирование сгустка определяется тромбином, а лимитирующим компонентом протромбиназы является фактор Ха. Он, в свою очередь, может быть произведен либо внешней теназой (комплекс VIIaF) на активирующих клетках, либо внутренней теназой (комплекс IXa-VIIIa) на активированных тромбоцитах или тромбоцитарных микровезикулах в плазме. Фактор 1Ха, ферментативный компонент внутренней теназы, формируется либо внешней теназой, либо фактором ХІа в плазме. В плазме, дефицитной по фактору XI, эта последняя реакция отсутствует, а в плазме, дефицитной по фактору VIII, внутренний путь отсутствует целиком. Формирование сгустка в ней инициировалось нормально, но распространение было нарушено. Модель объясняет это явление, показывая, что фактор Ха, сделанный внешней теназой, запускает свертывание, но не уходит далеко от активатора, в то время, как фактор Ха, активированный по внутреннему пути, поддерживает пространственное распространение свертывания. Напротив, отличия дефицитной по фактору XI плазмы от нормы проявляются только на поздних стадиях роста сгустка. Модель показывает, что фактор ГХа производится в основном внешней теназой и доставляется в плазму диффузией. Однако, при формировании больших сгустков, дополнительная активация фактора ГХа фактором Х1а играет значительную роль. Она может быть еще более важной в условиях тромбоцитарного сгустка in vivo, поскольку эта реакция ускоряется тромбоцитами.
Эти результаты предполагают, что факторы 1Ха и Ха играют разные роли в свертывании: фактор Ха, сделанный внешней теназой, требуется для запуска свертывания, но не может добраться до тромбоцитов, чтобы сформировать протромбиназу, из-за его ингибирования в плазме. Напротив, фактор ГХа ингибируется медленно и может диффундировать к тромбоцитам и производить там фактор Ха; дополнительный фактор ГХа делается прямо на тромбоцитах фактором Х1а. Наше исследование добавляет концепцию физического расстояния как регулятора этих процессов. В нашей модели, формирование сгустка около активатора (-0.2 мм) определялось внешней теназой, а дальнейшее формирование Ха требовало внутренней теназы. Однако, эта внутренняя теназа формировалась с участием фактор ГХа, сделанного внешней теназой. Только на расстоянии более —0.8 мм от активатора фактор Х1а вносил вклад в формирование сгустка.
Расстояние эффективной диффузии реагента определяется значением величины - D/h , где D есть коэффициент диффузии, a h есть константа ингибирования первого порядка. Хотя коэффициенты диффузии факторов Ха и 1Ха одинаковы, их скорости ингибирования в плазме различаются, составляя 1 мин"1 и 0.03-0.1 мин"1, соответственно. Получается, что их расстояния эффективной диффузии должна различаться в -3-6 раза, в согласии с нашими результатами. Дополнительно свидетельство в пользу роли диффузии фактора 1Ха заключается в том, что уменьшение коэффициента диффузии фактора ГХа в 100 раз приводит к почти такому же ухудшению формирования сгустка, что и в гемофилии. Напротив, 100-кратное уменьшение диффузии фактора Ха не меняет скорости роста сгустка и даже сокращает фазу инициации. Все это указывает на то, что диффузия фактора Ха не критична для распространения свертывания, тогда как диффузия фактора 1Ха является лимитирующей. Это согласуется с недавними данными, что эффективная диффузия фактора Ха в растущем сгустке очень медленна [352].
Остановка роста сгустка отсутствовала в нашей модели, предполагая, что некий важный компонент гемостаза, регулирующий размер сгустка, в ней отсутствует. Возможные кандидаты на место такого компонента — тромбомодулин и прочие антикоагулянты, экпрессируемые эндотелием, формирование тромбоцитарного тромба, поток крови. Чтобы сымитировать один из наиболее вероятных механизмов, было смоделировано добавление тромбомодулина в плазму. Было обнаружено, что он действительно вызывает остановку роста тромба на разных расстояниях от активатора, в зависимости от концентрации. Экспериментальная проверка подтвердила справедливость модельного предсказания. В то время, как тромбомодулин при 30-100 нМ влиял как на инициацию, так и на рост сгустка, при 3-10 нМ он не влиял на инициацию совершенно, но распространение было остановлено на расстоянии 1-2 мм от активатора. Расчеты показывают механизм этого эффекта. Когда тромбомодулин присутствует, протеин С активируется быстро и уничтожает все активные кофакторы, даже когда сгусток еще не был сформирован, предотвращая дальнейшее формирование тромбина. Это исследование является первой попыткой прямо продемонстрировать его эффект в остановке физического распространения тромба. Наши результаты согласуются с данными, полученными в исследованиях тромбозов у мышей с дефицитами тромбомодулина, где было обнаружено увеличение тромбогенности [82].
Взятые вместе, результаты изучения реакционно-диффузной модели свертывания позволяют предложить механизм пространственной регуляции свертывания. Формирование сгустка разделено на три стадии: инициация, распространение и остановка, которые регулируются различными реакциями: внешняя теназа, внутренняя теназа и петля обратной связи через фактор Х1а, путь протеина С. Тот факт, что каждая стадия формирования сгустка контролируется своими реакциями, позволяет предложить селективное терапевтическое ингибирование отдельных стадий. Например, можно предположить, что тромбомодулин будет ингибировать распространение свертывания, но не его инициацию, что позволит избежать тромбообразования и при этом не нарушить нормальный гемостаз. С другой стороны, петля обратной связи через фактор XI, обеспечивающая неограниченное распространение сгустка, может быть ингибирована с той же целью.
