Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 14
Общие представления о процессе электромеханического сопряжения 14
Основные Ca2+-транспортирующие системы, поддерживающие гомеостаз Ca2+ в миокардиальных клетках 16
Механизмы поддержания гомеостаза кальция в сердечных клетках зимоспящих животных 28
Уникальная устойчивость сердца зимоспящих животных к гипотермии 32
Роль частоты стимуляции в регуляции сократимости миокарда. 36
Зависимость силы сокращения от частоты стимуляции. 36
Соотношение активности внеклеточных и внутриклеточных источников кальция – определяющий фактор характера ритмоинотропии. 38
Кальциевый гомеостаз и ритмоинотропные явления в миокарде в условиях гипотермии и при заболеваниях 40
Особенности кальциевого гомеостаза и их проявление в характере ритмоинотропии сердца зимоспящих животных. 43
Особенности рецепторной регуляции сократимости миокарда . 46
Рецепторы с тирозинкиназной активностью 47
Рецепторы, сопряженные с ГТФ-связывающими белками 51
Особенности нейрогормональной регуляции сократимости миокарда. 61
Роль инсулина. 61
Влияние инсулина на функционирование кальцийтранспортирующих систем миокардиальных клеток. 63
Симпатическая и парасимпатическая системы в сердце зимоспящих 71
ГЛАВА 2. Материалы и методы 74
Объект исследования 74
Физиологические методы: 75
Препаровка. 75
Блок-схема установки. 76
Система стимуляции. 78
Экспериментальные протоколы 78
Фармакологические подходы 81
Биохимические методы: 82
Статистическая обработка данных. 83
Глава 3. Результаты и их обсуждение 83
Особенности изменений ритмоинотропных характеристик папиллярных мышц сердца суслика при смене сезонов активности животных и в
динамике зимней спячки 83
Зависимость силы сокращения от частоты стимуляции. 84
Исследование зависимости ЧС в ПМ сердца сусликов, входящих в состояние спячки и пробуждающихся. 88
Эффект потенциации сокращения паузой. Механическая реституция 90
Исследование роли вне - и внутриклеточных источников Са2+ в регуляции силы сокращения ПМ сердца сусликов, характеризующихся различными типами ритмоинотропии . 93
Роль внеклеточных источников кальция. 94
Роль внутриклеточных источников Са2+ в реализации ритмоинотропиных феноменов в сердце суслика. 103
Обсуждение 119
Роль инсулина в регуляции силы сокращения и ритмоинотропных явлений в сердце суслика 137
Частотно-зависимое действие инсулина на сократимость миокарда суслика в разные периоды активности. 140
Возможные механизмы действия инсулина на миокард суслика 144
Роль -адренергической стимуляции в регуляции силы сокращения сердца
суслика 161
Обсуждение результатов 167
Заключение 176
Выводы 180
Список литературы 182
- Основные Ca2+-транспортирующие системы, поддерживающие гомеостаз Ca2+ в миокардиальных клетках
- Особенности рецепторной регуляции сократимости миокарда
- Фармакологические подходы
- ПМ сердца сусликов, характеризующихся различными типами ритмоинотропии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Известно, что ключевую роль в регуляции сократимости
миокарда играют особенности кальциевого гомеостаза, который формируется, как результат функционирования различных Са -транспортирующих систем, управляемых нейрогуморальной системой и обеспечивающих, как вход Са из внеклеточной среды, так и поступление из внутриклеточных депо. Нарушения кальциевого гомеостаза являются причиной большинства патологий сердца. Особое внимание исследователей привлекают зимоспящие млекопитающие, а именно - уникальная пластичность их кальциевого гомеостаза, которая расширяет адаптационные возможности к воздействиям внешних и внутренних факторов среды (Johansson 1996, Carey et al., 2003; Wang and Zhou, 1999, 2000, 2002; Opthof and Rook, 2000; Storey, 2003). Изучение особенностей функционирования сердца зимоспящих может приблизить нас к пониманию механизмов активации стресс-факторов и их роли в повышении адаптационных возможностей высших млекопитающих и человека.
В сердце зимоспящих доля участия различных источников кальция в активации сокращения обратимо меняется при смене сезонного состояния животных (активность, спячка, пробуждение). Показано, что при этом также изменяется и характер ритмоинотропных отношений [Kondo, Shibata, 1984, Zhou et al., 1987]. Тем не менее, имеющиеся данные об особенностях частотной регуляции силы сокращения сердца зимоспящих животных малочисленны и противоречивы. Полностью отсутствуют сведения о характере ритмоинотропии в переходных состояниях животных: в процессе вхождения в состояние спячки и выхода из нее. Частота сердцебиений -жизненно важный модулятор, обеспечивающий способность сердца влиять на сердечный выброс и силу сокращений (Bowditch, 1871; Koch-Weser, Blinks, 1963; Endoh, 2004, Janssen 2010; Xu et al, 2011; Dvornikov et al., 2012). Ионам кальция принадлежит ведущая роль в реализации связи «частота-сила» (ритмоинотропные отношения). Изменения динамического баланса ионов Са2+ (кальциевый гомеостаз) в цитоплазме являются основной причиной нарушений сократительной способности и зависимости частота-сила при патологиях миокарда. Анализ ритмоинотропных явлений позволяет оценивать состояние системы поддержания кальциевого гомеостаза в клетках и тканях лабораторных животных и человека, как в норме, так и при патологиях миокарда [Мархасин и др., 1994; Reuter et al., 1999; Maier et al, 2000; 2002; Pieske et al, 1996; 2002; Benitah et al., 2003].
Сердце зимоспящих обладает удивительной способностью при периодическом входе в оцепенение и выходе из этого состояния в сезон гибернации значительно изменять и полностью восстанавливать уровень метаболизма, активность симпато-адреналовой системы и гормонального статуса, являющихся компонентами системы эндогенной регуляции (Kolaeva, 1964; Слоним, 1979; Колаева, 1979; 1993; Игнатьев и соавт. 1998; Nurnberger, 1995, обзоры Carey et al., 2003; Gaiser, 2004; Storey, 2010; Epperson et al., 2011). В этой отношении особую значимость приобретает исследование нейрогормональной регуляции функции сердца зимоспящих животных при смене их физиологического состояния. Известно, что инсулин играет ключевую роль в сезонных изменениях характера метаболизма гибернантов. Нами впервые предложена и теоретически обоснована возможность использования зимоспящих животных в качестве природной модели обратимости состояния инсулинорезистентности - явления, свойственного зимоспящим животным и уникального по своей значимости (Накипова и соавт, 1997). Понять механизмы, лежащие в основе данного явления - значит сделать важнейший шаг к решению проблемы преодоления диабета и его осложнений, среди которых одним из самых грозных является диабетическая кардиомиопатия (Thackeray et al., 2012). Использование зимоспящих животных в качестве природной экспериментальной модели обратимости инсулинорезистентности в последнее время вызывает все больший интерес (Wu et al., 2013), однако конкретного изучения роли инсулина в регуляции функции сердца гибернантов пока не получает должного внимания. Исследование этого вопроса представляется нам особенно актуальным и в связи с малым пониманием роли инсулина в регуляции сократительной активности миокарда обычных млекопитающих в норме и в условиях диабета. Решение проблемы осложняется и множественностью функций, выполняемых данным гормоном, и переплетением внутриклеточных и внешних факторов, определяющих взаимодействие между инсулином и другими рецепторными системами. В частности, показано, что в условиях инсулинорезистентности (при диабете II типа) наблюдается понижение чувствительности (3-адренорецепторов к действию агонистов. В этой
связи использование сердца суслика открывает возможности изучения механизмов перекрестного взаимодействия сигнальных путей инсулиновых и (3-адренергических рецепторных систем животных. Сердце зимоспящих животных может стать источником важной информации о механизмах развития инотропных нарушений, связанных с ремоделированнием кальций-транспортируюших систем и изменением нейрогормонального статуса в условиях диабетической кардиомиопатии [Semple et al, 2012].
Взаимодействие симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы играет особую роль в регуляции сократимости миокарда и кальциевого гомеостаза, как зимоспящих, так и обычных млекопитающих (Mattera et al., 2011). В сердце гибернантов соотношение активности симпатической и парасимпатической систем претерпевает значительные сезонные изменения [Kondo and Shibata, 1984; Kondo, 1986; O'Shea and Evans, 1985; Pleschka et al., 1996; Harris and Milsom, 1995; Milsom et al., 1999; Milsom et al, 2001; Elvert and Heldmaier, 2005]. Общий характер этих взаимодействий в сердце зимоспящих животных при смене их физиологического состояния практически не изучен.
Цель исследования: выявление особенностей регуляции сократительной функции миокарда зимоспящих животных в процессах сезонной адаптации.
Основные задачи исследования:
-
Выяснение особенностей зависимости силы сокращения от частоты стимуляции (ритмоинотропные отношения) в сердце суслика.
-
Создание феноменологической картины изменений ритмоинотропных явлений в папиллярных мышцах сердца суслика при смене сезонов активности животных и в условиях зимней спячки.
-
Установление корреляции характера ритмоинотропной связи и активности кальцийтранспортирующих систем при смене физиологического состояния животных.
-
Выявление роли инсулина в регуляции сократительной активности папиллярных мышц сердца суслика в зависимости от физиологического состояния животных.
-
Установление механизмов действия инсулина в сердце суслика.
-
Выяснение особенностей влияния (3-адренергической и мускариновой рецепторных систем в регуляции сократимости миокарда суслика в различные фазы годового цикла.
-
Установление возможного пути перекрестного взаимодействия сигнальных механизмов рецепторов тирозинового типа (инсулиновые) и (3-адренергических рецепторов
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Характер изменений физиологического состояния сусликов при смене сезона активности сопряжен со значительными трансформациями ритмоинотропных явлений в папиллярной мышце сердца животных.
-
Вклад внутриклеточных и внеклеточных источников кальция в регуляцию силы сокращений сердца суслика является определяющим фактором, обуславливающим различия между обнаруженными типами ритмоинотропии.
-
Депо-активируемые Са каналы (Store operated Са2+ channels, SOC -каналы) обеспечивают альтернативный путь поступления внеклеточного Са2+ в сердце зимоспящих в периоды активных функциональных перестроек.
4. Величина и направленность инотропного действия инсулина при изменении
физиологического состояния животных зависят от исходного типа ритмоинотропии сердца
суслика.
-
В клетках миокарда зимоспящих животных эффект инсулина реализуется через стандартный сигнальный механизм действия рецепторов тирозинового типа и включает активацию IP3- и АКТ-киназ.
-
Инотропный эффект изопротеренола проявляется по-разному у активных летом животных и животных периода гибернации.
7. Характер взаимодействия мускариновой и (3-адренергической рецеигорных систем зависит от функциональной активности животных, состояния кальциевого гомеостаза клеток миокарда и активности NO-зависимой сигнальной системы.
Научная новизна и теоретическая ценность
В работе впервые проведено систематическое изучение особенностей частотной регуляции сократительной функции миокарда зимоспящих животных (ритмоинотропная связь). Исследовано действие специфических блокаторов различных кальцийтранспортирующих систем, проведена оценка их взаимосвязи с параметрами ритмоинотропии.
Впервые исследовано влияние инсулина на силу сокращения и особенности ритмоинотропных явлений в сердце суслика. Показано, что чувствительность миокарда к инсулину, а также направленность инотропного действия этого гормона варьирует в течение годового цикла жизнедеятельности зимоспящих и зависит от физиологического состояния животных, частоты стимуляции и исходного характера ритмоинотропных отношений.
Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о возможности существования в сердце суслика альтернативного пути поступления Са2+ в SR, реализующегося через депо-активируемые кальциевые каналы (Store operated Са2+ channels, SOC-каналы). Появляются основания полагать, что SOC-каналы могут играть определенную важную роль в сезонных изменениях кальциевого гомеостаза у зимоспящих животных. Таким образом, открываются новые возможности изучения компенсаторной роли данного типа каналов у высших теплокровных (в частности, человека) в норме, патологии или в условиях действия стрессорных факторов внешней и внутренней среды.
Впервые показано, что характер взаимодействия (3-адренергической и мускариновой рецепторных систем проявляется по-разному в зависимости от функциональной активности животных, состояния кальциевого гомеостаза миокардиальных клеток и активности NO-зависимой сигнальной системы. Впервые обнаружено модулирующее действие инсулина на проявление эффектов изопротеренола и карбохолина в сердце суслика.
Проведенные исследования расширяют представления о физиологических и биохимических основах функционирования сердца зимоспящих животных. Создаются предпосылки для более детального изучения механизмов действия на миокард гормонов и нейротрансмиттеров, влияния которых реализуются через рецепторы с тирозинкиназной активностью и рецепторы, связанные с G-белками. Через данные типы рецепторов оказывают свое действие многие фармакологические препараты, влияющие на сердце и сосуды и, таким образом, полученные результаты могут иметь значение и при разработке научно обоснованных методик лечения сердечно-сосудистых заболеваний.
Практическая ценность. Выявленные зависимости инотропных воздействий от сезона года и функционального состояния животных, различающихся типологическими особенностями ритмоинотропии, существенно дополняют уже имеющиеся сведения о механизмах регуляции сократительной функции сердца. Так, известно, что действие кардиотропных веществ по-разному проявляется в условиях нарушений кальциевого гомеостаза и метаболизма миокарда при различных заболеваниях. Установление характера этой взаимосвязи - необходимый этап фармакологического тестирования новых препаратов. Как правило, для этой цели используются генетически модифицированные животные, искусственно воспроизводящие черты различных нарушений. Сердце зимоспящих - уникальная природная модель, воссоздающая при смене физиологического состояния животных черты различных нарушений, свойственных патологически измененному миокарду высших теплокровных, в частности, человеку. Полученные результаты позволяют установить прямую связь между состоянием кальциевого гомеостаза и характером действия инотропных стимулов, влияющих на силу сокращений. Детализация ритмоинтропных явлений создает основу для использования сердца зимоспящих животных в качестве модели, позволяющей проводить экспериментальный поиск механизмов, которые обеспечивают устойчивость миокарда незимоспящих млекопитающих и человека к условиям гипоксии, гипотермии и ишемии. Полученные нами экспериментальные факты могут найти практическое применение, например, при создании математической модели, позволяющей
дифференцированно отслеживать вклад различных источников кальция (как внеклеточного, так и внутриклеточного) в регуляцию силы сокращения при изменении физиологического состояния зимоспящих животных.
До настоящего времени не проводилось последовательных работ, посвященных раскрытию механизмов влияния инсулина на функцию сердца зимоспящих животных, поэтому наши исследования могут служить основой для лучшего понимания возможных взаимодействий инсулин-зависимых сигнальных путей с системами других вторичных посредников. Изучение эволюционно «отработанных» механизмов, обеспечивающих удивительную пластичность сердца зимоспящих животных, могут приблизить нас к пониманию механизмов активации стресс-факторов и их роли в повышении адаптационных возможностей высших млекопитающих, в частности, человека. Выявленная картина изменений особенностей ритмоинотропных характеристик и характера влияния гормонов и нейротрансмиттеров в весенний и осенний периоды позволяет рассматривать гибернантов как удобную природную модель сезонно-обусловленной инсулинорезистентности и эмбриолизации миокардиальной ткани, перспективную для анализа функциональной значимости и молекулярных механизмов их формирования в условиях патологий.
Представленная работа носит фундаментальный характер. Результаты исследований могут иметь практическую значимость как для биофизиков и физиологов, так и для биохимиков и фармакологов. Изученные особенности регуляции сократительной активности миокарда зимоспящих могут найти применение в качестве своеобразной «мишени» для фармакологических средств, которая может быть использована при создании лекарств с принципиально новым механизмом действия.
Личный вклад автора.
Автору принадлежат постановка проблемы и решение её в целом, планирование и непосредственное участие в проведении экспериментов, обработке результатов, написании статей. Функциональный контроль за состоянием животных и исследование их биохимических особенностей осуществлялись совместно с сотрудниками Лаборатории природных гипометаболических состояний: Игнатьевым Д.А., Захаровой Н.М., Андреевой Л.А. и Амерхановым З.Г. Исследования по изучению экспрессии белков в сердце суслика методом вестерн-блота проводились в сотрудничестве с Институтом кардиологии и пневмологии Геттингенского университета (Германия), а в настоящее время проводятся в сотрудничестве с Институтом теоретической и экспериментальной биофизики.
Апробация работы. 43 Annual Meeting of the Society for Cryobiology Hamburg, 2006; Georg-August University Goettingen, 2005; 2007; «XX съезд физиологического общества имени И. П. Павлова» (Москва, 2007); «VIII международный конгресс «Здоровье и образование - XXI век. Современные концепции болезней цивилизации»», (Москва, 2007); XXXth international congress on electrocadiology. 2008, St. Petersburg; Международные конференции «Биологическая подвижность» (Пущино, 2004-12).
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 26 печатных работах, среди которых 17 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, 9 в сборниках трудов и тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 217 страницах, проиллюстрирован 41 рисунками и 5 таблицами. Список литературы содержит 593 цитируемых источника.
Основные Ca2+-транспортирующие системы, поддерживающие гомеостаз Ca2+ в миокардиальных клетках
Процесс, инициирующий запуск сокращения (систолу), называется сопряжением возбуждения с сокращением (электромеханическое сопряжение). В сердечных клетках данный процесс регулируется механизмом, известным, как кальций-зависимое высвобождение кальция (Fabiato, Fabiato, 1975; Fabiato 1983; Fabiato 1989). Он начинается с деполяризации плазматической мембраны потенциалом действия и открытия Ca2+-каналов L-типа. Небольшое количество кальция, поступившее в клетку во время возбуждения через Ca2+-каналы L-типа (при некоторых условиях возможен также вход Ca2+ через обратную форму Nа+/Ca2+-обменника), вызывает за короткое время (несколько миллисекунд) высвобождение большого количества Ca2+ из саркоплазматического ретикулума (СР) через рианодин-чувствительные каналы СР (РиР) достаточное для активации актин-миозинового комплекса и запуска сокращения (Barry and Bridge, 1993; Tameyasu 1998; Bers, 2000, 2001; Lewartowski 2000; Lipp et al., 2002; Neco et al., 2010; Ramirez et al., 2011; Kang and Lebeche 2013) (Рис. 1).
Упрощенная схема процесса электромеханического сопряжения в миокарде млекопитающих. Обозначения: W - кальциевый ток Ьтипа; CXforwаi.d-CXreVerSe Nа+/Са2+ - обменный механизм, прямая и обратная формы; RYR - рианодиновые рецепторы; SERCA - Са2+-АТФаза саркоплазматического ретикулума. В таблице приведены соотношение вклада SERCA и CXforwаrd в процесс удаления Са2+ из цитоплазмы во время расслабления. Процесс расслабления сердца (диастола) происходит вследствие удаления Ca2+ из цитозоля. Основная часть Ca2+ из области сократительных белков транспортируется назад в саркоплазматический ретикулум с помощью АТФ зависимого кальциевого насоса, встроенного в мембрану саркоплазматического ретикулума, Ca2+-АТФазы СР (SERCA2а). Меньшее количество Ca2+ выводится за пределы клетки через сарколемму за счет активности Ca2+-АТФазы сарколеммы и прямой формы Nа+/Ca2+-обменного механизма (CXforwаrd) (Кurihara et al., 1982). Благодаря согласованному функционированию данных Ca2+-транспортирующих систем весь освободившийся Ca2+ также очень быстро (за 1-2 миллисекунды) полностью удаляется из цитоплазмы (обзоры: Reiter 1988; Berridge et al., 2003; Bassani et al., 1995; Lehnart et al., 2009; Bers, 2008; Eisner & Trafford, 2009; Kubin et al., 2011). Соотношение SERCA и CXforwаrd, главных участников процесса расслабления, зависит от вида животных и меняется при заболеваниях (Bers 2001) (Рис. 1Б). В сердце взрослых млекопитающих процессы сокращения и расслабления регулируются двумя мембранными системами: плазматической мембраной (сарколеммой) и саркоплазматическим ретикулумом. Часть плазматической мембраны вдается во внутреннее пространство клетки, создавая систему поперечных трубочек (Т-трубочки или Т-тубулы), просвет которых содержит внеклеточную жидкость. Потенциалы действия, активирующие сокращение, распространяются вдоль мембран Т-тубул. Таким образом, сила сокращения миокардиальных клеток зависит как от внеклеточных, так и внутриклеточных (СР) источников Ca2+. Существует большое количество обзоров, подробно описывающих особенности функционирования кальций-транспортирующих систем, участвующих в поддержании кальциевого гомеостаза миокардиальных клеток. Мы коротко суммируем существующие на сегодняшний день представления, которые считаются общепризнанными, и более подробно остановимся на исследованиях, которые открывают принципиально новые аспекты в трактовке уже имеющихся знаний. Основные Ca2+-транспортирующие системы, поддерживающие гомеостаз Ca2+ в миокардиальных клетках.
Механизмы, обеспечивающие вход кальция. Вход внеклеточного Ca2+ осуществляется в основном через систему Ca2+-каналов плазматической мембраны. Существует несколько классов Ca2+ каналов плазматической мембраны. В сердце наиболее важными являются Ca2+ каналы L-типа, названные так вследствие их долго сохраняющегося открытия. Поскольку эти каналы связывают известный класс блокаторов Ca2+ каналов, дигидропиридины (нифедипин), их иногда называют дигидропиридиновыми (ДГПР). Ca2+-каналы L-типа представляют собой гетеротетрамер, состоящий из следующих субъединиц: 1 формирует канал, а также отвечает за его потенциал-чувствительность и селективность, 1 субъединица содержит 2 цитоплазматических участка, участвующих в Ca2+ - зависимой инактивации каналов. 1 субъединица каналов кодируется 1C геном (CaV1.2) (Bodi et al., 2005; Treinys, Jurevicius 2008; Weiss et al., 2013; Hofmann et al., 2014); субъединица участвует в транспорте 1 субъединицы от эндоплазматического ретикулума и её правильном закреплении в мембране (Catteral et al., 1991; Bodi et al., 2005), кроме того, она чувствительна к внутриклеточному уровню рН, а также передаёт на 1 субъединицу сигналы различных протеикиназ (Keef et al., 2001); 2- комплекс также может участвовать в переносе 1 субъединицы на мембрану и регуляции её активности, однако в меньшей степени, чем (Bodi et al., 2005). При гипертрофии сердца увеличивается плотность ДГПР (Bodi et al., 2005; Eisner et al., 2009), а также происходит ослабление частотной регуляции Ca2+-тока (Treinys, Jurevicius 2008). В экспериментальных условиях для активации ДГПР, как правило, используют BAY 8644, а для подавления - соединения группы дигидропиридинов (нифедипин), а также двухвалентные ионы тяжёлых металлов (Ni, Cd и др.). В сердце активация -адренорецепторов увеличивает Ca ток через CaV1.2 каналы, результатом чего является развитие классического положительного инотропного эффекта (Tang et al., 2010; Weiss et al., 2013).
Особенности рецепторной регуляции сократимости миокарда
Гипотермия может играть двоякую роль: С одной стороны, снижение метаболизма предохраняет миокард от ишемичеких повреждений (Rhodes et al., 2003), позволяет проводить более длительные операции на сердце. С другой стороны, вызывает разнообразные нарушения в его деятельности, такие как фибрилляции, нарушения ритма и т.д.
В основе этих опасных явлений лежит нарушение Ca2+ гомеостаза. Увеличение концентрации кальция выше нормального диастолического уровня вызывает осцилляторный выброс Ca2+ из саркоплазматического ретикулума. Это приводит к возникновению временного входящего тока и, как следствие, к задержанным постдеполяризациям, которые могут инициировать экстрасистолы и вызывать жизнеугрожающие аритмии (Colatsky, 1980). Перегрузка кальцием может приводить к дефосфорилированию коннексинов и вызывать, таким образом, разобщение клеток. Все эти явления наблюдаются в сердце обычных теплокровных животных при гипотермии, в то время как, клетки зимоспящих сохраняют уникальную способность поддерживать постоянный уровень внутриклеточного кальция (Johansson, 1996; Wang, Zhou, 1999b; Milsom et al., 1999, 2001; Saitongdee et al., 2000; Wang et al., 2002). Механизмы инотропного эффекта гипотермии зависят от вида животного и особенностей Ca2+ гомеостаза в сердце.
У млекопитающих описан двухфазный инотропный эффект снижения температуры. Сначала идёт увеличение силы сокращения до максимума при 20-30С, затем постепенное снижение, вплоть до полного подавления сократительной активности. Следует отметить, что повышение температуры выше физиологической ведёт к ускорению кинетических параметров сокращения и уменьшению его силы (Hiranandani et al., 2006). Показано, что положительный инотропный эффект в миокарде крысы во многом обусловлен деятельностью СР, в то время как у кролика эта зависимость незначительна (Shattock, Bers, 1987).
В результате многолетних исследований установлено, что сократительная функция сердца зимнеспящих поддерживается во время разогревания и охлаждения, а также в состоянии глубокой гипотермии (Ikomi-Kummi et al., 1994; Johansson 1996; Milsom et al., 1999, 2001; Nelson et al., 2003; Розенштраух и соавт., 2005). Кроме того, сердце зимнеспящих животных в течение длительного времени сохраняет свою активность при глубокой искусственной гипотермии тела (Burlington, Darvish, 1988). В сердце зимнеспящих на всех стадиях цикла гибернации могут наблюдаться аритмии, но вызвать фибрилляцию желудочков у них можно только при использовании методов, приводящих к прямому повреждению сердца (Johansson, 1996). В то же время показано, что в сердце морской свинки фибрилляция желудочков наступает при охлаждении тела до 18оС. Некоторой устойчивостью отличается сердце крыс и мышей. Так, сердце крысы продолжает сокращаться при температуре тела около 7оС (Huttunen, Johansson, 1963). Впоследствии было установлено, что сердце взрослых крыс и мышей имеет повышенную устойчивость к охлаждению по сравнению с сердцами других незимнеспящих млекопитающих (Жегунов 1989; 1993; Жегунов, Вонг, 1991).
Показано, что в КМЦ крысы и морской свинки при охлаждении от 35 до – 10С (Ca2+)i увеличивается от в два раза от 150-200 до 300– 400 нмоль. (Liu et al., 1991; Stowe et al., 1999). В результате этих изменений наблюдается рост напряжения покоя и подавление сократительного ответа кардиомиоцитов (Liu et al., 1991, Wang et al., 1997). В противоположность этому, в сердце суслика в интервале температур тела 30 до 10С, (Ca2+)i изменяется незначительно (Wang et al., 1997), что свидетельствует о наличии адаптивных механизмов, поддерживающих гомеостаз кальция в условиях глубокой гипотермии. Одним из адаптивных механизмов поддержания гомеостаза кальция принято считать изменение кинетики Ca2+-цикла при низких температурах (Wang et al., 2002). Известно, что низкие температуры являются также причиной спонтанных кальциевых волн (Wang et al., 1999б), часто приводящих к возникновению аритмий (Lakatta, 1992), которые в свою очередь являются предшественниками фибрилляции желудочков сердца (Johansson, 1996).
Сильный контраст по сравнению с такими нерегулируемыми изменениями уровня (Ca2+)i представляет его четкая регуляция, характерная для зимоспящих. Показано, что в интервале температур тела 30 – 10 С (Ca2+)i в покоящихся миоцитах сердца сусликов S. dauricus изменяется незначительно (в пределах 125 ± 10 нмоль-1) (Wang et al., 1999а). Наряду с этим амплитуда транзиентного кальциевого тока, соответствующего возбуждению, увеличивается при охлаждении (Wang et al., 2000), что позволяет поддерживать достаточно сильные сокращения мышцы, несмотря на снижение чувствительности миофиламентов к кальцию при низких температурах (Khromov et al., 1990; Liu et al., 1993). Отмечается, что при снижении температуры тела сокращения в сердечной мышце ежа и сусликов не только сохраняются, но и становятся более сильными, чем сокращения при нормальной температуре тела (Liu et al., 1990; Wang et al., 1997). Принято считать, что в этом заключается одно из адаптивных приспособлений сердец зимнеспящих, позволяющее поддерживать достаточное давление, несмотря на значительное увеличение вязкости крови и периферического сопротивления в условиях низких температур.
Фармакологические подходы
Система стимуляции состояла из раздражающих электродов и стимулирующей аппаратуры. Использовали камерный метод стимуляции, предложенный Камияма и Матсуда (Kamiyma 1966). Выбор этого метода основывался на том, что он обеспечивает достаточно однородное раздражение всего сечения препарата, состоящего из множества параллельно ориентированных мышечных пучков. При этом препарат можно рассматривать как систему параллельных волокон, эквипотенциальные точки которых соединены перемычками, и изучать активные свойства сердечных волокон как бы с «отключенными» боковыми связями. Можно считать, что при таком методе раздражения исследуется усредненное одиночное волокно миокарда (Lee, 1970). Задаваемые программой импульсы тока с выхода ЦАП через безартефактную приставку подавались на препарат через неполяризующиеся стандартные рН-метрические хлорсеребряные электроды сравнения типа ЭВЛ-1 МЗ, контактирующие с раствором через агар-агаровые мостики, погруженные в каждый отсек камеры, которые изготовлялись на 2,5М растворе КСl. Собственное сопротивление электродов, включая и агаровые мостики, составляло не более 10 кОм. Использование подобных электродов гарантировало высокий коэффициент передачи импульсов тока от стимулятора к препарату. Стимуляция осуществлялась с выхода ЦА П L-Card 154 через изолирующий блок, в котором использована оптронная развязка. Стимуляцию осуществляли импульсами постоянного тока прямоугольной формы продолжительностью 5мс. Напряжение составляло 4,5 В ток подбирался в пределах от 0,05 до 5 мА в зависимости от чувствительности препарата ПМ. Механическую активность мышц регистрировали с помощью механотрона 6Х-2М.
Экспериментальные протоколы.
Сократительную функцию папиллярных мышц (в изометрическом режиме) оценивали по изменениям кривой развиваемого мышцей напряжения (сила сокращения). Определяли следующие показатели: максимально развиваемое напряжение – Tmax; Время цикла повышения и понижения напряжения (сокращение-расслабление) (t, мс) оценивали по следующим параметрам: время достижения максимума сокращения (ВДМ) и время расслабления на уровне, соответствующем спаду изометрического напряжения до 50% и 95% от своей максимальной величины (ВР50, ВР95).
Известно, что потенциал действия (APD) в сердце суслика очень короткий (Egorov et al., 2010), аналогичный тому, который регистрируется в сердце крысы. Это обеспечивает существенные преимущества использования сердечных мышц данных животных для изучения ритмоинотропных феноменов, так как параметры их потенциала действия практически не меняются при изменении частоты стимуляции (Lukas and Bose, 1986).
Для оценки вклада различных источников Ca2+ (вне- и внутриклеточных) в регуляцию силы изометрических сокращений ПМ сердца суслика использован физиологический подход, основанный на моделировании ритмоинотропных эффектов (Зависимость силы сокращения от частоты стимуляции и эффект паузы) в перфузируемых мышечных препаратах сердца (Lukas and Bose, 1986; Maier et al., 2000а; Pieske et al., 1996, Jansssen 2011). Анализ эффекта паузы использован как качественный показатель содержания Ca2+ в саркоплазматическом ретикулуме (Lukas and Bose, 1986; Pieske et al., 1996). По силе изометрического сокращения (F) оценивали стационарную зависимость «частота-сила» и эффект паузы по следующим протоколам: 1. Регистрация зависимости «частота-сила» (ЧС). Папиллярная мышца растягивалась до 95% от максимальной длины препарата, соответствующей максимальной силе изометрического сокращения. После полной механической стабилизации на частоте стимуляции 0.1Гц, частота скачкообразно увеличивалась до 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5 и 6.0Гц. В зависимости от задачи исследования эксперименты проводили при 37C либо при 30C перфузирующего раствора. 2. Регист рация эффекта паузы. Кривые механической реституции. После полной стабилизации сократительной функции ПМ на базовой частоте стимуляции (0.3 или 1.0Гц в настоящей работе), стимуляцию останавливали на фиксированное время от 2 до 120 секунд, а затем возобновляли на той же самой частоте. Эффект паузы оценивали, как отношение максимальной величины силы первого сокращения после периода покоя (тестовое сокращение, F1) к силе ритмического сокращения на базовой частоте (F0). Полная корреляция между величиной изометрического сокращения и светового сигнала, отражающего уровень кальция в клетке (Рис.5А), однозначно указывает на то, что концентрация свободного кальция в цитоплазме коррелирует с изменениями силы сокращения в ответ на внесение паузы (Maier et al., 2000a). Ингибиторный анализ подтверждает, что данный параметр, действительно, является качественным показателем содержания кальция в СР. Эффект паузы сохраняется при обработке нифедипином (блокатором Са каналов L-типа), и полностью подавляется рианодином - блокатором каналов, через которые происходит выброс Са из СР (Рис. 5Б) (Аверин, 2011).
ПМ сердца сусликов, характеризующихся различными типами ритмоинотропии
Данные молекулярного анализа показали, что уровень SERCA в ПМ спящих и входящих в состояние спячки животных почти в 2 раза выше, чем содержание NCX. У активных сусликов весенне-осеннего периода со 2 типом ритмоинотропии уровень NCX, напротив, почти в 2 раза выше, чем уровень SERCA. У активных сусликов с 1 типом ритмоинотропии SERCA /NCX содержатся примерно в равном соотношении. Анализ полученных данных позволяет предположить, что у сусликов со вторым типом ритмоинотропии Na+/Ca2+ -обмен играет, по-видимому, доминирующую роль в процессе удаления Са из цитоплазмы в процессе расслабления. В этом случае возникает вопрос, почему величина эффекта паузы таких мышц значительно выше, чем мышц с 1 типом ритмоинотропии? Почему, на препаратах, предварительно обработанных циклопиазоновой кислотой, не снижается, а даже увеличивается уровень кальция в СР? Какой механизм обеспечивает поступление Са2+ в СР в условиях, когда активность SERCA снижена? Мы предположили, что подобным механизмом могут быть депо-активируемые кальциевые каналы (SOC-каналы) (обзор Huke et al., 2011).
Депо-зависимые (SOC) Са каналы, каналы, активируемые в результате понижения концентрации свободных ионов Са2+ во внутриклеточных депо (саркоплазматическом ретикулуме) (Watanabe et al.2008; Watanabe, 2009). Долгое время считалось, что SOC тип каналов наиболее характерен для невозбудимых тканей, однако в настоящее время их присутствие обнаружено и в миокардиальной ткани, но только на стадиях эбрионального развития, где они играют важную роль в регуляции сократимости и пейсмекерной активности (Sabourin et al., 2011; 2012). В норме данный тип каналов отсутствует в сердце высших теплокровных животных и человека. Показано, что они вовлечены в процессы, инициирующие развитие аритмий, гипертрофии и сердечной недостаточности (Seth et al., 2009; Vassort and Alvarez, 2009; Wu et al., 2010; Eder & Molkentin, 2011; Vennekens 2011; Luo et al, 2012). Исходя из литературных данных, существование депо-активируемых каналов в сердце зимоспящих животных ранне показано не было.
Модель, иллюстрирующая участие депо-активируемых кальциевых каналов в регуляции содержания Са2+ в саркоплазматическом ретикулуме сердца эмбрионов цыпленка (Sabourin et al., 2011). Показано, что депо-активируемые Са2+ каналы в саркоплазматическом ретикулуме сердца эмбрионов цыпленка активируются в условиях снижения активности SERCA с помощью специфических ингибиторов (тапсигаргин, циклопиазоновая кислота) (Sabourin et al., 2011). С целью того, чтобы показать, что аналогичная ситуация может наблюдаться в сердце зимоспящих животных мы исследовали влияние 2 аминоэтоксидифенилбората (2 – АРВ), ингибитора SOC – каналов (Bootman et al., 2002), на характер ритмоинотропных отношений в сердце суслика в норме (Рис. 21А) и в условиях предварительной обработки ПМ циклопиазоновой кислотой (Рис. 21Б). Мы показали, что 2-АРВ в концентрациях 10 и 25 мкМ вызывает обратимое подавление силы сокращения во всей области исследованных частот стимуляции (Рис. 21А) и эффекта паузы (Рис. 21Г). Наиболее сильное действие АРВ оказывал на препаратах со 2 типом ритмоинотропии. Показано, что 2-АРВ всегда снижает индуцируемые воздействием СРА (Рис. 21Б) рост эффекта паузы и силы сокращение в области низких частот стимуляции (Рис. 21)
Влияние ингибитора SOC –каналов, 2-аминоэтоксидифенилбората (APB, 20 мкМ, 30 мин) на: силу сокращения (а); зависимость ЧС (б, в) и эффект паузы (г, д) в ПМ сердца суслика со 2 типом ритмоинотропии (А) и с 1 типом ритмоинотропии (Б), обработанных в течение 6 часов раствором СРА (10 мкМ) (n=3).
В настоящее время нами совместно с сотрудниками ИТЭБ РАН Э.В. Евдокимовским и Ю.М.Кокозом проводятся исследования по изучению экспрессии белков SOC каналов в сердце суслика методом вестерн-блота. По результатам предварительных исследований, два гена из семейства TRP каналов (transient receptor potential channel) – TRPC3 (молекулярный вес 100 кДа) и TRPC5 (молекулярный вес 110 кДа) экспрессируются в сердечной ткани зимоспящего животного (Рис. 22). В результате проведенной работы выявлено, что в образце сердечной ткани суслика присутствуют катионные каналы TRPC3 и TRPC5 Каналы TRPC6 и TRPC7 в ткани сердца суслика не обнаружены. Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что депо-активируемые каналы могут играть важную роль в адаптационных перестройках кальциевого гомеостаза сердца зимоспящих животных.
В литературе имеются данные о вовлеченности -зависимой сигнальной системы в процесс регуляции SOC-каналов. Мы решили проверить, каким образом изменения уровня NO скажутся на изменении параметров ритмоинотропии в сердце суслика. В качестве агента, модулирующего синтез , был выбран агматин, декарбоксилированный аргинин (Schwarz et al, 1997; Li and Xi 1999; Maltzev et al, 2014).
Исследование возможной роли -зависимой сигнальной системы в регуляции силы сокращения сердца суслика
На рис. 23 представлены результаты типичного эксперимента по исследованию влияния агматина на силу сокращения папиллярных мышц сердца суслика из группы спящих животных. В области низких частот стимуляции (от 0.03 до 0.3 Гц) агматин вызывает рост силы сокращения (положительный инотропный эффект); в области средних частот (0.4 -0.7 Гц) - не оказывает заметного влияния, а при высоких частотах (от 0.7 до 3.0 Гц) - снижает силу сокращений (отрицательный инотропный эффект) (Рис. 23А, Б). Положительный инотропный эффект агматина достигает значительной величины через 30 мин от начала аппликации. При увеличении времени экспозиции агматина (до 120 мин) эффект продолжает нарастать. Инотропный эффект агматина ассоциируется со значительным ростом потенцирующего эффекта паузы (рис. 23В, справа). Удаление агматина из состава перфузирующего раствора приводит к медленному (после 1 часа отмывания) частичному восстановлению регистрируемых параметров (данные не приводятся).
