Введение к работе
Актуальность темы. Актинопорины - белковые цитолизины (20 кДа), продуцируемые ядовитыми морскими кишечнополостными, актиниями, принадлежат к группе а-пороформирующих токсинов (а-ПФТ) (Parker and Feil, 2005). Огромный интерес исследователей к этим белкам обусловлен наличием у них уникальной пространственной структуры - высоко консервативного фолда Р-сэндвича и N-концевой а-спирали, способных претерпевать конформационные перестройки при переходе белка из водорастворимого в мембраносвязанное состояние, в котором он осуществляет свое пороформирующее действие. С мембранолитическим действием связывают широкий спектр биологической активности актинопоринов: противоопухолевой, кардиостимулирующей, дерматонекротической, антипаразитарной (Turk, 1991). В последние годы а-ПФТ актиний используют для создания потенциальных фармакологических агентов -химерных молекул, представляющих собой иммуноконьюгаты актинопоринов (либо их фрагментов, например, N-концевого участка) с лигандами (моноклональными антителами, гормонами или факторами роста) (Tejuca et al., 2009). Действие этих конъюгатов направлено на биологические мишени, мембраны опухолевых и паразитарных клеток. а-ПФТ являются незаменимыми инструментами исследования структурной организации и механизмов функционирования биологических и модельных мембран (Чантурия и др., 1990; Shnyrov et al., 1992; Parker and Feil, 2005). Проявляемые актинопоринами фармакологические эффекты свидетельствуют о том, что эти белки связываются не только с липидными, но и с белковыми компонентами мембран, интегринами, посредством RGD-мотива (трипептида: аргинин-глицин-аспарагиновая кислота), что может быть использовано для получения противоопухолевых агентов нового поколения.
Повышенный интерес к изучению взаимосвязи структуры и функции актинопоринов связан, в первую очередь, с необходимостью более глубокого понимания механизма действия этих мембраноактивных белков, играющих важную экологическую и алломональную роль в морском биоценозе. Дальнейшего изучения требует также феномен мультигенности актинопоринов, обнаруженный недавно у актинии Heteractis magnified (Wang et al., 2008). В настоящее время перспективным и актуальным методом исследования является сайт-направленный мутагенез, который позволяет выяснить ключевую роль аминокислотных остатков (а.о.) актинопоринов в функционально значимых участках молекулы, вовлеченных в различные этапы порообразования (N-концевой а-спирализованный фрагмент, фосфорилхолиновый (РОС)-сайт связывания и RGD-мотив).
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было установление структурно-функциональных взаимосвязей представителей мультигенных семейств пороформирующих токсинов актинии Heteractis crispa. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
выделить и идентифицировать нативные актинопорины;
получить нуклеотидные последовательности и установить на их основе аминокислотные последовательности актинопоринов семейств Hct-A и Hct-S;
создать генетические конструкции генов актинопоринов для гетеро логичной экспрессии в бактериальной системе и получить рекомбинантные белки;
определить физико-химические характеристики рекомбинантных белков и сравнить их с характеристиками нативных актинопоринов;
выполнить сайт-направленный мутагенез функционально значимого участка молекулы актинопорина - RGD-мотива;
(6) провести структурно-функциональный и филогенетический анализ актинопоринов.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В ходе работы выделен новый актинопорин из Н. crispa, последовательность N-концевого фрагмента которого (20 а.о.) отличалась от ранее установленной последовательности нативного актинопорина RTX-SII, выделенного из Н. crispa (=Radianthus macrodactylus). Методами молекулярной биологии установлены нуклеотидные последовательности и на их основе выведены аминокислотные последовательности представителей двух семейств актинопоринов, имеющих N-концевые остатки аланина (Hct-A семейство) и серина (Hct-S семейство). Получено семь рекомбинантных изоформ актинопоринов, различающихся значениями изоэлектрических точек, параметрами гидрофобности и количеством и локализацией заряженных а.о. N-концевых функционально значимых фрагментов, а также величиной гемолитической активности. Впервые проведен сайт-направленный мутагенез RGD-мотива актинопорина Н. crispa. Получены три мутантные формы актинопорина в виде телец включения. Выполнен структурно-функциональный анализ, который позволил установить важную роль для необратимого связывания с мембраной а.о.: Arg53, Тугі 13, Туг 133, Туг 138 и/или Туг 137, участвующих в образовании водородных, ионных, С-Н...л;-взаимодействий с фосфорилхолиновой головкой липидов, а также положительно и отрицательно заряженных остатков в N-концевом фрагменте актинопоринов для порообразующей активности белка. Полученные данные являются основой для дизайна новых структур молекул актинопоринов с заданной активностью с целью их биотехнологического получения и применения.
Основные положения, выносимые на защиту.
Новый представитель актинопоринов актинии Н. crispa отличается от нативных актинопоринов, выделенных ранее из этого вида актинии, N-концевой аминокислотной последовательностью, молекулярной массой и значением изоэлектрической точки.
Семейства актинопоринов Hct-A и Hct-S актинии Н. crispa являются мультигенными.
Актинопорины Н. crispa на филогенетическом дереве группируются в несколько кластеров. Представители семейств актинопоринов Hct-A и Hct-S не формируют собственных, но входят в состав одних и тех же кластеров.
Рекомбинантные актинопорины Н. crispa отличаются друг от друга по величине гемолитической активности, что обусловлено различиями в количестве и локализации заряженных аминокислотных остатков в функционально значимом N-концевом фрагменте молекул.
Остатки Туг в положениях 113, 133, 138, входящие в РОС-сайт связывания актинопоринов, а также а.о. Arg53 и Serl05 вовлечены в процесс прочного связывания белков с цитоплазматической мембраной.
Апробация результатов. Результаты работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: XI Международной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, г. Владивосток, 2007; I Дальневосточном симпозиуме с международным участием «Науки о жизни», г. Владивосток, 2008; III Международной конференции «Химия, структура и функция биомолекул», г. Минск, 2008; VIII региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего востока России, г. Владивосток, 2008; XII и XIII Всероссийских молодежных школах-конференциях по актуальным проблемам химии и биологии, г. Владивосток, 2009 и 2010; Международном семинаре по
морским природным ресурсам, г. Ханой, 2010; V Российском симпозиуме «Белки и пептиды», г. Петрозаводск, 2011; 9-м Международном конгрессе по токсинологии, г. Владивосток, 2011.
Публикации. Соискателем опубликовано 14 работ, из них все по теме диссертации, в том числе 6 статей, из них 2 в журналах, определенных списком ВАК, 4 в сборниках научных трудов по материалам конференций и 8 тезисов докладов в сборниках трудов региональных, всероссийских и международных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 181 цитируемую работу. Диссертационная работа изложена на 102 страницах машинописного текста и содержит 8 таблиц и 43 рисунка.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.х.н., зав. лаб. Козловской Э.П., сотрудникам ЛХП: д.х.н. Монастырной М.М. за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы и обсуждении результатов, к.х.н. Лейченко Е.В. за практическую помощь и постоянное внимание к работе и к.ф-м.н. Зелепуга Е.А. за проведение работ по молекулярному моделированию и участие в обсуждении результатов, а также сотруднику лаборатории морской биохимии к.м.н. Исаевой М.П. за неоценимую помощь в проведении экспериментов по молекулярной биологии, за критический анализ текста диссертации и автореферата. Автор также благодарен сотрудникам других лабораторий за помощь в выполнении отдельных этапов работы: к.ф-м.н. Лихацкой Г.Н., м.н.с. Гузеву К.В, к.б.н. Черникову О.В., к.х.н. Дмитренку П.С, к.х.н. Анастюку С.Д.
