Содержание к диссертации
Введение
I. Зрительный пигмент - родопсин 14
1. Свободный хромофор 14
2. Спектральные характеристики ретиналя 16
3. Связь ретиналя с белком и хромофорные центры ретиналь-содержащих белков 18
II. Фотоиндуцированные превращения зрительных пигментов 30
1. "Световые" процессы 30
2. Батородопсин и гипсородопсин 32
3. Первичный фотохимический акт в процессе зрительного возбуждения 33
4. "Темновые" процессы 40
III. Преобразование энергии света в зрительных клетках 44
1. Ионы кальция как внутриклеточный медиатор 45
2. ГМФ как внутриклеточный медиатор 48
3. Ферменты наружных сегментов зрительной клетки . 49
4. Ферментативный каскад усиления сигнала света 54
5. Этапы зрительного процесса 62
ІV. Бактериородопсин 66
I. Фотохимический цикл бактериородопсина 69
Результаты и обсуждение 78
I. Выделение и характеристика бактериородопсина и родопсина 79
II. Методология определения первичной структуры интегральных мембранных белков 81
1. Ферментативные и химические методы расщепления мембранных белков 82
2. Разделение гидрофобных пептидов 85
3. Определение первичной структуры мембранных белков 87
III. Первичная структура бактериородопсина 92
ІV. Структурная модель бактериородопсина в пурпурной мембране . 100
1. Ограниченный протеолиз 100
2. Связь хромофора с белком 103
3. Упаковка бактериородопсина в мембране 105
У. Структурно-функциональный анализ бактериородопсина . 108
VІ. Первичная структура родопсина 114
VII. Структурная модель организации полипептидной цепи родопсина в фоторецепторной мембране 123
I. Ограниченный протеолиз 124
Экспериментальная часть 137
1. Материалы 138
2. Выделение, характеристика и определение первичной структуры бактериородопсина 139
3. Структурно-функциональное изучение бактериородопсина 154
4. Выделение, характеристика и определение первичной структуры родопсина 159
5. Топография родопсина в фоторецепторной мембране . 167
Выводы 170
Литература
- Спектральные характеристики ретиналя
- Первичный фотохимический акт в процессе зрительного возбуждения
- Ферменты наружных сегментов зрительной клетки
- Выделение и характеристика бактериородопсина и родопсина
Введение к работе
В настоящее время изучение физиологических основ функционирования биологических мембран становится одним из быстро развивающихся направлений биоорганической химии и молекулярной биологии. Стремительный прогресс в развитии этих дисциплин позволил подойти к глубокому исследованию таких важнейших проблем мембранологии как транспорт ионов через биологические мембраны, нервная проводимость гормональная рецепция и т.д. Качественно новый характер приобрело и изучение давно уже ставшей классической проблемы фоторецепции. Исследование структуры и функции фоторецепторных мембран зрительных клеток представляет особо большой интерес, поскольку в этой мембране совершается один из важнейших физиологических процессов - процесс поглощения и трансформации энергии света. Очевидно, изучение механизма фоторецепции на молекулярном уровне представляет собой одну из актуальных задач современной физико-химической биологии. Именно этим определяется интерес к детальному изучению родопсина -светочувствительной антенны фоторецепторной клетки, а также белков, принимающих непосредственное участие в усилении и преобразовании энергии света.
Проблемам фоторецепции и утилизации энергии света уделено большое внимание в постановлениях ЦК КПСС иСовета Министров СССР от 19 апреля 1974 года "О мерах по ускорению развития молекулярной биологии и молекулярной генетики и использовании их достижений в народном хозяйстве" и от 24 июня 1981 года "О дальнейшем развитии физико-химической биологии и биотехнологии и использовании их достижений в медицине, сельском хозяйстве и в промышленности".
Ключевым вопросом в структурно-функциональных исследованиях зрительных пигментов является изучение механизма передачи сигнала от молекулы родопсина, локализованной в морфологически изолированных мембранах фоторецепторных дисков, на плазматическую мембрану и далее на синаптическое окончание зрительной клетки.
Известны две гипотезы, объясняющее механизм этого процесса. Первая из них рассматривает молекулу родопсина как активируемый светом ионный канал, обеспечивающий поступление ионов кальция из внутридискового пространства в цитоплазму и тем самым регулирующий степень поляризации плазматической мембраны. Суть второй гипотезы состоит в том, что молекула родопсина, поглотившая квант света, участвует в регуляции активности ферментативного комплекса, контролирующего уровень внутриклеточного медиатора - циклического гуанозинмонофосфата.
Несмотря на неоднозначность физиологических трактовок механизма зрительной фоторецепции, не вызывает сомнения трансмембранный характер расположения молекулы родопсина. Следовательно, архитектура этого белка в мембране на молекулярном уровне может определять истинный механизм его функционирования. Во многих лабораториях в нашей стране и за рубежом получена обширная информация о свойствах зрительных пигментов, охарактеризована каждая отдельная стадия фотолиза,установлена структура и функциональная значимость хромофора этих пигментов - ретиналя. Однако, сам механизм функционирования родопсинов остается не выясненным. В частности, практически ничего не известно о том, какие аминокислотные остатки белка образуют активный центр, какой аминокислотный остаток отвечает за связывание хромофора и, наконец, какова природа конформационных изменений белка, приводящих к активации ферментативного каскада. Дальнейший
прогресе в изучении этих вопросов в значительной степени тормозится отсутствием данных о первичной структуре родопсина.
Не менее интересным в плане понимания функционирования родопсина представляется изучение близкого аналога зрительных пигментов - бактериородопсина, функционирующего в клетках некоторых галофильных микроорганизмов по принципу активируемого светом протонного насоса. Исследования бактериородопсина представляется важным не только для понимания механизма функционирования ионных каналов, его сходство по ряду физико-химических характеристик (наличие связанного ретиналя, светочувствительность и т.д.) со зрительным родопсином делает привлекательным сравнительное изучение обоих белков с целью познания общих принципов работы фотоактивируемых мембранных систем.
Основной целью настоящего исследования явилось определение полных аминокислотных последовательностей бактериородопсина и зрительного родопсина. Главная сложность в решении этой задачи заключалась в высокой гидрофобности этих белков и, как следствие, плохой растворимости их в водных средах. Следовательно, определение первичной структуры родопсина и бактериородопсина не могло базироваться на известных методах исследования первичной структуры гидрофильных белков. Это обстоятельство выдвинуло в качестве первостепенной задачи необходимость разработки новых методических приемов к структурному анализу интегральных мембранных белков.
Продолжением работ по определению структуры этих белков явилось установление их топографии в нативных мембранах, равно как выяснение строения их активных центров и размещение функционально важных группировок, что явилось основой для решения ряда вопросов, связанных с выяснением механизмов функционирования
этих пигментов.
Автор выражает свою глубокую признательность академику Ю.А.Овчинникову за постоянное внимание к этой работе.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Спектральные характеристики ретиналя
Интересно отметить, что понижение температуры до 77К повышает экстинкцию на 60%, что объясняется наличием в этих условиях смееи 12--цис и более устойчивых 12-,9-транс конформеров ретиналя (34,37,39). В настоящее время общепринято считать, что увеличение экстинкции 11-цис ретиналя при охлаждении обусловлено предпочтительной стабилизацией I2-S-транс конформеров, что достигается за счет его большего, по сравнению с 12--цис формой,дипольного момента, который приводит к повышенной электростатической стабилизации с увеличением плотности растворителя, (44). Две другие полосы спектра поглощения ретиналя при 254 и 280 ни обусловлены наличием, соответственно цис и 6--транс конформеров (45).
Имеющиеся в настоящее время данные позволяют утверждать, что ретиналевый хромофор образует с белком - опсином альдиминную связь. В образовании такой связи, детальная природа которой все еще остается предметом оживленных дискуссий участвует альдегидная группа ретиналя и -аминогруппа одного из остатков лизина. Как указывалось ранее, при связывании с белком хромофор претерпевает ряд изменений в его спектральных свойствах. Наиболее заметным из этих изменений является сдвиг его спектрального максимума полосы поглощения от 380 до 620 нм. Считается, что такой сдвиг обусловлен протонированием альдимина (46).
Согласно квантово-механическим расчетам, протонированный альдимин в вакууме имел бы полосу поглощения с максимумом при 597 нм (47), которая претерпевала бы гипсохромный сдвиг при сближении противоиона с атомом азота (48). Таким образом, чтобы объяснить различия в положении полос поглощения ретинальсодержащих белков, достаточно допустить, что их простетические группы, находясь в относительно неполярном окружении, расположены на разном расстоянии от отрицательно заряженной группы, например, карбоксилатной группы остатка аспарагиновой или глутаминовой кислоты. Действительно, при росте радиуса аниона и уменьшении полярности растворителя у про-тонированных альдиминов наблюдается смещение полосы поглощения в длинноволновую область (49-51). Следует заметить, однако, что положение максимума полосы поглощения протонированного альдимина определяется не только расстоянием между атомом азота и противо-ионом, но также конформацией полиеновой цепи (33,39,52,53), поляризуемостью окружения (51,54-56) и дополнительными электростатическими взаимодействиями (57-61).
Переход протонированного альдимина ретиналя из основного в возбужденное состояние сопровождается смещением положительного заряда от атома азота к & -иононовому кольцу (48,62), поэтому факторы, способствующие или препятствующие делокализации электронной плотности в системе сопряженных двойных связей, вызывают соответственно бато- или гипсохромный сдвиг полосы поглощения. Если батохромный сдвиг полосы поглощения протонированного альдимина обусловлен его взимодействием с заряженными группами или диполями, то вызванное таким взаимодействием уменьшение кратности двойных связей должно проявиться в уменьшении частоты валентных колебаний С=С Н Q_Q) (63). Что же касается батохромного сдвига, индуцированного лекополяризуемыми растворителями, то его причина заключается в том, что окружающие полиен наведенные диполи могут быстро переориентироваться и стабилизировать возбужденное состояние (54). Такого рода стабилизация, естественно, не может сказаться на величине с_с» которая характеризует основное состояние молекулы (63). Это позволяет экспериментально оценить вклады поляризуемости белкового окружения и электростатических взаимодействий в спектральные характеристики ретинальсодержащих белков. На рис. 4 видно, что положение максимума полосы поглощения родопсина, бактериородопсина и некоторых промежуточных продуктов фотоиндуцированных превращений этих хромопротеидов связано с величиной \) Q_Q линейной зависимостью. Такая зависимость свидетельствует, во-первых, о наличии электростатических взаимодействий в хромофорном центре родопсина и бактериородопсина и, во-вторых, о том, что белковое окружение простетических групп в этих хромопротеидах сходно по своей поляризуемости.
Первичный фотохимический акт в процессе зрительного возбуждения
Пожалуй, наиболее важной стадией фотохимических превращений зрительных пигментов является первая, светозависимая реакция образования батоформы, поскольку именно на этом этапе запасается энергия, которая расходуется при последующих темновых"превращениях. Установлено, что образование батородопсина сопровождается увеличением потенциальной энергии белка на 35 ккал/моль и что любой промежуточный продукт, образующийся в процессе обесцвечивания родопсина, не может в темноте превратиться в исходный хромопро-теид (190,191).
Батородопсин был впервые идентифицирован как первичный продукт фотолиза родопсина Иошизавой (192,193). Батородопсин устойчив при 77К . Использование методов лазерного фотолиза позволило проследить основные этапы распада этой промежуточной формы, как при низких, так и физиологических значениях температур (171,194, 195,196-199).
В настоящее время имеются данные о том, что в некоторых случаях образованию батородопсина макс 530 предшествует появление гипсородопсина со спектральным максимумом полосы поглощения при 430 нм. Гипсородопсин был обнаружен в качестве стабильной при 4,2К промежуточной формы фотолиза родопсина из сетчатки быка (171), кальмара (196) и лягушки (200). Однако, вопрос о том, является ли гипсородопсин действительно предшественником батородопсина, остается неясным. Опыты с родопсином кальмара,выполненные при комнатной температуре и пикосекундном разрешении,позволили показать, что накопление батородопсина четко совпадает с поздними этапами (45 пикосекунд) распада гипсородопсина. Кинетика образования самого гипсородопсина была выяснена в опытах,проведенных при температуре 77К (201). Используя фотостационарные методы, была показана возможность образования гипсородопсина из родопсина быка. Здесь же было показано, что при температуре выше 22 К, гипсородопсин переходит в батородопсин. Однако в ряде случаев в опытах, проведенных с родопсином из сетчатки быка в пи-косекундных интервалах времени и температурах от 4 до 290К, не удалось обнаружить сдвинутую в синюю область спектра характерную полосу гипсородопсина (202-204).
Четкая интерпретация имеющихся результатов еще более затрудняется и в связи с полученными недавно данными о том, что при фотолизе родопсина осьминога появлению батородопсина предшествует образовали гипсородопсина (205). Таким образом,результаты настолько противоречивы, что в настоящее время трудно ответить на вопрос о том, является ли гипсородопсин предшественником или конкурирующей промежуточной формой батородопсина. В последующих обсуждениях моделей первичного фотохимического акта мы допускаем, что образование гипсородопсина не предшествует батородопсину. Это, конечно, не означает, что в ближайшее время не появятся такие модели, которые учитывали бы образование гипсородопсина в качестве первичного фотопродукта. Для объяснения молекулярных изменений, связанных с первичным фотохимическим актом в процессе зрительного возбуждения, было предложено несколько моделей.
В основу первой модели механизма первичного акта зрительной рецепции было положено наблюдение, что батородопсин является промежуточным продуктом светозависимого превращения родопсина в изородопсин - также фотоактивный хромопротеид, содержащий, однако, остаток 9-цие-ретиналя. Поскольку в хромофорах родопсина и изородопсина двойная связь с цис-конфигурацией находится в разных местах цепи, а в результате фотоиндуцированных реакций обоих этих пигментов в конечном итоге образуется полностью-транс-ретиналь, вполне разумно предположить, что последний является простетической группой батородопсина, т.е. что после поглощения кванта света родопсином или изородопсином происходит изомеризация двойной связи (206). Это предположение, получившее развитие во многих теоретических работах (207-212), полностью согласуется с тем, что батоформы родопсина, изородопсина и 7-цис-аналога родопсина спектрально неразличимы (213-215). Заметим, что цис-транс-изомеризация остатка ретиналя неминуемо должна привести к определенным изменениям его ориентации относительно белка и мембраны в целом. Действительно, образование батоформы сопровождается уменьшением угла наклона переходного дипольного момента хромофора к плоскости мембраны от 18 до 0 (216) и изменением знака .-полосы в спектре Щ (кругового дихроизма) (217,218). Наконец, анализ резонансных спектров КР (комбинационного рассеивания) привел к выводу, что батородопсин содержит остаток полностью-транс-ретиналя, который имеет скрученную конформацию (219-221).
Известно, что при физиологических температурах батородопсин образуется за несколько пикосекунд (222,223), тогда как фотоизомеризация модельных протонированных альдиминов происходит, по-видимому, за II не (224,225). Установлено также, что батоформе, образующейся из родопсина головоногих, прещшествует гипсородопсин, в котором альдимин ретиналя, как полагают, депротонирован (201, 226-228).
Ферменты наружных сегментов зрительной клетки
а) Многочисленные опыты, проведенные как на целых НСП, так и на фоторецепторных дисках, показали, что выброс кальция в расчете на одну обесцвеченную молекулу родопсина варьирует в пределах от 20 до 1000 ионов (293-295). Однако, тщательный анализ показывает, что для обеспечения необходимого изменения проводимости требует ся значительно больше кальция (7). К этому следует добавить и то, что выход кальция из искусственных липидных визикул со встроенным родопсином также не соответствует количественным и временным параметрам,необходимым для достаточно быстрого эффекта (296). Таким образом, вопрос о том, достаточно ли наблюдаемое в опытах фотоиндуцированное повышение цитоплазматической концентрации кальция для того, чтобы объяснить фактическое усиление сигнала света на этапе родопсин-плазматическая мембрана,остается открытым.
б) Опыты по высвобождению кальция из НСП в присутствии ионо Фора A23I87 (297) указывают на то, что время, необходимое для диффузии ионов кальция от дисков до плазматической мембраны , равно 300 мсек. Время такой диффузии для молекулы воды, в то же время, составляет около I мсек. Такое большое различие во времени можно было бы объяснить тем, что в цитоплазме имеется значитель ное число отрицательно заряженных центров связывания кальция. При условии, что ионы кальция выполняют роль медиатора, следовало ожидать, что время его диффузии от обесцвеченной молекулы родоп сина до плазматической мембраны является лимитирующим этапом в возникновении рецепторного потенциала. Время возникновения еди ничных скачков фотоэлектрического тока должно при этом значитель но различаться в зависимости от того, находится ли обесцвеченная молекула родопсина близко к плазматической мембране или на до статочном расстоянии от нее.Такая корреляция, однако, никем не обнаружена (298). Таким образом, остается опять-таки неясным, где локализован запас ионов кальция в палочках в темноте и какова их динамика на свету.
в) Ряд данных говорит в пользу того, что продолжительная ин кубация палочек в средах с низкой концентрацией кальция (ЮМ) приводит к ее значительной десенсибилизации (286). Согласно дру гим данным (299) палочка полностью десенсибилизируется даже при инкубации с ЭДТА в течение 10 минут. В то же время имеются данные (300), указывающие на то, что высвобождение кальция из дисков целых палочек происходит крайне медленно в среде с ЭДТА.
С другой стороны, десенсибилизация не наблюдается в течение продолжительной инкубации палочки в присутствии кальциевых ионо-(їоров Х537А, A23I87 и внеклеточных концентрациях кальция ЮМ (294), что полностью противоречит данным, представленным в работе (300).
г) Считается, что светоиндуцированное накопление ионов каль ция в колбочках происходит за счет его запасов во внеклеточной среде. Поэтому, неудивительно, что наблюдаемое при понижении вне клеточной концентрации кальция до 10- исчезновение ответа кол бочки на свет было оценено как доказательство в пользу медиатор ной роли кальция. Однако ряд данных показывает, что световой от вет колбочек не исчезает сразуги требуется довольно большое время, чтобы полностью предотвратить этот ответ (301). Следовательно, кальциевая гипотеза в ее первоначальной интерпретации не согласу ется и с этими данными.
д) Пожалуй, наиболее сильным аргументом против кальциевой гипотезы является то, что до сих пор не удалось найти в НСП систе му, способную активно аккумулировать ионы кальция в темноте.
Таким образом, полученные за последнее время результаты настолько противоречивы и заставляют все больше думать о том, что в регуляции проводимости плазматической мембраны участвует сложная система, основными элементами которой являются не только ионы кальция.
В следующей главе будут рассмотрены результаты биохимических исследований, касающиеся нуклеотидного обмена в фоторецепторах и его роли в процессах усиления светового сигнала.
Электрофизиологические и биохимические данные последних лет показали, что цГМФ может конкурировать с ионами кальция на роль внутриклеточного медиатора в процессах превращения энергии света в биологический сигнал в зрительной клетке. Результаты этих работ можно коротко просуммировать следующим образом: а) НСП содержит необычно высокие концентрации (70 тМ) цГМФ; б) уровень цГМФ в НСП резко снижается при освещении (302,303); в) НСП содержит цГМФ специфическую светоактивируемую фосфо диэстеразу (304); г) одна обесцвеченная молекула родопсина катализирует гидро лиз 4 х 10 молекул цГМФ в секунду (305), следовательно, каждая фотолизованная молекула родопсина активирует до 100 молекул фос фодиэстеразы;
Выделение и характеристика бактериородопсина и родопсина
Необходимость разработки метода глубокого ферментативного гидролиза обусловливалась важностью получения информации, необходимой как для определения структуры крупных пептидов - продуктов расщепления белка химическими методами, так и для установления порядка расположения этих пептидов.
Метод ферментативного расщепления, традиционно используемый при изучении первичной структуры глобулярных белков, в классическом варианте оказался непригодным в случае мембранных белков. Водные суспензии делипидированных белков оказались непригодными для проведения глубоких и количественных ферментативных гидролизов. Успеха не имели и попытки провести гидролиз белков в низких концентрациях ионных или неионных детергентов. Во всех этих случаях действие ферментов сопровождалось образованием лишь небольшого набора пептидов с различными и чаще всего малыми выходами. Одним из возможных объяснений является то, что как суспензии, так и со-лгобилизированные препараты мембранных белков представляют собой крупные агрегаты, практически недоступные действию ферментов.
В поисках возможных путей осуществления ферментативного гидролиза предпринимались попытки расщепления белков непосредственно в мембране (424-429). В этих условиях происходило их расщепление на два или три крупных фрагмента с выщеплением незначительного числа пептидов в водную фазу. Связанные с мембранами фрагменты представляли собой небольшие белки, установление первичной структуры которых было сопряжено с такими же трудностями, как и в случае целых белков. Поэтому, хотя ограниченный протеолиз позволял получить полезную информацию на завершающих этапах определения первичных структур и сыграл важную роль при выяснении топографии белков в мембране, он не исключил необходимость проведения глубокого ферментативного гидролиза (430-434).
Известно, что под действием света молекулы бактериородопсина и родопсина подвергаются незначительным конформационным изменениям (8). Эти изменения становятся более заметными после удаления молекулы хромофора. Можно было ожидать, что в образовавшихся апобелках (бактериоопсине и опсине) в отличие от нативных белков, значительные участки полипептидных цепей будут находиться в непосредственном контакте с водной фазой и доступны действию ферментов. Однако это предположение оказалось справедливым только в случае опсина, о чем свидетельствовало появление в супернатан-те, полученном после его расщепления химотрипсином, большого числа коротких пептидов (435). В мембранносвязанном состоянии при этом оставалось несколько фрагментов, устойчивых к действию химотрипсина. Отметим, что аналогичный гидролиз бактериоопсина проводил, как и в случае нативного белка, к образованию лишь двух крупных фрагментов (436). Это означает, что конформационные изменения, происходящие при переводе бактериородопсина в бакте риоопсин, не обнажают каких-либо дополнительных участков белка, доступных действию ферментов.
Нами было показано, что делипидировэнные препараты бактерио-родопсина могут быть растворены в насыщенных растворах гуанидин-гидрохлорида. Медленный диализ такого раствора против понижающихся концентраций (до 2 М) мочевины позволил сохранить белок в солюбилизированном состоянии. Полученные таким образом препараты бактериоопсина подвергались достаточно глубокому ферментативному гидролизу (437).
Для проведения глубокого ферментативного расщепления опсина использовался еще один прием, заключающийся в фрагментации молекулы белка, иммобилизованного на твердом носителе (438). Иммобилизация опсина на тиол-стекле достигалась за счет реакции тиол-дисульфидного обмена между свободными сульфгидрильными группами белка и носителя. Ковалентно связанные с носителем молекулы белка становились доступными действию ферментов. Это, вероятно, происходит за счет уменьшения склонности ковалентно связанного с носителем белка к агрегации и сопутствующих иммобилизации структурных перестроек опсина, что благоприятствует его взаимодействию с ферментом.
Опсин, иммобилизованный на твердом носителе, может быть легко отделен от липидов с помощью различных детергентов или органических растворителей и затем подвергнут фрагментации как ферментативными, так и химическими методами. Показанная впервые нами возможность достижения высокой степени (95$) иммобилизации позволяет использовать этот метод в качестве мощного инструмента для анализа структуры мембранных белков.
