Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди структурно разнообразных ингибиторов сериновых протеиназ, описанных на сегодняшний день, наиболее интенсивно исследуются представители семейства Кунитца, обнаруженные во всех живых организмах и обладающие широким спектром биологической активности. Для них характерно наличие шести консервативно расположенных остатков цистеина, которые стабилизируют пространственную структуру, названную Кунитц-фолдом. Установлено, что полипептиды Кунитц-типа имеют два функциональных участка (реактивный сайт и сайт слабых взаимодействий), непосредственно взаимодействующих с активным центром сериновых протеиназ и определяющих их ингибиторную специфичность.
Интерес к изучению структурно-функциональных особенностей полипептидов Кунитц-типа связан с обнаружением у некоторых из них способности модулировать функциональную активность различных типов ионных каналов (Nav-, Cav-, Kv- и TRPV1-каналы). В этой связи их принято называть токсинами Кунитц-типа. Морские кишечнополостные, актинии, продуцируют яд, содержащий полипептиды Кунитц- типа в виде ряда изоформ, которые функционально представлены как ингибиторами сериновых протеиназ, так и токсинами ионных каналов. Следует отметить, что яд исследуемой нами тропической актинии Heteractis crispa (=Radianthus macrodactylus) является источником новых представителей полипептидов Кунитц-типа, обладающих также антигистаминной и модулирующей TRPV1-каналы активностями.
Соединения белковой природы, выделяемые из яда актиний различных видов, интенсивно исследуются на протяжении последних десятилетий, но, несмотря на значительное количество публикаций, практически ничего не известно о природе разнообразия продуцируемых изоформ полипептидов Кунитц-типа, а также структуре кодирующих их генов. В связи с этим изучение полиморфизма полипептидов Кунитц-типа актиний представляет научный и практический интерес, поскольку обеспечивает понимание взаимосвязи между их структурными особенностями и полифункциональностью. Необходимо отметить, что способность взаимодействовать с различными мишенями указывает на возможный терапевтический потенциал полипептидов Кунитц-типа при лечении заболеваний, вызванных нарушением естественной регуляции активности протеиназ или дисфункцией ионных каналов. Полипептиды Кунитц-типа также могут рассматриваться в качестве потенциальных инструментов исследования молекулярных механизмов функционирования ионных каналов.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, посвященных изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Целью настоящего исследования являлось получение, структурно-функциональный анализ и изучение природы разнообразия полипептидов Кунитц-типа актинии H. crispa. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Выделить и охарактеризовать новые полипептиды, проявляющие трипсинингибирующую активность, установить полноразмерные последовательности кодирующих их кДНК.
-
Установить первичные структуры зрелых HCGS-, HCRG- и HCTX- полипептидов, провести их структурно-функциональный и филогенетический анализ.
-
Установить структурную организацию генов полипептидов Кунитц-типа.
-
Создать экспрессионные конструкции некоторых полипептидов и провести их гетерологичную экспрессию в Escherichia coli. Получить функционально активный рекомбинантный полипептид.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
-
Бифункциональный полипептид HCPG из H. crispa обладает помимо трипсинингибирующей активности анальгетическим действием на тепловой модели in vivo.
-
Полипептиды HCPR1 и HCPR2 проявляют более высокую трипсинингибирующую активность по сравнению с активностью ранее выделенных из H. crispa изоформ ингибиторов сериновых протеиназ.
-
Полипептиды Кунитц-типа, присутствующие в ядовитом секрете щупалец актинии H. crispa, образуют комбинаторную библиотеку близких по структуре, но отличающихся по физико-химическим характеристикам соединений.
-
HCGS-, HCRG- и HCTX-полипептиды Кунитц-типа кодируются разными мультигенными семействами. Гены этих полипептидов содержат интрон, который разделяет области последовательности с высокой и низкой консервативностью.
-
Рекомбинантный полипептид идентичен по функциональной активности нативному ингибитору протеиназ InhVJ.
Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе данной работы выделены и охарактеризованы новые представители полипептидов Кунитц-типа из актинии H. crispa, один из которых является бифункциональным полипептидом. Впервые установлены нуклеотидные последовательности и на их основе выведены аминокислотные последовательности HCGS-, HCRG- и HCTX-полипептидов, которые образуют комбинаторную библиотеку близких по структуре, но отличающихся по физико-химическим характеристикам полипептидов. Показано, что представители комбинаторной библиотеки кодируются генами разных мультигенных HCGS-/HCRG- и HCTX семейств. Впервые установлено, что гены полипептидов Кунитц-типа актиний имеют экзон-интронную организацию и характеризуются наличием одного интрона в области, соответствующей C-концевому участку сигнального пептида. Выделен и охарактеризован функционально-активный рекомбинантный полипептид, идентичный по физико-химическим характеристикам нативному ингибитору протеиназ InhVJ.
Результаты, полученные в ходе выполнения данной работы, имеют как теоретическое, так и практическое значение. Установленные первичные структуры значительно расширяют существующую базу последовательностей полипептидов Кунитц-типа и создают молекулярную основу для получения новых фармакологических агентов направленного действия, а также инструментов исследования структуры и функциональной активности ионных каналов.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на: III Международной конференции «Химия, структура и функция биомолекул», г. Минск, 2008; XII и XIII Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные проблемы химии и биологии», г. Владивосток, 2009, 2010; Международном семинаре по морским природным ресурсам, г. Ханой, 2010; V Российском симпозиуме «Белки и пептиды», г. Петрозаводск, 2011; 9-ом Международном конгрессе по токсинологии «Токсины животного, растительного и микробного происхождения», г. Владивосток, 2011.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей, из них 3 в журналах, определенных списком ВАК, 2 в сборниках научных трудов по материалам конференций, 8 тезисов докладов и получен один патент Российской Федерации.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, материалов и методов исследования, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 185 публикаций. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и содержит 14 таблиц и 63 рисунка.
Благодарности. Автор выражает благодарность научным руководителям д.х.н. Монастырной М.М. и к.м.н. Исаевой М.П. за помощь, поддержку и ценные советы при выполнении и оформлении данной работы. Автор глубоко признателен за оказанную помощь в выполнении отдельных этапов работы к.х.н. Гладких И.Н. и к.ф- м.н. Зелепуга Е.А., а также м.н.с. Гузеву К.В., к.х.н. Лейченко Е.В., м.н.с. Ли И.А., к.х.н. Анастюку С.Д., к.х.н. Дмитренку П.С., к.б.н. Черникову О.В., аспиранту Табакмахеру В.М. и студентке Фокиной И. Автор выражает свою искреннюю благодарность заведующему лабораторией д.х.н. Козловской Э.П. за ценные замечания и рекомендации при выполнении данной работы.
Используемые сокращения: а.о. - аминокислотный остаток, АП - аминокислотная последовательность, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, МЭП - молекулярный электростатический потенциал, НП - нуклеотидная последовательность, п.н. - пар нуклеотидов, ПЦР - полимеразная цепная реакция, ТФУ - трифторуксусная кислота, BPTI - бычий панкреатический ингибитор трипсина, DTX - дендротоксин, классический лиганд Ку-каналов, Kv - потенциалзависимый калиевый канал, TRX - тиоредоксин, белок бактериального происхождения.
Похожие диссертации на Полипептиды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa: структура, функция и причины многообразия изоформ
-
