Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор
2.1. Яды животных как источник биологически активных соединений 10
2.2. Компонентный состав ядов животных: молекулярное разнообразие и механизмы формирования 11
2.3. Структурное и функциональное разнообразие биологически активных полипептидов ядов животных. Комбинаторные библиотеки
2.3.1. Полипептиды со структурным мотивом цистеинового узла 13
2.3.2. Трехпетлевые токсины змей 14
2.3.3. Полипептиды с цистеин-стабилизированным а/р-мотивом 15
2.3.4. Перспективы использования полипептидов ядов животных 16
2.4. Полипептиды Кунитц-типа 16
2.4.1. Структура 17
2.4.2. Взаимодействие с сериновыми протеиназами 18
2.4.3. Структурные особенности и функциональное разнообразие
2.4.3.1. Доменные и мультидоменные ингибиторы Кунитц-типа 21
2.4.3.2. Полипептиды Кунитц-типа яда змей 22
2.4.3.3. Полипептиды Кунитц-типа яда пауков 25
2.4.3.4. Полипептиды Кунитц-типа яда скорпионов 27
2.4.3.5. Полипептиды Кунитц-типа яда конусов 28
2.4.3.6. Полипептиды Кунитц-типа земноводных 29
2.4.3.7. Полипептиды Кунитц-типа яда перепончатокрылых 30
2.4.3.8 . Полипептиды Кунитц-типа яда актиний 31
2.5. Молекулярные мишени полипептидов Кунитц-типа актиний 34
2.5.1. Сериновые протеиназы 34
2.5.1.1. Классификация 34
2.5.1.2. Механизм катализа гидролитического расщепления пептидной связи 35
2.5.1.3. Функциональное разнообразие 37
2.5.2. Ионные каналы - молекулярные мишени полипептидов Кунитц-типа 38
2.5.2.1. Общая характеристика ионных каналов 39
2.5.2.2. Потенциалзависимые ионные каналы. Kv каналы 40
2.5.2.3. Рецептор TRPV1 43
2.5.2.4. Структура и функциональные детерминанты TRPV1 44
2.5.2.5. Терапевтический потенциал агонистов и антагонистов TRPV1 47
3. Обсуждение результатов 48
3.1. Выделение ингибиторов Кунитц-типа из актинии Н. crispa 48
3.2. In silico исследование структурно-функциональных взаимосвязей полипептидов комбинаторной библиотеки//, crispa
3.2.1. Сравнительная характеристика структурных и функциональных особенностей 52
3.2.2. Компьютерное моделирование пространственных структур полипептидов Кунитц-типа актиний 55
3.2.3. Расчетные физико-химические характеристики HCGS-полипептидов 56
3.2.4. Анализ молекулярного электростатического потенциала 57
3.2.5. Установление структурно-функциональных взаимосвязей
3.2.5.1. Структурные модели комплексов с а-химотрипсином 61
3.2.5.2. Структурные модели комплексов с трипсином 64
3.2.5.3. Структурные модели комплексов сэластазой нейтрофилов человека 70
3.2.5.4. Структурные модели комплексов с рецептором TRPV1 77
3.3. Получение рекомбинантных полипептидов семейства Кунитца//. crispa. Исследование физико-химических характеристик и биологической активности 88
3.3.1. Получение рекомбинантных полипептидов с использованием генетических конструкций на основе кДНК 88
3.3.2. Получение рекомбинантных полипептидов с использованием генетических конструкций на основе синтетических генов 92
3.3.3. Определение констант ингибирования трипсина рекомбинантными полипептидами 95
3.3.4. Исследование кинетики взаимодействия рекомбинантных полипептидов с сериновыми протеиназами методом поверхностного плазмонного резонанса 97
3.3.5. Исследование анальгетической активности рекомбинантных полипептидов 98
4. Экспериментальная часть 102
4.1. Материалы и реактивы 102
4.2. Биологический материал, бактериальные штаммы и животные 103
4.3. Приборы и оборудование 104
4.4. Методы исследования
4.4.1. Выделение природных ингибиторов Кунитц-типа 104
4.4.2. Методы компьютерного моделирования и биоинформационного анализа 106
4.4.3. Методы получения рекомбинантных полипептидов и определения их физико-химических характеристик и биологической активности 107
4.4.4. Методы тестирования анальгетическои активности 115
5. Заключение 116
6. Выводы 117
7. Список литературы 119
- Структурное и функциональное разнообразие биологически активных полипептидов ядов животных. Комбинаторные библиотеки
- . Полипептиды Кунитц-типа яда актиний
- Установление структурно-функциональных взаимосвязей
- Методы компьютерного моделирования и биоинформационного анализа
Структурное и функциональное разнообразие биологически активных полипептидов ядов животных. Комбинаторные библиотеки
Среди огромного многообразия продуцентов биологически активных полипептидов особое место принадлежит ядовитым организмам. Известны тысячи ядовитых животных самого разнообразного систематического положения, включая кишечнополостных (актинии, медузы, кораллы), иглокожих (морские ежи), моллюсков (брюхоногие и головоногие), членистоногих (пауки, скорпионы, многоножки, насекомые), рыб, амфибий, рептилий (змеи, ящерицы) и даже млекопитающих (утконос, землеройковые, толстый лори) [1]. Согласно современным представлениям, их яды являются биологическими секретами специализированных органов [2]. Они содержат соединения, которые нарушают нормальные физиологические и биохимические процессы в организме жертвы и выполняют алломональную и/или пищеварительную функцию для животного-продуцента. Чаще всего яд используется животными для охоты или защиты от естественных врагов. Однако иногда ядовитый секрет играет роль инструмента сохранения и укрепления системы внутривидовых иерархических взаимоотношений [2].
Поскольку в процессе эволюционного развития филогенетически отдаленных видов их яд меняется независимо и служит для выполнения разных задач, компонентный состав яда, система его доставки и физиологические мишени чрезвычайно разнообразны у различных организмов [2]. Известно, что компоненты ядов животных оказывают различное физиологическое действие на организм жертвы: гемотоксическое (затрагивающее сердечнососудистую систему), нейротоксическое (воздействующее на нервную систему и мозг) и цитотоксическое (разрушающее клетки локально), а также вызывают патологические состояния, связанные с дыхательной, мышечной, мочевыделительной и желудочно-кишечной системами [3-5].
В результате интоксикации биологическими ядами у жертвы могут наблюдаться самые разнообразные симптомы, как локальные (местная боль, отек, волдыри, сыпь, некроз тканей), так и системные (головная боль, нарушение зрения, лихорадка, тошнота, рвота, диарея, увеличение лимфатических узлов, головокружение, мышечная слабость, потеря координации или паралич). Зачастую отравления сопровождаются дисфункцией кровеносной системы: нарушениями гемостаза, тромбозом и коагуляцией крови, внезапными кровотечениями, и нередко воздействие ядов приводит к коллапсу и смерти жертвы [ 1 ].
Все эти симптомы имеют различную биохимическую основу. Молекулярными мишенями компонентов ядов являются мембранные рецепторы и ионные каналы, а также цитоплазматические мембраны. Нарушение их функции нейротоксинами ядов может приводить к выбросу нейромедиаторов и запуску каскадов физиологических реакций, приводящих к сердечной и дыхательной блокаде, потере чувствительности, параличу и т.д. Ферменты, такие как фосфолипазы А2 и протеиназы, а также мембраноактивные пептиды/полипептиды, входящие в состав ядовитого секрета, могут вызывать формирование пор, лизис цитоплазматической мембраны, нарушение функционирования различных клеточных компонентов, высвобождение молекул, участвующих в иммунном ответе (цитокинов), что приводит к развитию отеков и воспалительного процесса. Ингибиторы протеиназ могут препятствовать разрушению других полипептидных компонентов яда за счет блокирования протеолитических систем жертвы [6]. Так или иначе, действие ядов животных направлено на дестабилизацию нормальных биохимических и физиологических процессов.
Яды животных являются богатым источником уникальных биологически активных соединений с разнообразной структурой, функциональной активностью и специфичностью действия на молекулярные мишени в организме жертвы. Накопленные к настоящему времени структурные, генетические и филогенетические данные свидетельствуют о том, что в ходе эволюции природа «редактирует» [7] компонентный состав ядов животных таким образом, чтобы среди всего возможного разнообразия молекул в ядовитом секрете присутствовали наиболее эффективные с точки зрения биологической активности.
На данный момент известно два пути «формирования» состава яда. При реализации одного из них в состав яда «отбирается» лишь ограниченное число молекул, обладающих, как правило, широким спектром действия [7]. Так, например, основными компонентами яда медоносной пчелы являются фосфолипаза Аг и пептид мелиттин, обеспечивающие его высокую неспецифическую цитолитическую активность [8, 9], которая необходима для выполнения защитной функции.
Реализация другого пути привела к тому, что в ядах образовались чрезвычайно сложные многокомпонентные смеси, состоящие из солей, низкомолекулярных соединений (полиамины, аминокислоты, нуклеотиды, углеводы), а также белков различных структурных групп (от коротких пептидов до многодоменных глобулярных ферментов) и др. [10]. При этом соединения лишь одной или нескольких структурных групп количественно превалируют в таких ядах. Основными компонентами ядовитого секрета являются чаще всего соединения белковой природы [7].
В ходе эволюции для развития токсической функции в роли «шаблона» (при формировании компонентного состава яда) выступают различные молекулярные фолды [1]. Так, например, в змеином яде встречаются в основном полипептиды с тремя фолдами (фосфолипазы Аг, трехпетлевых токсинов и Кунитца), в то время как в яде скорпионов присутствуют преимущественно полипептиды одного фолда (CSa/p) [11]. То же самое наблюдается и у других ядовитых животных, таких как моллюски-конусы, пауки, актинии. Тем не менее, все компоненты ядов белковой природы имеют на молекулярном уровне несколько общих особенностей [1]. Практически все они являются секретируемыми полипептидами, содержащими, как правило, N-концевой сигнальный пептид. Для таких полипептидов характерно высокое содержание остатков цистеина, образующих дисульфидные связи, которые обеспечивают жесткость пространственной структуры и устойчивость к протеолитической деградации [2]. Стабильность полипептидных компонентов ядов в сочетании с их биологической активностью, селективностью и специфичностью действия позволяет рассматривать (и использовать) эти соединения в качестве уникальных инструментов в исследовании структуры и функции их молекулярных мишеней и моделей для разработки терапевтических препаратов [12].
На основании доступных данных о пространственной структуре и функциональной активности токсинов животных можно предположить наличие двух различных эволюционных механизмов, объясняющих их функциональное разнообразие [13]. Один из них - механизм дивергентной эволюции, широко распространенный среди ядовитых животных. Предполагается, что в рамках такого эволюционного механизма для развития нескольких различных функций используется древний консервативный мотив пространственной структуры (например, CSa/p-токсины скорпионов специфичны к разным ионным каналам) [14]. Другой механизм - направленная конвергентная эволюция токсинов у животных, принадлежащих к различным таксономическим группам, в результате которой полипептиды с разными молекулярными фолдами приобретают одинаковую функцию (как, например, нейротоксины актиний, скорпионов и змей, специфичные модуляторы К -каналов) [15-17].
Принято считать, что соединения белковой природы, обнаруженные в ядах животных, являются результатом эволюционного отбора [2], в процессе которого гены «обычных» белков, участвующих, как правило, в ключевых регуляторных процессах, дуплицируются, и полученные при этом новые гены начинают селективно экспрессироваться в ядовитом аппарате животного. Во многих случаях происходит многократная дупликация (амплификация) генов, приводящая в сочетании с мутационным процессом к формированию мультигенных семейств и обширной функциональной дивергенции токсинов [18, 19]. Обычно кодируемые такими мультигенными семействами пептиды/полипептиды сохраняют молекулярную укладку (третичную структуру) полипептида, кодируемого анцестральным геном, однако функционально важные а.о. вне кора белковой глобулы заменяются и/или модифицируются для приобретения новых видов активности [19-21]. Некоторые авторы отмечают, что данные процессы могут приводить как к нео-, поли- и субфункциализации, так и деградации генов до нефункциональных копий (например, в результате делеций или мутаций нередко происходит потеря всякой функциональной активности зрелых полипептидов) или даже псевдогенов [20].
Экспрессия «токсических» мультигенных семейств часто приводит к тому, что в яд попадают не одна-две гомологичные молекулы, а десятки и даже сотни токсинов со сходной структурой. Совокупность таких соединений в яде животного принято называть природной комбинаторной библиотекой биологически активных полипептидов [7].
. Полипептиды Кунитц-типа яда актиний
Известно, что сериновые протеиназы участвуют в регуляции важнейших физиологических процессов, протекающих в организме, с чем связано интенсивное изучение их структуры, механизма катализа, а также способов регуляции их активности [145-147].
Наиболее подробно изученные представители этой группы белков, трипсин (ЕС 3.4.21.4), химотрипсин (ЕС 3.4.21.1) и эластаза (ЕС 3.4.21.36), являются основными компонентами секрета поджелудочной железы, участвующими в протеолизе при пищеварении. Показано, что дисбаланс этих ферментов может являться причиной ряда заболеваний желудочно-кишечного тракта [148-150].
Ряд других сериновых протеиназ, таких как плазмин (ЕС 3.4.21.7), тромбин (ЕС 3.4.21.5), урокиназа (ЕС 3.4.21.73), тканевый активатор плазминогена (ЕС 3.4.21.68), калликреин (ЕС 3.4.21.35) и факторы коагуляции Vila - ХПа (ЕС 3.4.21.21, 22, 6, 27, 38 соответственно), являются основными компонентами системы коагуляции крови и регуляции гемостаза [146, 151]. Известно, что сбои в секреции данных ферментов могут приводить к нарушениям свертываемости крови и спонтанным кровотечениям. Кроме того, тромбин участвует в регуляции ангиогенеза, процессах регенерации тканей, а также атеро- и канцерогенеза. Гиперсекреция тромбина часто является причиной сердечнососудистых заболеваний [152], например, острого коронарного синдрома или острого инфаркта миокарда [153].
Факторы системы комплемента Bb, D (ЕС 3.4.21.46), I (ЕС 3.4.21.45), компоненты Or (ЕС 3.4.21.41), Cls (ЕС 3.4.21.42) и СЗ/С5 конвертазы (ЕС 3.4.21.43, 47) также являются сериновыми протеиназами [147]. Система комплемента - одна из каскадных протеолитических систем, обнаруженных в плазме крови позвоночных, обеспечивает гуморальную защиту организма от действия чужеродных агентов и является важным компонентом как врожденного, так и приобретенного иммунитета. Ферменты системы комплемента характеризуются чрезвычайно узкой субстратной специфичностью. Они участвуют в каскаде протеолитических реакций последовательной активации друг друга, приводящей к образованию сложного мембраноатакующего комплекса, разрушающего клетку-патоген [154]. Нарушение регуляции активности компонентов системы комплемента может являться причиной ряда серьезных заболеваний [155]. Показано, что эта система принимает участие в патогенезе таких болезней, как рассеянный склероз, системная красная волчанка, синдром Барракера-Симонса, гломерулонефрит, различные формы артрита, аутоиммунные заболевания сердца, воспалительные заболевания кишечника и др. [156].
Сериновые протеиназы нейтрофилов (СПН) человека, эластаза (ЕС 3.4.21.37), катепсин G (ЕС 3.4.21.20) и протеиназа 3 (ЕС 3.4.21.76), играют одну из ключевых ролей, как в патогенезе многих болезней, так и подавлении неспецифического воспалительного процесса [157]. Они являются основными компонентами азурофильных гранул нейтрофилов, участвующих в неоксидативном пути разрушения патогенов [157]. При острых и хронических воспалениях в результате дегрануляции нейтрофилов СПН попадают в межклеточное пространство и участвуют в протеолитической деградации внеклеточного матрикса, а также уничтожении бактерий. Они также выполняют функцию регуляторов иммунного ответа, контролирующих сигнальную трансдукцию и активацию специфических клеточных рецепторов. Показано, что длительное нарушение регуляции активности СПН приводит к возникновению хронического воспаления и может вызывать разрушение тканей [155, 158].
Участие сериновых протеиназ в самых разнообразных физиологических и патологических процессах указывает на необходимость детального изучения возможных способов контроля их активности. На основе имеющихся в настоящее время данных можно условно выделить четыре основных пути регуляции их активности, реализуемых в живых системах: (1) регуляция на уровне экспрессии генов протеиназ; (2) образование протеолитических ферментов в форме неактивных предшественников - зимогенов; (3) локализация ферментов внутри специальных образований, окруженных мембраной (лизосомы - у животных, вакуоли и белковые тела - у растений); (4) использование имеющихся в клетках уникальных соединений, специфически ингибирующих протеиназы.
Еще одной мишенью полипептидов семейства Кунитца являются ионные каналы -сложные макромолекулярные структуры, участвующие в транспорте ионов через клеточную мембрану. Направленная регуляция работы ионных каналов и клеточных рецепторов, выяснение их молекулярной организации и связи между пространственной структурой и функцией является центральной проблемой современной нейробиологии [159]. В настоящее время в качестве инструментов для ее решения используют многие компоненты ядовитых секретов различных организмов [7]. Так, например, тетродотоксин из рыбы фугу помог охарактеризовать функциональную активность натриевых каналов [160], а для исследования различных типов кальциевых каналов были использованы высокоспецифичные блокаторы из ядов пауков и моллюсков конусов [161]. В связи с этим поиск и изучение новых молекул, специфично и селективно взаимодействующих с ионными каналами, является одной из первоочередных задач наук, исследующих молекулярную организацию и механизмы функционирования живых систем. Именно поэтому полипептиды структурного семейства Кунитца, обнаруженные в ядах актиний различных видов, которые специфично модулируют (блокируют/активируют) ионные каналы, вызывают все нарастающий интерес исследователей [80, 122, 129-131].
Ионные каналы - сложные трансмембранные белковые структуры, осуществляющие пассивный транспорт ионов через мембрану и участвующие в регуляции мембранного потенциала [162]. Их основной структурной особенностью является наличие ионпроводящей поры. Однако в отличие от водорастворимых пороформирующих белков про- и эукариот (например, пороформирующих токсинов) они способны претерпевать определенные конформационные изменения, обусловливающие ионную проницаемость поры. Различают три основных функциональных состояния ионных каналов: закрытое (неактивированное), открытое (активированное) и десенситизированное (инактивированное) (рис. 19).
Показано, что в закрытом состоянии пора канала не способна пропускать ионы. Однако при активации внешними стимулами канал может переходить в активированное состояние (потенциироваться) и осуществлять ионный транспорт через плазматическую мембрану. В инактивированное состояние канал может переходить только после стадии активации. Десенситизированный канал не способен пропускать поток ионов и активироваться в ответ на внешние стимулы. В качестве «дополнительного» можно выделить блокированное состояние канала, возникающее при физической закупорке открытого канала, например, молекулой токсина - порового блокатора. В функционально активном состоянии ионные каналы, как правило, закрыты, открываются лишь под влиянием определенных внешних факторов (за исключением так называемых неуправляемых ионных каналов) [162].
В зависимости от природы этих факторов различают потенциалзависимые (реагирующие на изменения мембранного потенциала), механочувствительные (активирующиеся в ответ на деформацию плазматической мембраны) и лиганд активируемые ионные каналы (управляемые специфическими внеклеточными агентами, например, нейромедиаторами или внутриклеточными химическими стимулами, такими как вторичные метаболиты) [163]. Некоторые каналы могут активироваться стимулами различной природы (например, канал TRPM8 активируется ментолом, а также в результате понижения температуры и изменения мембранного потенциала [164]).
Независимо от природы активирующих стимулов большинство ионных каналов высокоселективно и пропускает ионы только определенного вида: Н , Na , К , Са или СГ [162]. Их, соответственно, называют протонными, натриевыми, калиевыми, кальциевыми или хлорными каналами. Тем не менее, известны слабоселективные каналы, такие, например, как представители суперсемейства TRP, способные пропускать различные катионы [164].
В настоящее время имеется огромный массив экспериментальных данных, проливающих свет на структурную организацию ионных каналов и молекулярные механизмы их функционирования. В данном разделе литературного обзора будут описаны структурные и функциональные особенности лишь некоторых, наиболее подробно исследованых представителей данной группы биомолекул.
Установление структурно-функциональных взаимосвязей
Важной проблемой в in silico исследовании белок-белковых взаимодействий является отсутствие критерия, позволяющего различить комплексы, существующие in vivo, и комплексы, являющиеся артефактами кристаллизации. Комплексы взаимодействующих in vivo белков должны быть достаточно прочными, чтобы сохранять свою структуру при биологических концентрациях рецептора и лиганда. Однако экспериментальные данные об их стабильности доступны не всегда. Существует несколько эмпирических подходов, с помощью которых можно связать различные физико-химические характеристики поверхности белков с их способностью образовывать прочные белок-белковые комплексы [224]. Так, показано, что поверхности контакта прочно связывающихся белков обычно более гидрофобны и характеризуются большей площадью, чем поверхности контактов в слабых комплексах [225-227].
При помощи ресурсов сервера ProtorP [228] проведен анализ поверхности контактов комплекса HCRS 21-а-химотрипсин, учитывающий такие характеристики взаимодействий, как количество, тип и положение взаимодействующих а.о., размер поверхности контактов, природу взаимодействия (табл. 5). Значение
Поверхность контактов образуют 122 атома, принадлежащие сорока двум а.о., ее площадь составляет 1408,92 А , что соответствует экспериментально установленным параметрам для устойчивых фермент-ингибиторных комплексов с площадью поверхности контактов «стандартного размера», порядок Kd которых составляет в среднем 10" М [229].
Как отмечено в литературном обзоре, механизм катализа сериновых протеиназ детально изучен с помощью метода рентгеноструктурного анализа на примере а-химотрипсина, который является представителем группы ферментов, осуществляющих гидролиз субстрата при участии боковых цепей остатков «каталитической триады» (His57, Aspl02 и Serl95) и амидной группы Glyl93 (см. литературный обзор п. 2.5.1.2). Анализ аминокислотных остатков межмолекулярного интерфейса полученной структурной модели комплекса выявил, что в комплексообразовании задействованы а.о. а-химотрипсина His57, Glyl93 и Serl95, причем, His57 является одним из а.о. фермента, вносящих наибольший вклад в связывание полипептидов. То есть, в образовании межмолекулярного комплекса задействованы три из четырех а.о., принимающих участие в каталитическом действии фермента. Очевидно, что в комплексно связанном состоянии а-химотрипсин не может выполнять протеолитическую функцию. Это указывает на конкурентный тип ингибирования.
Таким образом, согласно результатам молекулярного докинга, полипептид HCRS 21 и другие полипептиды Кунитц-типа Н. crispa, рассматриваемые в данной работе, образуют устойчивые комплексы с а-химотрипсином, блокируя при этом его активный центр, и, тем самым, ингибируя его каталитическую активность. Комплексы имеют архитектуру, близкую строению комплекса БПТИ-а-химотрипсин, что указывает на канонический характер взаимодействия HCGS-полипептидов с протеиназой. 3.2.5.2. Структурные модели комплексов с трипсином
Теоретические модели комплексов исследуемых полипептидов с трипсином также были построены методом жесткого белок-белкового докинга с использованием алгоритма программы PIPER [220] и кластеризации результатов на веб-сервере ClusPro 2.0 [221-223]. В качестве рецептора использовали структуру трипсина, изолированную из комплекса БПТИ-трипсин (PDB ID 2РТС [59]). В данной работе механизм взаимодействия представителей комбинаторной библиотеки Н. crispa с трипсином рассмотрен на примере комплекса HCGS 2.23-трипсин.
Архитектура полученных комплексов аналогична таковой для комплексов БПТИ-трипсин (PDB ID 2РТС [59]), а также строению рассмотренных выше структурных моделей комплексов полипептидов Н. crispa с а-химотрипсином. Однако в процессе кластеризации результатов молекулярного докинга для группы HCGS-полипептидов, входящих в кластер Б (рис. 33), были получены густонаселенные кластеры решений с низкими значениями поисковой энергетической функции (scoring function), соответствующие как каноническому строению комплексов, так и альтернативному. Для комплексов HCGS 1.11-, HCGS 2.17-, HCGS 2.34-, HCGS 2.2-, HCGS 2.23-, HCGS 2.32-, HCGS 1.14-, HCGS 2.27-, HCGS 1.4-, HCGS 1.13-, HCGS 1.20-, HCGS 1.25- и HCGS 1.48-трипсин наблюдается два типа архитектуры, в которых задействованы или связывающая петля ингибитора (рис. 35, А), или С-концевая а-спираль (рис. 35, Б).
Рисунок 35. А - Суперпозиция структурной модели комплекса HCGS 2.23-трипсин (каноническая архитектура) с кристаллической структурой комплекса БПТИ-трипсин (PDB ID 2РТС [59]). Б -Структурная модель комплекса HCGS 2.23-трипсин (альтернативная архитектура). Структуры полипептидов представлены в виде ленточных диаграмм. Аминокислотные остатки активного центра фермента показаны шаровыми моделями. Визуализация выполнена с помощью программы DS Visualiser.
В таблице 6 представлены характеристики поверхностей контактов моделей комплекса HCGS 2.23-трипсин для канонического и альтернативного вариантов архитектуры. На основании полученных данных можно сделать вывод, что комплекс с альтернативным строением по большинству характеристик поверхности контактов сопоставим, а по некоторым (AASA, количество а.о. и атомов на поверхности контактов) даже превосходит комплекс с канонической архитектурой.
Методы компьютерного моделирования и биоинформационного анализа
К настоящему времени накоплен большой массив экспериментальных данных, демонстрирующих роль клеточных рецепторов и ионных каналов возбудимых и невозбудимых мембран периферической и центральной нервной системы в процессах восприятия и передачи болевых стимулов [159]. Нарушение функционирования этих мембранных компонентов может являться причиной развития различных каналопатий и хронической боли. В связи с этим поиск и изучение молекул, специфично и селективно взаимодействующих с ионотропными рецепторами и ионными каналами, является одной из важнейших задач комплекса наук, исследующих молекулярную организацию и механизмы функционирования живых систем.
До сих пор наличие модулирующей активности в отношении болевого ваниллоидного рецептора TRPV1 и анальгетического эффекта in vivo было показано лишь для полипептидов Кунитц-типа Н. crispa, АРНС1, АРНС2 и АРНСЗ [86, 128-130, 205, 206, 269, 270]. Электрофизиологические исследования на экспрессированных в ооцитах лягушки TRPV1 и на моделях тепловой стимуляции боли показали, что, несмотря на неполное (до 35 %) ингибирование ионного канала, анальгетические полипептиды АРНС1 -АРНСЗ блокируют передачу болевого сигнала, при этом достигаемый обезболивающий эффект в сотни раз превышает эффект морфина [129, 130]. В результате недавних in vivo исследований выявлено, что, в отличие от большинства низкомолекулярных антагонистов TRPV1, полипептиды АРНС1 и АРНСЗ оказывают анальгетический эффект, сопровождаемый гипотермией [270]. Мы полагаем, это является результатом совместного действия данных полипептидов на болевой ваниллоидный рецептор и протеиназы воспаления [259, 260].
Для выявления новых анальгетических соединений, предположительно взаимодействующих с болевым ваниллоидным рецептором TRPV1, рекомбинантные полипептиды HCGS 1.10, HCGS 1.19, HCGS 1.20, HCGS 1.36 и HCRS 21 были протестированы на наличие анальгетической активности in vivo [271].
Исследование проводили на мышах линии CD-I. Было установлено, что рекомбинантные полипептиды, растворенные в 100 мкл физиологического раствора (0,9 % NaCl), при введении внутрибрюшинно не оказывают токсического действия в концентрациях до 5 мг/кг включительно [271].
Для изучения анальгетического эффекта полипептидов использовали экспериментальную модель тепловой стимуляции боли (тест отдергивания хвоста). Было показано, что полипептиды HCGS 1.36 и HCGS 1.10, как и предполагалось, оказывают анальгетическое действие на используемой модели (в концентрации 0,5 мг/кг) (рис. 52, А) [129, 130].
Анальгетические эффекты рекомбинантных полипептидов на модели тепловой стимуляции боли (тест отдергивания хвоста). А - величины анальгетического эффекта полипептидов. Б - динамика развития анальгетического эффекта полипептидов в течение часа (для концентрации 0,5 мг/кг). По оси ординат - время реакции на болевой стимул. Контроль -физиологический раствор (0,9 % NaCl). Достоверность отличий от контроля определяли тестом Тьюки (р 0.05). - Статистически достоверные различия.
Интересно, что, несмотря на высокую структурную гомологию (рис. 30), обезболивающее действие HCGS 1.36 значительно выше, чем действие HCGS 1.10. С другой стороны, анальгетические эффекты полипептидов АРНС1, АРНС2 и АРНСЗ, имеющих степень идентичности аминокислотной последовательности 92-98 %, также значительно различаются [130]. Следует отметить, что АРНС1-АРНСЗ способны понижать болевую чувствительность животных в меньших концентрациях (0,01-0,1 мг/кг) [129, 130, 270].
Выявлено, что статистически достоверный обезболивающий эффект HCGS 1.36 и HCGS 1.10 развивается в течение первых 10-20 минут и продолжается, по меньшей мере, в течение часа (рис. 52, Б). Подобная динамика развития анальгетического действия наблюдается и для полипептидов HCGS 1.19 и HCGS 1.20 [129, 130, 271].
Наряду с высокой общей гомологией аминокислотных последовательностей полипептидов Кунитц-типа актиний К crispa и S. helianthus (более 74 %), последовательности HCGS 1.20 и HCGS 1.19 отличаются от таковых группы АРНС1 по ряду положений (14, 38, 48 и 9, 12, 14, 38, 48 соответственно). Однако именно в этих положениях последовательности HCGS 1.20 и HCGS 1.19 имеют идентичные остатки с последовательностями ингибиторов сериновых, аспарагиновых и цистеиновых протеиназ SHPI-1 и SHPI-2 из S. helianthus [133, 134] (рис. 30). Логично предположить, что полипептиды HCGS 1.19 и HCGS 1.20 могут проявлять аналогичную активность. С другой стороны, степень идентичности аминокислотной последовательности ингибитора трипсина и химотрипсина InhVJ с последовательностью АРНС1 составляет 95 %, однако ранее было установлено, что InhVJ не оказывает модулирующего действия на болевой ваниллоидный рецептор TRPV1 [128]. К сожалению, в настоящее время данные о наличии анальгетической активности ингибиторов протеиназ Кунитц-типа InhVJ, SHPI-1 и SHPI-2 отсутствуют.
Согласно результатам анализа электростатических свойств (см. п. 3.2.4), HCGS 1.10 и HCGS 1.36 входят в одну группу с анальгетическими полипептидами Н. crispa АРНС1-АРНСЗ, которые характеризуются точечным распределением зарядов на поверхности молекулы. Полипептиды HCGS 1.19 и HCGS 1.20, напротив, группируются с положительно заряженными полипептидами SHPI-1 и SHPI-2. В рамках предложенной модели взаимодействия АРНС1 с TRPV1 такой характер распределения заряда препятствует, согласно расчетам, распознаванию полипептидного лиганда рецептором (см. п. 3.2.5.4) [218].
Интересно, что полипептиды HCGS 1.19 и HCGS 1.20, вопреки ожиданиям, оказывают достоверное обезболивающее действие в экспериментах in vivo (рис. 52, А), сравнимое с действием HCGS 1.10 и HCGS 1.36 (соответственно) [271]. Этот факт косвенно свидетельствует, что анальгетическое действие полипептидов Кунитц-типа Н. crispa обусловлено не только модуляцией болевого рецептора TRPV1. Следует отметить, что наиболее подробно охарактеризованный ингибитор сериновых протеиназ семейства Кунитца, БПТИ, использованный в качестве контроля опосредованного влияния на процесс передачи болевого сигнала, не проявляет анальгетической активности и не взаимодействует с рецептором TRPV1.
Установлено, что полипептид HCRS 21, как и предполагалось (ввиду наличия Thrl4 в положении Pi, как и у всех полипептидов анальгетического кластера, рис. 33, В2), оказывает обезболивающее действие на модели тепловой стимуляции боли (рис. 53, А), сравнимое с действием HCGS 1.36 и HCGS 1.20 (рис. 52, А). Выявлено, что динамика развития анальгетического действия HCRS 21 подобна таковой для HCGS-полипептидов (рис. 53, Б). Таким образом, впервые показано наличие анальгетической активности у HCRG-полипептида.
Анальгетический эффект HCRS 21 на модели тепловой стимуляции боли (тест отдергивания хвоста). А - величины анальгетического эффекта HCRS 21 при концентрациях 0,5, 2,5 и 5 мг/кг. Б - динамика развития анальгетического эффекта HCRS 21 в течение часа (для концентрации 0,5 мг/кг). По оси ординат - время реакции на болевой стимул. Контроль -физиологический раствор (0,9 % NaCl). Достоверность отличий от контроля определяли тестом Тьюки (р 0.05). - Статистически достоверные различия.
Принимая во внимание результаты компьютерного анализа структуры, оценки физико-химических характеристик и электростатических свойств исследуемых полипептидов Кунитц-типа [218], нельзя утверждать, что их анальгетическое действие обусловлено только взаимодействием с TRPV1. Возможно, данные полипептиды повышают барьер болевой чувствительности, взаимодействуя с другими молекулярными мишенями. Полученные данные хорошо согласуются с предложенной гипотезой о том, что купирование боли анальгетическими полипептидами Кунитц-типа является результатом их совместного действия как на сам болевой рецептор TRPV1, так и на протеиназы нейтрофилов, эластазу, катепсин G и протеиназу 3 [259, 260], которые играют ключевую роль в воспалительных процессах. Вопрос взаимодействия полипептидов данной группы с TRPV1 на молекулярном уровне остается предметом дальнейших исследований.
Таким образом, показано наличие аналъгетической активности у ряда представителей комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа Н. crispa, HCGS 1.10, HCGS 1.19, HCGS 1.20, HCGS 1.36 и HCRS 21. Полученные результаты в комплексе с in vitro и in silico данными дают основу для понимания связи между структурой и функцией полипептидов Кунитц-типа, установления путей их эволюционной диверсификации и специализации. Кроме того, эти результаты расширяют базис знаний, необходимых для создания новых высокоэффективных аналъгетических препаратов направленного действия и решения проблемы терапии болевых состояний.