Содержание к диссертации
Введение
1. Молекулярные механизмы инициации трансляции у про- и эукариот 8
1.1 Общий механизм инициации трансляции у прокариот 8
1.2 Связывание рибосомы с мРНК и выбор инициаторного кодона 9
1.3 Энхансеры трансляции 13
1.4 Структура и функции индивидуальных факторов инициации 16
1.4.1 IF1 16
1.4.2 IF2 17
1.4.3 IF3 18
2 Эукариоты и Археи 19
2 .1 Археи 19
2 2 Структура эукариотических мРНК 21
2 3 Сканирующая модель инициации трансляции 22
2 4 Эукариотические факторы инициации 24
2.4.1 elFl 24
2.4.2 elFlA 25
2.4.3 eIF2 26
2.4.4 eIF3 28
2.4.5 eIF4A 30
2.4.6 eIF4B 31
2.4.7 eIF4F 33
2.4.8 eIF5 35
2.4.9 eIF5B. 3 6
3. Вирус Rhopalosiphum pad! 38
4 Результаты и обсуждение 4 0
1. IRES-элемент RhPV эффективно направляет трансляцию в лизате ретикулоцитов кролика 40
2. Факторы инициации 4-й группы eIF4A, 4В, 4G не являются абсолютно необходимыми для образования 48S комплекса на 5' -концевом IRES-элементе RhPV 41
3. Фактор инициации elFl необходим 40S рибосомной субчастице для достижения инициаторного кодона мРНК RhPV 45
4. Анализ целостности мРНК в ходе экспериментов 46
5. 5'-IRES RhPV не содержит специфических сайтов связывания с компонентами инициаторного аппарата 4 9
6. Структурный анализ 5'-НТО RhPV
7. Рибосомная 40S субчастица и фактор инициации eIF3 образуют стабильный комплекс с IRES-элементом RhPV 51
5 Заключение 52
Выводы 55
- Связывание рибосомы с мРНК и выбор инициаторного кодона
- Структура эукариотических мРНК
- Факторы инициации 4-й группы eIF4A, 4В, 4G не являются абсолютно необходимыми для образования 48S комплекса на 5' -концевом IRES-элементе RhPV
- Рибосомная 40S субчастица и фактор инициации eIF3 образуют стабильный комплекс с IRES-элементом RhPV
Введение к работе
Белковый синтез является сложным процессом, регулируемым на нескольких уровнях. Однако после попадания в цитоплазму влиять на эффективность трансляции становится возможным только на уровне стабильности мРНК и скорости образования инициаторных комплексов, и именно эти области регуляции трансляции вызывают повышенный интерес исследователей. Не последнюю роль играет и то, что многие вирусы в процессе эволюции научились перепрограммировать трансляционный аппарат клетки на преимущественное использование вирусных мРНК. Очень часто это достигается именно на стадии инициации за счет наличия в ряде вирусных мРНК сложных структур, называемых участками внутреннего связывания рибосомы или IRES-элементами (от англ. Internal Ribosome Entry Site). Ввиду сложного устройства клеток высших эукариот, до сих пор не разработаны эффективные методы анализа инициации трансляции in vivo. Поэтому, по крайней мере, в ближайшие годы наилучшим методом изучения трансляции останется реконструкция комплексов рибосома*мРНК из очищенных компонентов в сочетании с техникой тоу-принта - ингибирования обратной транскрипции рибосомными комплексами. На сегодняшний день этим методом были определены механизмы инициации трансляции на ряде клеточных и вирусных мРНК.
Как уже упоминалось, мРНК многих вирусов содержит IRES-элементы. Это сложно организованные последовательности РНК, взаимодействующие с определенными компонентами инициаторного аппарата, направляющие рибосому к инициаторному кодону. Ввиду сложности IRES-элементов неудивительно, что большинство их функционирует лишь в определенных организмах, а небольшие вариации их первичной структуры могут в значительно мере понизить или даже свести на нет их активность. В связи с этим представляют интерес те редкие IRES-элементы, которые функционируют в разных организмах, а также обладают «модульной» структурой, поскольку механизм их работы в настоящее время не совсем понятен. Одним из подобных «универсальных» IRES-элементов является IRES, находящийся в 5'-неторанслируемой области (5'-НТО) мРНК вируса насекомых RhPV (Rhopalosiphum padi virus). Настоящая работа посвящена исследованию взаимодействий IRES-элемента RhPV с компонентами инициаторного аппарата и механизма его работы.
В ходе данной работы было показано, что необычный IRES-элемент, расположенный в 5'-НТО вируса RhPV, способен образовывать инициаторный 48S комплекс в присутствии «канонических» факторов инициации. Однако, в отличие от известных IRES-элементов, которым факторы группы elF4 либо не нужны вовсе, либо критически необходимы, в данном случае они стимулируют образование 48S комплекса, но не абсолютно необходимы для его образования. Подобная «частичная» зависимость от факторов 4-й группы была подтверждена результатами трансляции в присутствии доминант-негативного мутанта elF4A(R362Q), ингибирующего хеликазную активность фактора elF4F. Помимо этого, было показано, что фактор инициации elF1, участвующий в сканировании, также необходим для инициации на мРНК RhPV.
Показано, что инициация происходит на полноразмерной 5'-НТО RhPV, как в присутствии факторов группы elF4, так и в их отсутствие.
Путем последовательного удаления фрагментов 5'-НТО RhPV было продемонстрировано отсутствие каких-либо специфических участков связывания факторов инициации. Оказалось, что только 200 5'-концевых нуклеотидов неспособны функционировать как IRES, в то время как любой другой достаточно протяженный фрагмент 5'-НТО мог направлять внутреннюю посадку рибосомы. Эти результаты были интерпретированы в свете полученных в этой же работе данных по вовлеченности нуклеотидов 5'-НТО RhPV в образование вторичных структур. Было выяснено, что достаточно протяженные фрагменты 5'-НТО RhPV, обладающие слаборазвитой вторичной структурой, способны неспецифически привлекать компоненты инициаторного аппарата, в частности, образовывать стабильный тройной комплекс MPHK*elF3*40S.
Полученные данные объясняют, почему IRES-элемент RhPV способен функционировать в различных эукариотических клетках. Эта способность может быть использована при создании универсальных векторов для экспрессии генов в клетках самого разного происхождения.
Связывание рибосомы с мРНК и выбор инициаторного кодона
Анализ геномов прокариот показал, что подавляющее большинство мРНК (до 90%) используют в качестве инициаторного кодона AUG, 10% используют GUG-кодон, и UUG-кодон [14-16] и очень редко используются такие экзотические кодоны, как AUU [17]. Какие же свойства того или иного кодона определяют, будет ли он использоваться в качестве инициаторного? Считается, что за это отвечают два фактора: РНК-РНК взаимодействия между мРНК, тРНК и рРНК, и пространственная доступность области мРНК, содержащей потенциальный сигнал старта трансляции. Основным требованием к инициаторному кодону является возможность его спаривания с антикодоновой петлёй инициаторной тРНК. Соответственно этому, эффективность трансляции напрямую зависит от степени их спаривания [18]. Дополнительную дестабилизацию рибосомных комплексов, образованных на кодонах, отличных от AUG, осуществляет фактор IF3 (см. далее). Другим важным взаимодействием при связывании мРНК является комплементарное спаривание пурин-богатой последовательности Шайна-Дальгарно (ШД), расположенной в 5-7 нуклеотидах в 5 -сторону от AUG-кодона и пиримидин-богатой области на З -конце 16S рРНК 5 -ACCUCCUUA-3 (анти-ШД). Подобный контакт был изначально предсказан в 1974 году на основе анализа известных в то время первичных структур 16S рРНК и мРНК Шайном и Дальгарно [19], и вскоре был подтвержден экспериментально [20,21]. Окончательно все точки над / были расставлены некоторое время спустя экспериментами in vivo с использованием компенсаторных мутаций ШД и 16S рРНК [22,23]. Долгое время считалось очевидным, что близость ШД консенсусной последовательности 5 -UAAGGAGGU-3 , а, следовательно, и стабильность дуплекса мРНК-рРНК, напрямую связана с эффективностью использования прилежащего к ней AUG-кодона в качестве инициаторного [5,24,25]. Действительно, бинарные комплексы 30S MPHK В случае близких консенсусной последовательности ШД оказываются достаточно стабильными, чтобы детектироваться обратной транскрипцией (метод тоу-принта) [26], в то время как комплексы, образованные на мРНК с более «слабыми» последовательностями ШД, требуют дополнительной стабилизации кодон-антикодоновым спариванием [27,28].
Однако надо заметить, что в случае бинарных комплексов обратная транскрипция обрывается в 2-5 нуклеотидах в З -сторону от ШД [26], в то время как тройные комплексы мРНК 305 Мет-тРНКи терминируют работу ревертазы в 15-16 нуклеотидах от первого нуклеотида AUG-кодона [27,29]. Этому же соответствуют и данные энзиматического пробинга: в отсутствие тРНК рибосома защищает фрагмент мРНК -35 +5, в то время как при ее наличии - -35 +19. Это может свидетельствовать, в частности, о том, что связывание тРНК приводит к укладке мРНК в мРНК-связвающий канал рибосомы. Однако же не все так просто. В других работах [30,31] было показано, что даже при наличии «сильной» последовательности ШД бинарный комплекс MPHK 30S не образуется и может быть обнаружен тоу-принтингом только в отсутствие в составе 30S белка S1 [31] (также см. ниже), и, по всей видимости, такое расхождение в результатах объясняется отсутсвием в препаратах рибосом белка S1 в экспериментах группы Л.Голда. Данные тоу-принтинга [26-28] и химического пробинга [29,30] хорошо согласуются с данными сайт-специфических УФ-индуцируемых пришивок: в отсутствие тРНК область мРНК в З -сторону от инициаторного кодона не пришивается к 16S рРНК, а на пришивки области в 5 -сторону от инициаторного кодона не влияет наличие тРНК [3]. В тоже время, прокариотический ингибитор трансляции RelE, связывающийся с А-сайтом рибосомы и гидролизующий находящуюся в нем мРНК [32], способен индуцировать гидролиз мРНК, связанной с рибосомой всего лишь посредством ШД-аШД [33], что, возможно, указывает на частичную или нестабильную укладку мРНК в РНК-связывающий канал рибосомы в подобных бинарных комплексах. Но вернемся к влиянию «сильной» последовательности ШД на эффективность трансляции. То, что зависимость от ШД не так однозначна, стало ясно после выяснения нескольких фактов. Во-первых, еще в 1983 году было показано снижение экспрессии гена-репортера почти в 2 раза при удлинении ШД [34]. Во-вторых, мРНК Грам-положительных бактерий содержат более «сильные» последовательности ШД, чем мРНК Грам-отрицательных бактерий, но в тоже время, поздние транскрипты поражающего E.coli фага Т7, содержащие «сильную» последовательность ШД, транслируются рибосомами Bacillus subtilis крайне неэффективно [35]. В-третьих, рибосомы E.coli могут эффективно транслировать мРНК как из Грам-отрицательных, так и Грам-положительных бактерий [36,37], а рибосомы B.subtilis транслируют мРНК только Грам-положительных бактерий [35,38-41]. В-четвертых, в литературе со временем накопилось множество фактов существования мРНК, не имеющих ШД и, тем не менее, эффективно транслирующихся [42-47]. Вдобавок, мутантные 30S рибосомы, лишенные содержащего анти-ШД З -конца 16S рРНК, оказались способны инициировать белковый синтез на аутентичных AUG-кодонах [48]. Позже было выяснено, что такое различие в поведении рибосом из различных организмов во многом объясняется отсутствием в большинстве геномов Грам-положительных бактерий рибосомного белка S1 (см. напр. [49]). Этот белок, с совершенно нехарактерной для рибосомных белков молекулярной массой, доходящей до ЭОкДа, жизненно необходим E.coli для трансляции in vivo [50], и для трансляции многих мРНК in vitro [51-54], в том числе и при отсутствии в них последовательностей ШД [49,55,56].
В последнем случае было показано, что именно S1 направляет 30S субчастицу в инициаторный район мРНК. На основании биохимических данных [56-58] была предложена модель, согласно которой S1 взаимодействует с U-богатыми участками мРНК, найденными во многих случаях в 5 -стороне от ШД [57], и что именно контакт SI-мРНК, а не ШД-антиШД, является первичной детерминантой узнавания рибосомой инициаторной области. Позднее, данные рентгеноструктурного анализа подтвердили непосредственное взаимодействие S1 с областью мРНК примерно в 11 нуклеотидах от ШД [59]. Но взаимосвязь S1 и ШД оказалось куда более интересной. Поиск аптамеров к содержащим и не содержащим S1 30S субчастицам дал прямо противоположные результаты [60]: SELEX к лишенным S1 рибосомам отбирает только молекулы РНК, содержащие «сильную» последовательность ШД, в то время как рибосомы дикого типа связываются с подобными олигонуклеотидами крайне неэффективно. Более того, лишенные S1 рибосомы не способны образовывать полноценный тройной комплекс 30S MPHK TPHK и терминируют обратную транскрипцию на З -границе ШД [31], что свидетельствует об отсутствии кодон-антикодонового узнавания. В тоже время, в присутствие S1 бинарный комплекс, как и ожидалось ввиду результатов SELEXa, не образовывался. Там же был проведен систематический анализ зависимости эффективности трансляции in vivo от «силы» ШД. Последовательность длиной 6 нуклеотидов, образующая с 16S рРНК дуплекс стабильностью -6,1 ккал/моль, оказалась оптимальной для экспрессии (3-галактозидазы, а при удлинении ШД экспрессия падала. На основании имеющихся на сегодняшний день данных представляется, что именно белок S1 обуславливает первичное связывание 30S субчастицы с мРНК, и этим объясняется активность т.н. «энхансеров трансляции» (см. далее) и необходимость S1 для инициации трансляции мРНК как содержащих, так и не содержащих ШД. Еще одним немаловажным фактором, определяющим эффективность инициации трансляции, является стерическая доступность области инициации [61-64]. Эксперименты с мРНК фага MS2 показали, что вторичные структуры в области инициаторного кодона и ШД, не превышающие по своей стабильности -6 ккал/моль, на эффективность трансляции не влияют, в то время как более прочное спаривание нуклеотидов ингибирует трансляцию примерно в 10 раз при увеличении стабильности шпилечных структур на 1,4 ккал/моль [61,62]. До настоящего времени не получено каких-либо доказательств использования прокариотическим трансляционным аппаратом каких-либо РНК-хеликаз, наподобие эукариотического фактора инициации elF4A (подробнее о нем см. в соответствующем разделе).
Структура эукариотических мРНК
Отличительной чертой всех эукариотических мРНК (за исключением мРНК органелл) является наличие на 5 -конце «кепа» [123,191], и наличие 50-200 нуклеотидной поли-(А)-последовательности на З -конце [192,193]. «Кэп» представляет собой метилированный по 7-му положению остаток гуанозина, соединенный с мРНК необычным 5 -5 трифосфатным линкером. Иногда так же метилируются прилежащие к «кэпу» нуклеотиды, как по азотистым основаниям, так и по 2 -гидроксильным группам рибоз. Обе упомянутые модификации мРНК являются ко-транскрипционными, и обеспечивают эффективную трансляцию мРНК и ее стабильность в цитоплазме. Поэтому неудивительно, что они вовлечены и в регуляцию трансляции, причем на совершенно разных стадиях развития клетки, и возникли они в процессе эволюции, по всей видимости, именно для эффективной регуляции белкового синтеза, так как лишенные этих элементов мРНК могут достаточно эффективно транслироваться in vitro [123,191,192] и in vivo [194,195]. В качестве инициаторного триплета, в отличие от прокариот, используется практически исключительно AUG [196], а инициация на GUG, CUG, AUU, или ACG [197-201] происходит менее эффективно [202,203] и являет собой исключение, нежели правило. Еще важным отличием является отсутствие в инициаторных областях эукариотических мРНК каких-либо участков, аналогичных последовательности ШД [204], хотя и периодически появляются публикации об обнаружении в 5 -НТО эукариотических мРНК участков комплементарности к самым разным областям 18S рРНК и об их участии в инициации [205-210]. Тем не менее, статистический анализ прилежащих к инициаторному AUG нуклеотидных последовательностей выявил явно неслучайный состав инициаторного района в мРНК эукариот [211-215]. Так, у позвоночных в сильно экспрессирующихся генах консенсус окружения инициаторного кодона представляет собой последовательность GCCGCCRCCAUGG(A/C)(U/G) [202,214,216].
В отличие от консервативного характера ШД у прокариот, эукариотический консенсус весьма широко варьирует у различных организмов. Сообщалось даже, что консенсус двудольных растений отличен от консенсуса однодольных [212], а у дрожжей он вообще ограничивается только наличием А в положении -3 [217]. 2.3 Сканирующая модель инициации трансляции На сегодняшний день общепринятой моделью инициации трансляции у эукариот является сканирующая модель, предложенная М.Козак и А.Шаткиным [218,219] для объяснения упоминавшихся выше отличий трансляции у эукариот от прокариот. По современной версии данной модели, инициация на эукариотических мРНК происходит следующим образом (см., напр., обзоры [220] и [25]). Первоначально, 40S субъединица рибосомы образует т.н. 43S комплекс, в состав которого входят также elF3, тройной комплекс elF2/GTP/MetRNAi, и, вероятно, elF1, elF1A и elF5 [221-223]. В последние пятнадцать лет получено множество свидетельств внутренней инициации [225,226], заключающейся в том, что компоненты инициаторного аппарата способны связыватся со сложными пространственными структурами, так называемыми IRES-элементами, которые обнаружены в 5 -НТО ряда вирусных и клеточных мРНК. Инициация в этом случае не зависит от наличия кепа. При связывании с некоторыми IRES-элементами иинциаторный кодон оказывается в непосредственной близости от Р-сайта 40S субчастицы и инициация протекает при минимальном сканировании или даже без него. В каждом из изученных случаев IRES-элементы представляют собой протяженные (более 300 нуклеотидов) участки РНК, образующие сложные пространственные структуры. Долгое время функции этого белка оставались практически не изучены, и лишь в последнее время исследователи обратили на него пристальное внимание, поскольку стало ясно, что elF1 является одним из самых интересных факторов инициации. Первоначально он был охарактеризован как белок, стимулирующий связывание тройного комплекса и мРНК с 40S [227-229] и, возможно, направляющий инициаторную тРНК в Р-сайт рибосомы [230]. Значительно позднее было показано, что этот 13 кДа белок структурно похож на С-концевой домен прокариотического фактора IF3 [151,231]. Более того, они сходным образом ориентированы на малой рибосомной субчастице и, возможно, вызывают в ней одинаковые конформационные изменения [232,233]. Неудивительно поэтому, что и свойства IF3 и eIF1 оказались очень похожи. Оба фактора играют определяющую роль в выборе инициаторного кодона (подробнее про функции IF3 см. в соответствующем разделе). Так, мутации в elF1 способны приводить к инициации на UUG-кодонах [234], а его отсутствие в экспериментах in vitro - к образованию 48S комплексов на триплетах CUG и AUU [232,235]. Как и IF3, elF1 дестабилизирует инициаторные комплексы, образованные слишком близко к 5 -концу мРНК [52,232,235,236]. Похожим образом elF1 способен «различать» контекст инициаторных кодонов, дестабилизируя инициаторные комплексы, образовавшиеся на триплетах с «плохим» окружением [235]. Интересно в связи с этим вспомнить, что сообщалось о возможной роли elF1 в поддержании правильности декодирования мРНК в ходе элонгации трансляции [237]. Однако этим роль данного фактора в инициации трансляции не ограничивается. Оказалось, что он блокирует индуцируемый elF5 (см. далее) гидролиз GTP фактором elF2 до тех пор, пока не образуется стабильный контакт инициаторного кодона мРНК и антикодона инициаторной тРНК [238-240].
После этого в рибосоме происходят конформационные изменения, приводящие к снижению сродства elF1 K40S субчастице практически на порядок [241]. Впрочем, elF1 по прежнему остается связанным с 48S комплексом [240], вероятно, за счет взаимодействия с elF3 [221,242]. Было показано непосредственное взаимодействие elF1 с eIF5 [242,243], однако конкретные стадии процесса инициации, на которых это взаимодействие образуется или разрывается, и блокирует ли этот контакт активность elF5 или стимулирует ее, остается неизвестным. Этот белок, являющийся ортологом прокариотического фактора IF1 [111,113], также имеет небольшой молекулярный вес (17-22 кДа) и его удаление летально для дрожжей [244]. Соответственно и свойства его можно разделить на консервативные и специфицеские для эукариот. Как и его прокариотический аналог, IF1, elF1A взаимодействует с elF5B/IF2 [183,222,245-247] и связывается с малой рибосомной субчастицей в районе А-сайта [248,249], и, по всей видимости, стимулирует посадку инициаторной тРНК в составе тройного комплекса в Р-сайт [227,229,250], аналогично своему прокариотическому ортологу [139,183]. elF1A, как и IF1, препятствует ассоциации рибосомных субчастиц [248], и, хотя в других работах этот факт оспаривается [250,251], расхождения можно объяснить различными условиями проведения экспериментов: при повышенной концентрации Мд++ (больше 4 mM) elF1A и elF1 теряют способность предотвращать ассоциацию рибосомных субчастиц. Возможно, in vivo elF1A белок препятствует также аберрантной агрегации 40S субчастиц с образованием димеров [252]. elF1A имеет неспецифические РНК-связывающие свойства [113,244], возможно, необходимые для взаимодействия с 18S рРНК [249], а также взаимодействует напрямую с elF2 и elF3 [222]. В системе сборки 48S in vitro elF1A увеличивает выход 48S комплекса и необходим для эффективного нахождения AUG-кодона на мРНК (З-глобина [236], однако практически не оказывает влияния на сборку 48S на мРНК с неструктурированной 5 -НТО, лишь немного увеличивая процессивность сканирования и стимулируя сборку комплекса в отсутствие факторов группы elF4 [235]. В клетке elF1A может подвергаться фосфорилированию, которое, вероятно, снижает его активность [253]. 2.4.3 elF2 Как уже упоминалось, наиболее существенным отличием эукариот от прокариот является наличие фактора elF2, основная функция которого заключается в доставке инициаторной тРНК на рибосому [246,254]. Хотя в литературе и описаны экзотические случаи инициации белкового синтеза без участия инициаторной тРНК [255,256] или вызывающие определенное сомнение случаи инициации на CUG-триплетах, кодирующих (в отличие инициации на триплетах, отличных от AUG, но распознаваемых инициаторной Мет-тРНК [199,199]) лейцин [257-259], во всех остальных случаях elF2 оказывается необходим. elF2 состоит из трех субъединиц, обозначаемых а, 3 и у (У млекопитающих 36, 38 и 52 кДа, соответственно). В литературе описано связывание elF2 с GTP, АТР, тРНК, мРНК, а из факторов инициации с elF2B, elF3 и elF5.
Факторы инициации 4-й группы eIF4A, 4В, 4G не являются абсолютно необходимыми для образования 48S комплекса на 5' -концевом IRES-элементе RhPV
Метод анализа инициаторных комплексов, реконструированных из очищенных факторов инициации и рибосом, посредством ингибирования обратной транскрипции впервые был предложен и применен в лаборатории Лари Голда [27] для изучения взаимодействия прокариотической 30S рибосомы с мРНК. Этот метод, получивший название тоу-принт (от англ. toe-print), был впервые адаптирован к изучению гораздо более сложно организованного трансляционного аппарата млекопитающих в нашей лаборатории для исследования функциональных особенностей IRES-элемента вируса энцефаломиокардита [492], и в дальнейшем широко использовался нашей группой и группой Т.Пестовой для выяснения роли индивидуальных белков в инициации трансляции и исследования механизмов функционирования различных клеточных и вирусных мРНК. И по сей день тоу-принт остается единственным подходом к изучению требования различных мРНК к факторам инициации. Тем не менее, несмотря на весь свой громадный потенциал, этот метод так и остался «привилегией» лишь нескольких научных групп в первую очередь VpG, а потому не должна зависеть от elF4E. Было бы логично предположить, что, как и в случае большинства IRESOB, для функционирования IRESa RhPV будут необходимы факторы elF4A, elF4B и elF4G6i3-i56o- Однако здесь нас поджидало непредвиденное. Как нами было показано ранее [374], фактор elF4B является ключевым компонентом инициаторного аппарата, необходимым для успешного сканирования структурированных участков мРНК, и не нужен для сканирования однотяжевых нуклеотидных последовательностей, а также значительно стимулирует образование 48S комплекса на IRES-элементе вируса энцефаломиокардита, правда в этом случае остается неясным, участвует ли он в сканировании или играет структурную роль. В нашем же случае, отсутствие фактора elF4B в реакционной смеси никак не сказывалось на эффективности сборки 48S-комплекса (ср. дорожки 2 и 4 на рис. 5). Это явилось косвенным указанием на возможное отсутствие в IRES-элементе RhPV стабильной вторичной структуры. Более того, полное удаление из реакционной смеси факторов группы elF4, хотя и снижало эффективность сборки 48в-комплекса почти в 4 раза, но, тем не менее, не приводило к полному отсутствию сборки. Наличие некоторого «остаточного» количества 485-комплекса можно было бы объяснить активностью примесных количеств факторов 4-й группы, загрязняющих остальные препараты факторов. Однако Вестерн-гибридизация препаратов факторов с антителами против elF4G не подтвердила это предположение (данные не представлены).
Более того, замена в реакционной смеси АТР его негидролизуемым аналогом AMPPNP, который ингибирует действие АТР-зависимой хеликазы elF4A, не снижала «остаточную» сборку 48в-комплекса (рис. 5, дорожка 8). Общепринятым тестом для доказательства зависимости или независимости трансляции мРНК от факторов 4-й группы является трансляция in vitro с добавлением доминант-негативного мутанта elF4A, в котором остаток аргинина-362 заменен на остаток глутамина. Такой белок, помимо отсутствия АТФазной активности, связывается с elF4G настолько прочно, что со временем вытесняет весь активный белок, «выводя из строя» elF4F. По всей видимости, это обусловлено происходящими в процессе гидролиза АТФ конформационными изменениями в elF4A, снижающими, в свою очередь, его сродство KelF4G. Попытки получить рекомбинантный elF4A(R362 Q) с плазмиды, любезно предоставленной д-ром Наумом Зоненбергом (Канада), закончились неудачей, поскольку, несмотря на наши усилия, весь белок уходил в тельца включения. Так способны различить эти эффекты. Таким образом, IRES-элемент RhPV, подобно большинству других IRES-элементов (за исключением IRESOB из IGR CrPV-подобных вирусов), не может функционировать без факторов elF2 и elF3. Однако, в отличие от хорошо изученных IRES-элементов кардио- и афтовирусов (представители пикорнавирусов), гепацивирусов и пестивирусов, в случае которых рибосоме не приходится сканировать протяженные участки мРНК, инициация трансляции на IRES-элементе RhPV зависит от elF1. Таким образом, представляется, что после первичного связывания 438-предынициаторного комплекса с мРНК RhPV последний осуществляет (при участии elF4G и elF4A) сканирование в поисках инициаторного AUG-кодона. Анализ целостности мРНК в ходе экспериментов Как уже упоминалось, основная опасность, подстерегающая экспериментатора при работе с РНК, это её деградация. Очевидно, что разрывы в цепи мРНК, особенно области, непосредственно предшествующей инициаторному AUG-кодону, могут существенным образом исказить результаты экспериментов. Например, любая получившаяся в результате деградации мРНК с небольшой неструктурированной 5 -НТО теоретически способна образовывать инициаторный 483-комплекс в отсутствие факторов elF4A, elF4B, elF4F.Стандартный подход к подтверждению целостности РНК в экспериментах in vivo и in vitro заключается в выделении РНК из клеток или инкубационной смеси и ее анализе Нозерн-гибридизацией. Основным недостатком этого метода является необходимость работы с высокорадиоактивным материалом. Чтобы избежать этой процедуры, нами был предложен другой подход. Котранскрипционно меченная a-[32P]-UTP мРНК RhPV использовалась в сборке из очищенных компонентов.
Затем реакционную смесь наносили на градиент сахарозы (5-20%) и центрифугировали 4,5 часа при скорости 33000 об/мин в роторе SW41 (Beckman) для разделения 48S комплекса и несвязавшейся мРНК. РНК из обоих пиков экстрагировали смесью фенол-хлороформ, переосаждали и наносили на денатурирующий полиакриламидный гель, и анализировали посредством Фосфоримиджера. Подобным образом мы проанализировали сборку 488-комплекса на мРНК RhPV в присутствии и в отсутствие факторов инициации группы 4. Профили Для анализа вторичных структур б -нетранслируемой области мРНК RhPV мы использовали следующие реагенты: DMS (диметилсульфат) - метилирует N7 гуанина, N1 в аденина, и, в меньшей степени, N3 цитозина, и СМСТ (мето-р- толуолсульфонат 1 -циклогексил-3-(2-морфол ино-этил)-карбодиимид) модифицирует N3 урацила и, менее эффективно, N1 гуанина. При этом, за исключением реакции с остатками гуанина, эти модификации затрагивают функциональные группы азотистых оснований, участвующие в образовании водородных связей с комплементарными основаниями. Таким образом, удается провести реакцию только с основаниями, не участвующими в образовании внуртимолекулярных водородных связей. Также в работе были использованы рибонуклеазы Т1 (специфична к неспаренным и ненаходящимся в стекинге остаткам гуанина), Т2 (неспецифично гидролизует одноцепочечные участки РНК) и V1 (специфична к основаниям, вовлеченным в пространственные взаимодействия, в том числе в стекинг). При последующей обратной транскрипции с меченного праймера, отожженного к исследуемой молекуле РНК, ревертаза терминирует синтез кДНК на основании, предшествующем модифицированному химическими реагентами или нуклеазами. Анализ полученных кДНК электрофорезом в 6% ПААГ в сопоставлении с кДНК сиквенсных реакций, выполненных с использованием того же праймера, позволяет определить, какие основания подвергаются модификации или гидролизу нуклеазами, и, стало быть, не участвуют в образовании вторичных структур. Все реакции модификации и ферментативного гидролиза проводились в условиях, идентичных используемым нами при реконструкции инициаторных 48S комплексов из индивидуальных компонентов (прежде всего, это концентрация ионов К+ и Мд++), поэтому полученные структуры мРНК объективно отражают их состояние в условиях образования инициаторных комплексов. Данные пробинга (некоторые из гелей представлены на рисунках 11А-В), несмотря на отсутствие анализа вовлеченности в пространственные взаимодействия остатков цитидина, а также неканонических вариантов спаривания нуклеотидов, можно с уверенностью утверждать, что AUG-проксимальный участок 5 -НТО находится практически полностью в одноцепочечной конформации. Схематически степень вовлеченности в спаривание оснований на различных участках 5 -НТО мРНК RhPV представлена нарис. 11 Г.
Рибосомная 40S субчастица и фактор инициации eIF3 образуют стабильный комплекс с IRES-элементом RhPV
Из представленных данных можно заключить, что функционально активной частью изучаемого IRES-элемента является слабоструктурированная 3 -концевая область. Можно утверждать также, что IRES-элемент RhPV из 5 -НТО его мРНК не содержит высокоспецифичных сайтов связывания компонентов инициаторного аппарата. Именно этим объясняется способность данного IRESa функционировать в различных системах в противоположность IRES-элементам афто-, пести- и флавивирусов, которые обладают сродством к факторам инициации и/или рибосомным субчастицам только из клеток млекопитающих, и, потому, способны направлять трансляцию только в соответствующих системах. По всей видимости, данный IRES вместо рекрутирования трансляционного аппарата посредством одного высокоспецифичного сайта работает посредством множества тандемных низкоафинных сайтов, которые, будучи расположенными в непосредственной близости друг от друга, способствуют достаточному для эффективной трансляции повышению локальной концентрации факторов инициации (напр., elF4G и elF3) и/или рибосом вблизи инициаторного AUG-кодона. Этим объясняется уникальная возможность удалять значительные участки IRES-элемента без потери активности, что является существенным отличием от «классических» IRES-элементов, в случае которых замены или делеции даже одного нуклеотида приводят к полной потере активности. Можно предположить, что минимальный размер индивидуального сайта посадки должен быть достаточным чтобы вместить хотя бы одну 40S субчастицу и elF3, т.е. иметь размер порядка 50-100 нуклеотидов. Можно предположить, что 40S рибосомная субчастица (при содействии elF3) способна связывать одноцепочечный U-богатый 54RES RhPV даже в отсутствие факторов группы elF4. Образовавшийся комплекс способен связывать тройной комплекс elF2 TPHK GTP и осуществлять зависимое от elF1 сканирование в поисках AUG-кодона. Подобный механизм очень напоминает последовательность событий в прокариотах, где первичное связывание с мРНК осуществляет в U-богатых областях рибосомный белок S1, а функции elF1 выполняет IF3. Образование 488-комплексов в отсутствие факторов 4-й группы и АТР было описано для искусственной мРНК, содержавшей 100% неструктурированную 5 -НТО, состоявшую из 19 повторов САА [235]. Однако, данный лидер не функционировал как область внутренней посадки рибосомы. По всей видимости, это объясняется тем, что авторы использовали слишком короткую последовательность (около 40 нуклеотидов).
Хотя нельзя исключать возможность влияния нуклеотидного состава одноцепочечных областей на эффективность их работы в качестве IRES-элементов, о возможности направлять трансляцию в различных бесклеточных системах, а также in vivo, сообщалось для IRESOB, представленных длинными богатыми пуриновыми нуклеотидами последовательностями [493]. Наши данные не позволяют нам утверждать, что любая одноцепочечная последовательность мРНК может работать как IRES в любых in vitro или in vivo системах. Тем не менее, они показывают, что для эукариотической рибосомы не существует никаких препятствий для связывания с внутренними участками мРНК, в отсутствие специфических участков связывания. Это противоречит строгим правилам сканирующей модели в ее классическом виде, но, в тоже время, существенно дополняет ее. Таким образом, наши данные являются еще одним доказательством сходства аппаратов инициации эукариот и прокариот. Необходимо отметить, что низкое содержание остатков гуанина и цитидина в 5 -НТО, как это имеет место в случае мРНК RhPV, не является характерным для остальных представителей рода криповирусов (CrPV, Drosophila С virus, Shrimp paralysis virus, Plautia stali intestinal virus и ряда других), которые, по всей видимости, содержат «классические» IRESbi, т.к. их 5 -НТО имеют большое содержание гуанина и цитидина, а также содержат множественные AUG-кодоны, некоторые из которых находятся в оптимальном нуклеотидном окружении. Примечательно, что 54RES CrPV, в отличие от RhPV, не функционирует в экстракте проростков пшеницы [482]. 1. Исследован механизм образования 48S инициаторного комплекса на 5 -концевом IRES-элементе мРНК RhPV (Rhopalosiphum padi virus). Показано, что для инициации на данном IRESe необходимы факторы инициации elF1, elF2, elF3. Факторы elF1A и elF4G с 4А существенно стимулировали образование 48S, в то время как elF4B не оказывал никакого влияния. 2. Охарактеризована вторичная структура 5 -НТО мРНК RhPV. 3. Показано, что активность IRES-элемента RhPV определяется AUG-проксимальной U-богатой последовательностью мРНК, находящейся преимущественно в одноцепоцечной конформации. 4. Установлено, что данная последовательность способна образовывать стабильный комплекс с 40S субчастицей и фактором инициации elF3. 5. Показана принципиальная возможность связывания 40S рибосомной субчастицы с неструктурированными внутренними участками мРНК с последующим образованием инициаторного комплекса. 1. Реактивы и материалы. В работе были использованы следующие реактивы и материалы: немеченые дезоксирибонуклеозид-5 -трифосфаты, рибонуклеозид-5 - трифосфаты фирмы Pharmacia (Швеция), a-[32P]-dATP и у-[32Р]-АТР из Обнинска, [353]-метионин фирм Amersham Biosciences и ICN Radiochemicals (последний любезно предоставлен Т.В.Пестовой). 1,4-дитио-0,1_-треитол (DTT); 3- меркаптоэтанол фирмы Serva (Германия); акриламид, N.N - метиленбисакриламид, персульфат аммония и N,N,N ,N - тетраметилэтилендиамин фирм Serva (Германия), Reanal (Венгрия) и Хеликон (Россия); агароза фирмы Sigma (США), СМСТ фирмы Pierce (Франция), DMS фирмы Aldrich, PMSF (Хеликон). В качестве красителей для электрофореза использовали бромфеноловый синий фирмы Merck (Германия), кселенцианол фирмы Chemicals (Англия). Использовали неорганические реагенты фирм Sigma (США) и Merck (Германия). В работе использовали бактоагар, бактотриптон, дрожжевой экстракт фирмы DIFCO (США); ампициллин и канамицин завода "Синтез" (Пенза). Использованные в данной работе олигонуклеотиды были синтезированы на фирмах Synthol и ЛИТЕХ (обе - Россия). Биопрепараты: обратная транскриптаза из AMV фирмы Promega (США), ингибитор рибонуклеаз фирмы Fermentas (Литва), рибонуклеазы Т1, Т2 и V1, эндонуклеазы рестрикции фирм Fermentas и Сибэнзим (Россия), полинуклеотидкиназа, ДНК-лигаза и ДНК-полимераза фага Т4, РНК-полимераза фага Т7 фирмы Fermentas, набор для секвенирования ДНК фирмы USB (США), маркеры молекулярного веса ДНК и белков фирм Fermentas и GibcoBRL (США), свободная от РНКаз ДНКаза RQ1 фирмы Promega (США). При клонировании использовали штаммы Е. coli: JM109 - для выделения плазмид, BL21, BL21(DE3) и BL21(DE3)RIL - для получения рекомбинантных белков. 2. Плазмидные конструкции. Плазмида pLuc была создана путем вставки содержащего последовательность люциферазы Firefly фрагмента BamHI-Xhol из плазмиды pGEM-Luc (Promega) в аналогично порезанную плазмиду pSP72 (Promega). Для создания плазмиды pRhPV-Luc, фрагмент BamHl- BamHI из плазмиды pGEM-CAT/RhPVA1/LUC [491] был лигирован в порезанную по BamHI-сайту плазмиду pLuc. Во избежание каких-либо эффектов чужеродной нуклеотиднои последовательности, остаток полилинкера pSP72 был удален путем вырезания из pRhPV-Luc фрагмента ДНК между сайтов Bsal и BamHI.
