Введение к работе
Актуальность работы.
Тромбин это фермент класса гидролаз, важнейший компонент системы свертывания крови человека и животных; в крови присутствует в виде неактивного предшественника протромбина и активируется протромбиназой (активным тромбопластином). Основная функция тромбина - превращение фибриногена в фибрин.
Тромбин - гликопротеид с молекулярной массой около 40000; содержит около 5% углеводов. Тромбин относится к классу сериновых пептидаз (трипсин и другие). Тромбин состоит из двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью: А-цепь и Б-цепь, которая формирует активный центр фермента и содержит углеводный компонент. Тромбин существует в нескольких активных формах, которые различаются конформацией Б-цепи.
В крови тромбин инактивируется антитромбинами плазмы: а2-макроглобулином, антитромбином III и гепарином. Специфический неплазменный ингибитор тромбина -полипептид гирудин, который содержится в слюнных железах медицинской пиявки. В последние годы был получен новый тип ингибиторов тромбина - ДНК-аптамеры. Аптамерами называют олигомеры нуклеиновых кислот, которые специфически связываются с заданной мишенью - будь то низкомолекулярные соединения или целые клетки.
Аптамерная ДНК dGGTTGGTGTGGTTGG (15TGT), ингибирующая тромбин, впервые была получена методом SELEX (Bock L.C 1992). В отличие от широко применяемых в настоящее время ингибиторов тромбина, таких как гепарин, 15TGT обладает низкой иммуногенностью и малым временем жизни в организме, что определяет возможность получения нового лекарственного препарата. 15TGT имеет структуру внутримолекулярного G-квадруплекса, образуемого двумя G-квартетами, находящимися в стэкинге и соединенными одной TGT-петлей и двумя ТТ-петлями. G-квартеты состоят из четырех гуанинов, взаимодействующих по хугстиновскому типу. Кроме внутримолекулярных (мономолекулярных) G-квадруплексов, из двух или четырех молекул ДНК могут образовываться димерные или тетрамерные межмолекулярные комплексы. Тип G-квадруплекса может быть определен с помощью характеристических спектров кругового дихроизма.
Пространственная структура тромбин-связывающего аптамера может стать основой для разработки улучшенных ингибиторов тромбина с G-квадруплексной структурой фармакофора. В стадии клинических испытаний находится один аптамерный ингибитор тромбина - NU172, разработанный "Archemix" в 2007 году. Данный ДНК-аптамер также имеет в своей первичной структуре G-квадруплексный паттерн, однако структура его неизвестна. Более того, как было впервые показано в данной работе, наличие квадруплексного паттерна у NU172 не определяет автоматически образование квадруплексной структуры в растворе. Понимание причин, определяющих структуру и свойства аптамеров к тромбину, необходимо для эффективной разработки антикоагулянтных препаратов.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы является изучение структуры ДНК-аптамерных ингибиторов тромбина человека, имеющих в своей первичной структуре G-квадруплексный паттерн GGNxGGNyGGNzGG, где N - любой нуклеотид, а х, у, z - количество нуклеотидов в петлях G-квадруплекса. Кроме изучения предполагаемого фармакофора - минимального ДНК-аптамера, соответствующего паттерну, необходимо было исследовать влияние дополнительных к фармакофорной группе элементов структуры на стабильность G-квадруплексных аптамеров и кинетику связывания аптамеров с тромбином человека.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать структуру ДНК-аптамеров, имеющих в первичной структуре два паттерна: G-квадруплексный и дуплексный. Изучить условия существования в растворе структур, соответствующих этим паттернам.
-
В условиях, когда одновременно существуют G-квадруплексный и дуплексный элементы структуры в растворе, изучить их взаимное влияние на структуру аптамера и способность связываться с тромбином человека.
-
Количественно описать кинетику взаимодействия ДНК-аптамеров с тромбином человека с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса и визуализации поверхностного плазмонного резонанса.
-
Изучить влияние дополнительных к фармакофорной группе элементов вторичной структуры на взаимодействие с тромбином человека.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В работе исследована серия ДНК-аптамерных ингибиторов тромбина человека: 15TGT (15-мер), Nul72 (26-мер), 31TGT (31-мер) и их производные, которые обладают разным набором потенциальных структурных элементов. Впервые показано, что аптамер 31TGT, который имеет два патерна - дуплексный и G-квадруплексный, в растворе образует два элемента структуры: G-квадруплексный паттерн формирует антипараллельный мономолекулярный G-квадруплекс, а концевые участки с комплементарными последовательностями образуют дуплекс. В работе впервые показано, что оба структурных мотива — G-квадруплекс и дуплекс, в единой структуре 31TGT взаимно влияют друг на друга. А именно, в случае, когда не формируется дуплекс, G-квадруплекс также не образуется. На примере аптамера Nu 172, имеющего в первичной структуре два структурных мотива, аналогичных 31TGT, впервые показано, что наличие структурного паттерна не гарантирует образование самой структуры в растворе. В работе показано влияние на
структуру и свойства G-квадруплекса других типов изменения структуры: изменение состава петель, соединяющих G-квартеты, влияние дополнительных участков на 5'- и 3'- концах G-квадруплекса, как с нецелевыми некомплементарными последовательностями, так и с последовательностями, формирующими G-квадруплексную структуру.
Использование методов спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса позволило получить кинетические параметры взаимодействия G-квадруплексной структуры с тромбином, при этом предполагалось, что изменение структуры G-квадруплекса должно сказаться и на параметрах взаимодействия с тромбином. Показано, что ведение дополнительного дуплексного элемента структуры позволяет увеличить скорость ассоциации с тромбином, по-видимому, за счет существования предсобранных молекул аптамера в растворе.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-ей международной конференции «International Conference of nanoscience and nanotechnologies», (2010, Гавана, Куба), 5-ой международной конференции «International Conference on Drug Discovery & Therapy», (2013, Дубай, ОАЭ) и 8 международном конгрессе «Annual Congress of International Drug Discovery Science and Technology» (2011, Пекин, Китай). А также на ряде российских конференций: Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы», (2008, Белгород, РФ), XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» МГУ, (2011, Москва, РФ).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, 11 тезисных сообщений и подана заявка на патент.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Ведение», «Обзор литературы», «Результаты», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 113 страницах и включает в себя 89 рисунков, 19 таблиц и список литературы, содержащий 126 ссылок.
