Введение к работе
I. . 1.1. Актуальность проблемы.
Биосинтез белка на рибосомах (трансляция) является одним из основных этапов реализации генетической информации в клетке. Понимание молекулярного механизма процесса трансляции требует установления с высоким разрешеїгием пространственной структуры рибосомы, а также взаиморасположения лигандов и компонентов рибосомы в процессе трансляции. Рибосома прсдставляеі собой сложный рибонуклеопрогеидный комплекс, состоящий из двух субчастиц: малой и большой. Малая (30S) субчастица рибосом Escherichia colt содержит протяженную молекулу 16S рРНК и 21 белок. В состав большой субчастицы (50S) входят две молекулы рРНК: 5S и 23S рРНК, сильно отличающиеся по длине, а также 34 белка. В процессе трансляции с рибосомой связываются лиганды: молекула мРІІК, две молекулы тРНК и несколько белковых факторов, способствующих осуществлению различных этапов процесса биосинтеза белка. В настоящее время установлено, что рРНК играют ключевую роль в процессе функционирования рибосомы. Таким образом, изучение структуры рРНК в составе рибосомы, ее контактов как с компонентами рибосомы, так и с лигандами является фундаментальной проблемой, без решения которой невозможно понимание механизма работы белок-синтезируютей системы клетки.
Хотя структура и функции рибосомы изучаются более 30 лет различными методами, к моменту начала выполнения данной работы количество достоверных данных о контактах мРІІК с рибосомной РНК и белками, пространственной организации элементов декодирующего центра малой субчастицы было весьма оіраничено, еще меньше информации было доступно о взаиморасположении различных элементов структуры рРНК большой субчастицы рибосом.
Следует отметить, что применение метода рентгено-структурного анализа для изучения структуры рибосом весьма затруднительно. Хотя кристаллы рибосом получены достаточно давно, а в настоящее время разработаны и методы введения тяжелых атомов в определенные точки рибосомы, тем не менее определение структуры рибосом этим методом с высоким разрешением остается делом далекого будущего.
В последнее время большие успехи были достигнуты в изучении гонкой структуры рибосом методом электронной микроскопии высокого разрешения, который позволяет выявить в ее структуре элементы с разрешением около 20А. Это дает возможность наблюдать в рибосомных
субчастицах отдельные спирали РЫК. Однако электронно-микроскопические данные не позволяют соотнести детали получаемых на их основе моделей с определенными элементами вторичной структуры рРНК, а также определить положение неструктурированных районов рРНК и участков их взаимодействия с мРНК.
В связи с этим для понимания пространственной организации рРНК в составе рибосомы и механизма ее функционирования необходимы данные о взаиморасположении отдельных структурных элементов рРНК, о контактах мРНК с рРНК и рибосомными белками. Одним из немногих подходов к решению данной задачи является метод химической модификации. Поэтому разработка химических подходов для изучения тонкой структуры сложных рибонуклеопротеидных объектов, таких как рибосома, является актуальной задачей.
1.2. Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка методов химической модификации, применимых для изучения структуры и функции сложных рибонуклеопротеидных объектов, состоящих из высокомолекулярных РНК и большого набора белков, и использование их для изучения структуры функционирующей рибосомы. При этом ставилась задача разработать комбинированный подход, который позволил бы получать информацию как о контактах гетероциклических оснований нуклеотидов РНК с компонентами рибосомы, так и о вовлеченности их сахарофосфатных остатков во внутририбосомные взаимодействия. Таким образом планировалось решить следующие задачи.
1. Разработать метод фотоаффинной химической модификации рибосом
аналогами РНК (мРНК, 5S рРНК), содержащими фотоаффинные
производные нуклеотидов, статистически распределенные по всей длине
молекулы. Разработать методы анализа, позволяющие выявить положение
сшивки в длинных молекулах рРНК с нуклеотидным разрешением.
2. Найти условия применения тиофосфатного метода изучения РНК-белковых
взаимодействий к исследованию контактов фосфатных групп молекул РНК в
сложных рибонуклеопротеидных комплексах.
3. Изучить строение декодирующего центра рибосомы и особенности
взаимодействия мРНК с компонентами рибосомы на разных этапах процесса
трансляции с использоваїшем комбинации тиофосфатного метода и метода
фотоаффинной химической модификации.
-
Используя комбинацию методов фотоаффинного химического сшивания и тиофосфатного, изучить внутрнрибосомные взаимодействия в функционирующей рибосоме на примере 5S рРНК-белкового комплекса.
-
Разработать метод введения модифицированных нуклеотидных остатков в определенные, заранее заданные положения длинных молекул рРНК в составе рибосомы с целью применения метода фотоаффинной химической модификации для изучения пространственной структуры длинных молекул рРНК и динамики ее изменения r процессе функционирования рибосомы.
1.3. Научная новизна и практическая значимость работы.
В данной работе получило развитие использование химических подходов для изучения структурно-функциональных отношений в исследовании сложных рибонуклеопротеидных систем, таких как рибосома Escherichia colt.
Разработан новый вариант метода фотоаффинного химического сшивания, применимый для исследования сложных рибонуклеопротеидных систем. В основу метода положено использование фотоаффинных аналогов нуклеотидов, включение которых во внутренние участки цепи РНК практически не искажает ее конформацию и мало влияет на биологическую активность исследуемой молекулы. Фотоаффинные аналоги нуклеотидов образуют химические сшивки с расположенными в непосредственной близости реакционно способными группами белков и нуклеиновых кислот под действием облучения УФ-светом с длштой волны 320-340 им, т.е. в условиях, когда биологическая активность рибосом полностью сохраняется Такой подход позволяет вводить фотометки в реальные биологические молекулы и изучать их контакты в функционирующих биологических системах. Данный метод был применен для изучения контактов мРНК и 5S рРНК в прокариотической рибосоме. Применение набора различных фогоаффишшх аналогов нуклеотидов необходимо для более полного выявления возможных взаимодействий исследуемой молекулы РІЖ с компонентами рибосомы. Рибосомные РНК играют важную роль не только в формировании структуры, но и в функционировании рибосомы, поэтому установление РНК-РНК контактов с нуклеотидным разрешением является чрезвычайно важным для понимания механизма работы рибосомы. В процессе выполнения данной работы был разработан метод анализа, позволяющий точно определить пуклеотидные остатки как длинтп.тх молекул рРНК, так и мРНК (5S рРНК), участвующие в образовании сшивки. В настоящее время этот подход активно используется для исследования
различных сложных молекул РНК и рибонуклеопротеидных комплексов (например, сплайсосом).
Применение метода фотоаффишюй химической модификации позволило выявить нуклеотидные остатки рРНК и рибосомные белки, формирующие декодирующий центр рибосомы, изучить перераспределение контактов мРНК с рибосомой на разных этапах трансляции.
Применение тиофосфатного метода обнаружения фосфатных остатков мРНК, вовлеченных в прочные взаимодействия с компонентами рибосомы, позволило сделать вывод, что только несколько фосфатных групп мРНК, расположенных перед кодовом в Р-участке рибосомь^могут быть вовлечены в сильные взаимодействия, тогда как в декодирующей области мРНК фосфатные остатки не защищаются компонентами рибосомы.
Данные, получегпгые нами с помощью метода фотоаффинной химической модификации вместе с данными электронной микроскопии высокого разрешения, легли в основу модели пространственной структуры 16S рРНК в составе малой субчастицы рибосом (R.Brimacombe et al, J. Мої. Biol., послано в печать) и позволили предложить модель взаиморасположения мРНК и компонентов 16S рРНК в декодирующем центре рибосомы.
Изучение топографии и пространственной организации 5S рРНК в рибосоме описанными выше методами позволило выявить прямые контакты этой рРНК с нуклеотидами 23 S рРНК, расположенными в непосредственной близости от двух важнейших функциональных центров рибосомы, определить фосфатные остатки вовлеченные в образование комплексов со специфическими рибосомными белками как в изолированном комплексе, так и в составе рибосомы, фосфатные остатки вовлеченные в возможные взаимодействия с малой субчастицей рибосом, фосфатные группы, расположенные в изломах пространственной структуры молекулы 5S рРНК. Важность для функционирования рибосомы нуклеотида U89 в 5S рРНК, участвующего в образовании сшивки с функциональными доменами большой субчастицы, была подтверждена методом сайт-напрвленного мутагенеза. Все эти данные позволили нам предложить модель пространственной структуры молекулы 5S рРНК и ее расположения в большой субчастице рибосом, а также высказать предположения о возможной функциональной роли молекулы 5S рРНК в процессе трансляции.
Личный вклад автора. В цикле исследований, составляющих диссертационную работу, автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключался в непосредственном участии во всех этапах
исследования - от постановки задачи, проведения экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.
1.4. Апробация работы.
Материалы работы доложены и обсуждены на Международной конференции "Protein biosynthesis" (Пущино, Россия, 1991), Международной конференции "Modem enzymology: problems and trends" (Санкт-Петербург, Россия, 1992), Международном симпозиуме "Translational apparatus" (Берлин, Германия, 1992), 10-ом Советско-немецком симпозиуме (Суздаль, Россия, 1993), Международной конференции "Biocatalysis: fundamentals and applications" (Москва, Россия, 1993), Международной конференции "Translational control" (Колд Спринт Харбор, США, 1994), 16-ом международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Дели, Индия, 1994), 3-ем Международном симпозиуме по биоорганической химии (Дагомыс, Россия, 1995), Международном симпозиуме "Frontiers in translation" (Виктория, Канада, 1995), Российско-французском симпозиуме по регуляции экспрессии генов (Новосибирск, Россия, 1995), Международной конференции "Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии" (МГУ, Москва, 1995), Первой ежегодной конференции РНК-общества "PNA'96" (Медисои, США, 1996), а также на семинарах в МГУ и Макс-Планк-Институтс Молекулярной генетики (Берлин, Германия).
Главные результаты работы и сделанные на их основе выводы изложены в обобщенном виде в настоящем докладе. Работа выполнена в 1987-1996 гг.
Тезисы защи гы.
- создание экспериментальных подходов к изучению структуры и функции
сложных рибоїгуклеопротеїідньїх систем на основе химической модификации
РІЖ;
- изучение топографии мРНК на рибосоме методами фоюаффинного
химического сшивания и тиофосфатным на разных этапах трансляции.
Построение молекулярной модели структуры мРНК-связывающего центра
рибосомы:
- изучение структуры и топографии 5S рРНК п рибосоме, создание модели
структурной организации 5S рРПК в рибосоме;
- разработка подходов для введения модификаций в заранее заданные
участки длинных молекул рибосомных РНК;
- совокупность идей, теоретических подходов, экспериментальных методов и
результатов, которую можно сформулировать как новое научное направление
"Химические подходы к изучению структуры и функции сложных рибонуклеопротеидных систем".
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 55 страницах и включает общую характеристику работы, экспериментальную часть, описание основных результатов и выводы. Работа содержит 23 рисунка.
