Введение к работе
Актуальность проблемы. Одна из актуальных и наиболее сложных проблем молекулярной биологии во времена геномики и протеомики - поиск новых функций и определение механизмов функционирования белков в клетках. Успешное завершение секвенирования генома человека привело к тому, что прочитаны практически все гены, становится известной структура большинства их белковых продуктов. Но даже если о структуре белка известно все или почти все, часто бывает очень непросто понять, что этот белок делает в клетке, особенно если учесть тот факт, что большинство белков выполняют в клетке не одну, а несколько функций. Чтобы понять, как работает живая система в целом, необходимо разобраться в сложной взаимосвязи этих функций.
Протимозин альфа (ПроТа) - это мультикопийный ядерный белок млекопитающих, состоящий из 109-110 аминокислотных остатков, относящийся к интереснейшему классу природных неструктурированных белков (naturally unfolded proteins). Оказалось, что даже такой относительно простой белок является многофункциональным, способным участвовать в самых разнообразных процессах в жизни и смерти клеток. Структурно-функциональное исследование протимозина альфа актуально как в связи с необходимостью разработки методов изучения механизмов функционирования белков, так и вследствие того, что функции ПроТа сами по себе имеют существенное значение для протекания весьма важных клеточных процессов, таких как деление, опухолевая трансформация, апоптоз, защита от окислительного стресса.
Несмотря на то, что ПроТа является жизненно важным белком, механизм его действия до сих пор не ясен. Впервые ПроТа выделили как предшественника тимусного гормона тимозина al, иммуностимулирующего пептида, состоящего из 28 N-концевых аминокислотных остатков ПроТа. Выяснилось, что и сам ПроТа обладает иммуностимулирующими свойствами, его относили к гормонам, обеспечивающим нормальное функционирование иммунной системы млекопитающих. Позднее появились основания сомневаться в гормональной природе этого белка. ПроТа оказался ядерным белком и многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют об его участии в пролиферации клеток. Он ускоряет клеточное деление, клетки с повышенным содержанием ПроТа приобретают фенотип трансформированных клеток. Снижение уровня ПроТа приводит к остановке деления клеток. Таким образом, изучение механизмов функционирования ПроТа актуально для понимания закономерностей клеточного деления.
Активация экспрессии гена ПроТа обнаружена в клетках многих раковых опухолей, в частности рака толстой кишки, тонкой кишки, печени, легких и молочной железы. Было показано, что суперпродукция ПроТа не только влияет на пролиферацию, но и позволяет клеткам расти в среде с пониженным содержанием сыворотки от vitro, приводит к отсутствию
контактного торможения и росту не прикрепленных к подложке клеток. Следовательно, ПроТа обладает свойствами, аналогичными свойствам онкобелков, и исследование механизмов его функционирования актуально для создания новых антираковых препаратов.
Регуляция экспрессии генов является фундаментальной научной проблемой, от решения которой зависит возможность влиять на важнейшие биологические процессы на уровне клетки и всего организма. Показано, что за счет своего центрального домена, состоящего из протяженных блоков дикарбоновьгх аминокислот, ПроТа взаимодействует с гистонами, в частности с гистоном НІ, и способен индуцировать структурные перестройки хроматина. Кроме того, обнаружен еще рад взаимодействующих с ПроТа белков: репрессор рецептора эстрогенов REA, коактиватор транскрипции СВР и гистоновая ацетилтрансфераза рЗОО, транскрипционный фактор STAT3, ядерный антиген вируса Эппггейна-Барр EBNA3C, белок Rev вируса иммунодефицита человека типа 1, онкобелок SET. Перечисление взаимодействия свидетельствуют о вероятном участии ПроТа в регуляции экспрессии генов, например, посредством структурной перестройки хроматина, модуляции активности транскрипционных факторов, а также возможного участия в процессе адерно-цитоплазматического транспорта.
В процессе выполнения данной работы мы показали, что ПроТа гидролизуется каспазой-3 в апоптотических клетках и это приводит к инактивации его сигнала ядерной локализации. Кроме того, высокий уровень ПроТа защищает клетки человека от апоптоза. Программируемая клеточная смерть (апоптоз) является фундаментальным процессом, позволяющим многоклеточным организмам избавляться от избыточных и поврежденных (в том числе, раковых) клеток. Кроме того, мы обнаружили, что ПроТа за счет взаимодействия его центрального домена с ингибитором транскрипционного фактора Nrf2 принимает участие в ответе клеток на окислительный стресс, способствуя активации экспрессии защитных генов. Это свидетельствует о несомненной актуальности систематического структурно-функционального исследования ПроТа.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизмов функционирования ядерного многофункционального белка млекопитающих ПроТа, определение взаимосвязи между структурными элементами этого белка и его функциональными активностями.
Для достижения поставленной цели были поставлены и решались следующие задачи:
-
Оптимизация эктопической экспрессии ПроТа человека в бактериальных клетках и в культуре клеток человека. Создание бактериальных и дрожжевых штаммов-продуцентов ПроТа человека, его производных и мутантов.
-
Разработка эффективных методов выделения ПроТа человека из бактериальных, дрожжевых и человеческих клеток. Исследование рекомбинангного белка: пост-
трансляционной модификации, биологической активности, антигенных и металл-
связывающих свойств. .
-
Получение моноклональных антител к разным эпитопам ПроТа. Определение антигенной специфичности полученных антител. Разработка системы иммуноферментного анализа на основе этих антител.
-
Разработка системы селекции функционально значимых мутаций в ПроТа. Поиск функционально важных доменов этого белка. В связи с обнаружением предполагаемого двухчастного NLS, изучение ядерно-цитоплазматического транспорта ПроТа и его делеционных мутантов в клетках дрожжей и человека.
-
Разработка системы подавления экспрессии гена ПроТа в культуре клеток человека методом интерференции РНК.
-
Исследование фрагментации, внутриклеточной локализации и защитного действия ПроТа в апоптотических клетках.
-
Поиск молекулярных партнеров ПроТа с помошью дрожжевой двухгибридной системы. Исследование возможности и специфичности взаимодействия ПроТа с найденным белком Keapl. Анализ биологической значимости этого взаимодействия.
-
Создание и экспериментальная проверка модели участия ПроТа в ответе клетки на окислительный стресс.
Научная новизна и практическая ценность работы. Обнаружена способность ПроТа человека, продуцируемого в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae, ингибировать клеточное деление. На основе этого феномена разработана система селекции функционально значимых мутаций в ПроТа. С помощью таких мутаций идентифицирован двухчастный сигнал ядерной локализации (NLS) в ПроТа.
Показано, что протимозин альфа является природным субстратом каспаз. Он гидролизуется каспазой-3 в апоптотических клетках человека в трех местах. Расщепление по мажорному сайту приводит к инактивации сигнала ядерной локализации ПроТа и изменению его субклеточной локализации: из ядерного белок становится ядерно-цитоплазматическим. Более того, протимозин альфа (или его фрагменты) экспонируются на поверхности апоптотических (но не нормальных) клеток. Суперпродукция протимозина альфа и ряда его мутантов с ядерной или ядерно-цитоплазматической локализацией в клетках HeLa ингибирует активацию каспаз и защищает клетки от апоптоза.
Найден белок, взаимодействующий с протимозином альфа. Им оказался Keapl, репрессор транскрипционного фактора Nrf2, ответственного за индукцию генов клеточного ответа на окислительный стресс. Установлено, что Keapl не заякорен в цитоплазме за счет взаимодействия с актиновыми элементами цитоскелета, как считалось ранее, а является белком-
челноком, постоянно мигрирующим между ядром и цитоплазмой. Предложена и подтверждена экспериментально модель участия ПроТа в регуляции ответа клетки на окислительный стресс, согласно которой ПроТа играет роль внутриядерного фактора диссоциации комплекса Nrf2-Keapl.
Показано, что суперэкспрессия протимозина альфа дикого типа (но не мутанта с нарушенной способностью взаимодействовать с Keapl) приводит к усилению экспрессии генов ответа на окислительный стресс, а снижение концентрации протимозина в клетке с помощью интерференции РНК - к ее подавлению.
Созданы бактериальные и дрожжевые штаммы-продуценты протимозина альфа человека и ряда его мутантов. Разработан эффективный метод выделения этого белка из бактериальных и дрожжевых клеток. Получены препараты высокоочшценного ПроТа, обладающие иммуностимулирующей активностью. Получены высокоспецифичные моноклональные антитела к двум разным эпитопам ПроТа, пригодные для иммуноблоттинга, иммунопреципитации, иммуноферментного и гистохимического анализа. Данные антитела переданы для дальнейших испытаний в МНИОИ им. П.А. Герцена, Институт рака университета Теннесси (США), Медицинский факультет университета Вандербилт (США), Национальный институт здоровья (США).
Апробация работы. Результаты работы были представлены на двустороннем российско-французском симпозиуме по физико-химическим основам жизни (Конкарно, Франция, 1992), российско-американском симпозиуме «Геном человека» (С.-Петербург, 1992), втором съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), на приглашенной лекции в Институте Молекулярной Генетики им. Макса Планка (Берлин, Германия, 1999), на 48-ой конференции Американского общества масс-спектрометрии (Лонг Бич, США, 2000), на научных семинарах Юго-западного университета штата Техас (Даллас, США, 2003), на Ш съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), на Научной конференции «Ломоносовские чтения» (Москва 2004), на Ученом совете НИИФХБ им. АЛІ.Белозерского МГУ (Москва, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 научных статей. Список публикаций приведен в конце автореферата. Работа выполнена в 1990-2005 годах.
Объем н структур» работы. Диссертационная работа изложена на 263 страницах машинописного текста, содержит 52 рисунка и 9 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы на тему: «Протимозин альфа. Методы, используемые для изучения механизмов его функционирования», обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (311 ссылок).
