Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. GFAP - глиофибриллярный кислый протеин 9
1.2 Иммуноферментые системы для количественного определения антигена в биологических жидкостях 27
1.3 Диагнстическая ценность количественного определения GFAP в биологических жидкостях 32
1.4 Заключение 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1 Методы молекулярной биотехнологии 41
2.1.1 Полимеразная цепная реакция 41
2.1.2 Применение эндонуклеаз рестрикции в технологии рекомбинантных ДНК 46
2.1.3 Плазмидные вектора и лигирование вставки 47
2.1.4 Экспрессия трангенных белков в прокариотической системе 49
2.1.5 Выделение рекомбинантных белков имеющих в своем составе гексагистидиновый мотив 51
2.1.6 Метод аналитического диск-электрофореза в полиакриламидном геле 52
2.2 Иммунохимические методы 54
2.2.1 Метод иммунодиффузионного анализа 54
2.2.2 . Метод иммуноблот анализа 54
2.2.3 Методы иммуноморфологического анализа 56
2.2.4 Метод твердофазного иммуноферментного анализа для количественного определения белков 58
Глава 3. Результаты собственных исследований 63
3.1 Клонирование и экспрессия GFAP в вектор pet28a и экспрессия в штамме DE3-BL21. Иммунохимическая характеристика рекомбинантного GFAP 63
3.2. Получение и иммунохимическая характеристика моно- и поликлональных антител, полученных путем иммунизации рекомбинантным препаратом GFAP 76
3.3. Разработка сэндвич варианта ИФА анализа для количественного определения концентрации GFAP в биологических жидкостях 89
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 95
Глава 5. Выводы 102
Список литературы
- GFAP - глиофибриллярный кислый протеин
- Полимеразная цепная реакция
- . Метод иммуноблот анализа
- Получение и иммунохимическая характеристика моно- и поликлональных антител, полученных путем иммунизации рекомбинантным препаратом GFAP
Введение к работе
Актуальность исследования. Возрастающий интерес к проблеме получения рекомбинантных нейроспецифических белков обусловливается, прежде всего, их высокой диагностической значимостью как критериев оценки проницаемости гематоэнцефалического барьера при заболеваниях ЦНС [Aurell А. 1991; Blennow М. 1995,1996; Dotevall L. 1996; Hermann М. 2000; Чехонин В.П. 2001; Van Geel W. J. 2002, Herrmann 2003; Jauch E. 2000; Kristjansdottir R. 2001; Sporer B. 2004; Vissers J.L. 2006, Wunderlich M.T. 2006, Foerch C. 2006, Roseng-ren L. 2007, Heckl S. 2007, Notturno F.2008, Mullett S.J. 2008]. Практически любой патологический процесс в ЦНС приводит к реактивному астроглиозу - выраженной активации астроглиального компонента нервной ткани [Fitch M.T. 2008]. Наиболее ярким проявлением реактивного астроглиоза на молекулярно-биологическом уровне является резкое увеличение экспрессии GFAP в активированных астроцитах [Blomstrand С. 1995, Hill М. 2000, Brahmachari S. 2006]. Дальнейшее развитие патологического процесса приводит к гибели реактивных астроцитов, вследствие чего нарушается резистентность клеточной мембраны и GFAP (белок промежуточных филаментов астроцитов) оказывается в межклеточной жидкости, откуда элиминируется в кровоток и ликвор пациента, несмотря на его внутриклеточную локализацию. Подобный «прорыв» GFAP в биологические жидкости организма возможен лишь при заболеваниях, сопровождающихся нарушением резистентности гемато-энцефалического барьера [Blennow М. 1995,1996, Чехонин В.П. 2001, Chekhonin V. 2002, Rosengren L. 2007, RosenfeldR. G. 1987]. Таким образом, количество GFAP в биологических жидкостях может напрямую зависеть от количества погибших или поврежденных астроцитов, что, в свою очередь, отражает степень выраженности нейроде-генераторного процесса [Lamers К. J. 2003; Petzold А. 2004, Notturno F.2008, Mullett S.J. 2008]. Используя метод количественного иммуноферментного анализа для определения GFAP в крови и ликворе, в динамике развития патологического процесса, представляется возможным создать систему получения дос-
товерной объективной информации не только о наличии процесса как такового, но и о динамических особенностях течения заболевания и что особенно важно и перспективно оценить эффективность применяемой терапии. В связи с этим, биотехнологические аспекты получения необходимых количеств высоко-очищенного и абсолютно идентичного препарата белка, несомненно, являются определяющими при разработке способов количественного скриннингового определения его диагностически значимых количеств в биологических жидкостях пациентов (Чехонин В.П. 2001,2007, Jung CS 2007., Sarthy V.2007, Foerch С.2006). Всем этим требованиям полностью удовлетворяет рекомбинантный препарат GFAP, позволяющий разработать высокоточную, воспроизводимую и, что особенно важно, биотехнологически стандартизованную систему его имму-ноферментного определения для практического здравоохранения.
Цель исследования: Получить и охарактеризовать рекомбинантный GFAP человека, иммунохимически идентичный нативному антигену и разработать иммуноферментный анализ для количественного определения GFAP в биологических жидкостях человека на основе рекомбинантного GFAP и антител полученных при иммунизации данным белком.
Задачи исследования:
Клонировать кДНК hGFAP в вектор рЕТ28-а, и получить штамм-продуцент, обладающий способностью к биосинтезу рекомбинантного белка с высоким уровнем эффективности.
Разработать метод очистки рекомбинантного белка из первичного биоматериала с высоким уровнем гомогенности и максимальным выходом.
Провести сравнительный иммунохимический анализ нативного и рекомбинантного препарата GFAP с использованием коммерческих препаратов антисывороток.
Получить поликлональные и моноклональные анти-GFAP антитела и иммунохимически охарактеризовать их.
5. Разработать метод количественного иммуноферментного анализа
GFAP на основе рекомбинантного препарата и соответствующих поли- и мо-ноклональных антител в биологических жидкостях и протоколы для иммуноги-стохимического анализа GFAP на гистологических срезах и в культуре клеток.
Научная новизна.
Впервые показано, что рекомбинантный GFAP обладает идентичными нативному белку иммунохимическими и иммуногенными свойствами, а препараты моноклональных и поликлональных антител полученных в результате иммунизации рекомбинантным GFAP идентичны антителам, традиционно получаемым иммунизацией нативным белком.
Впервые создан и стандартизован сэндвич вариант твердофазного ИФА для определения концентрации GFAP в биологических жидкостях человека на основе рекомбинантного препарата GFAP и полученных к нему антител.
Практическая значимость: Разработанная иммуноферментная тест-система анализа GFAP характеризуется высоким уровнем технологичности. Все антительные компоненты системы получены при иммунизации животных рекомбинантным GFAP, что позволяет их стандартизовать и накапливать в необходимых количествах. Данная тест-система позволяет воспроизводимо, специфично и надежно осуществлять количественный мониторинг функциональной и структурной целостности ГЭБ при нервных и психических заболеваниях, а также других поражениях ЦНС (болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, различные формы менингитов и энцефалитов), опухолях и травмах головного мозга. Анализ результатов количественного скрининга и мониторинга GFAP в сыворотке крови больных дает возможность рекомендовать его для дополнительной диагностики, прогноза течения заболевания и оценки эффективности проводимой терапии.
Положения, выносимые на защиту:
Клонирование кДНК hGFAP в вектор рЕТ28а и последующая экспрессия в штамме Е. coli (DE3 BL21) позволяет выделять рекомбинантный GFAP иммунохимически идентичный нативному антигену.
Поликлональные и моноклональные антитела, полученные к реком-бинантному GFAP идентичны антителам, получаемым к нативному антигену.
На основе рекомбинантного GFAP и антител полученных к нему может быть разработан твердофазный сэндвич вариант ИФА для количественного определения концентрации GFAP в биологических жидкостях человека.
Внедрение результатов исследования: Разработанный иммунофермент-ный анализ активно применяется в лаборатории иммунохимии отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГЕПДССП Росздрава» для изучения иммунохимических аспектов патогенеза нервных и психических заболеваний.
Полученные антитела активно применяются для иммуногистохимических исследований мозга экспериментальных животных с целью оценки степени выраженности неиродегенеративных процессов при моделировании различных патологических состояний, а также для разработки липосомальных контейнеров векторного типа, способных транспортировать диагностические и терапевтические препараты в заинтересованную область ЦНС.
Апробация материалов диссертационного исследования. Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на заседании проблемного совета по фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГНЦССП Росздрава».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ: 4 - в журналах рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, 1 - глава в монографии .
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 схемами, 21 рисунком, 1 табли-
цей. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы отражающей результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (160 источников из них 4 отечественных и 156 зарубежных авторов). Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован автором лично.
GFAP - глиофибриллярный кислый протеин
GFAP {glial fibrillary acidic protein) - глиофибриллярный кислый протеин является белком промежуточных филаментов и экспрессируется преимущественно в астроглиальных клетках нервной системы. История изучения глиофибриллярного антигена близко связана с исследованиями группой L.Eng [1] спектра липидов в ткани мозга пациентов, страдающих рассеянным склерозом. Как известно, рассеянный склероз является заболеванием центральной нервной системы и характеризуется демиелинизацией, интенсивным реактивным глиозом и формированием рубца на месте лишенных аксональной миелиновой оболочки нейронов. Группа L. Eng применяла традиционные биохимические методы для изучения белков, входящих в состав склеротических бляшек. После гомогенизации и делипидизации белки растворяли в феноле с муравьиной кислотой и подвергали препаративному электрофорезу. Белки, экстрагированные из отдельных белковых зон, использовались для иммунизации кроликов с целью получения поликлональных антисывороток. Было обнаружено, что поликлональные антитела, полученные при иммунизации лабораторных животных белком с молекулярной массой 50 кДа, позволяют обнаруживать астроциты при иммуногистохимическом изучении ткани головного мозга. Выделенный впоследствии белок был назван глиофибриллярным кислым протеином - GFAP.
Идентификацию и изучение GFAP затрудняли его малая растворимость в водных растворах, склонность к агрегации и полимеризации, восприимчивость к нейтральным протеазам. Характерно, что лишь относительно малые количества GFAP можно обнаружить в растворимой форме в нормальном головном и спинном мозге и в культурах астроцитов. Ранние сообщения о растворимых препаратах GFAP, полученных из ткани мозга умерших людей и лабораторных животных, основывались на работах, в которых не контролировалось время между смертью и получением препарата. Низкомолекулярные, растворимые формы GFAP в этих случаях, по-видимому, являлись продуктами действия тканевых протеиназ. Однако уже в 1969 году в нейрохимической лаборатории Стэнфордского медицинского центра был определен полный аминокислотный состав белка, позднее идентифицированного как GFAP. Результаты исследования были представлены на втором симпозиуме Международного общества нейрохимии в Милане [2]. Аминокислотный состав GFAP характеризуется относительно большим содержанием остатков моноаминодикарбоновых аминокислот (аспарагиновой и глутаминовой), а также лейцина, глицина и аланина, что хорошо согласуется с значениями изоэлектрической точки (при рН 5,7-5,9) и высокой анионообменной способностью. N-концевым остатком является аланин или блокированный метионин. Сравнение первичной структуры GFAP с аминокислотными последовательностями двух других представителей группы белков промежуточных филаментов — виментином и десмином — выявило их гомологичность на 67 и 65%, соответственно [2].
Получение очищенного препарата GFAP позволило изучить его физико-химические свойства [5]. GFAP экстрагируется из тканей хлороформно-метанольными смесями без существенных изменений иммунохимических характеристик [4]. Водорастворимая фракция GFAP извлекается из ткани мозга фосфатным буфером в количестве 15 - 20% от его общего содержания в ткани. GFAP стабилен в экстракте при многократном замораживании и оттаивании в течение 24-часовой инкубации при 37С, а также при минутном кипячении. Из растворов он легко осаждается 2,5%-ной трихлоруксусной кислотой, сульфатом аммония при концентрациях последнего, превышающих 25% насыщения, а также при изменении рН раствора до области изоэлектрической точки. GFAP активно связывается с анионообменниками, элюируясь с них при 250-400 мМ NaCl. В 0,01-0,1 М буферных растворах с рН 6-8 белок не адсорбируется фосфоцеллюлозой, но хорошо связывается с гидрофобными сорбентами типа фенилсефарозы (с элюцией 2%-ным тритоном Х-100) [21].
Для GFAP характерна высокая специфичность и антигенность эпитопов. При химическом анализе очищенных препаратов GFAP было установлено отсутствие углеводных компонентов. Как у многих фибриллярных белков иммуногенные домены GFAP формируются первичной аминокислотной последовательностью белка, поэтому даже при практически полном гидролизе низкомолекулярный пептидный дебрис сохраняет способность связывать анти-GFAP антитела. Однако, инкубация с протеолитическими ферментами (трипсин, химотрипсин) приводит к полной деградации с утратой иммунохимических характеристик [4]. Аналогичным образом действуют и некоторые эндогенные нейтральные и Са2+-зависимые протеазы, содержащиеся в гомогенатах тканей и образцах биологических жидкостей, анализируемых на содержание GFAP (особенно при травматических повреждениях центральной нервной системы).
С некоторыми образцами антисывороток была показана полная иммунохимическая идентичность препаратов GFAP человека, быка и свиньи, однако, при использовании высокоаффинных поликлональных антисывороток и моноклональных антител к человеческому, свиному и бычьему GFAP было установлено наличие в его молекулах видоспецифичных эпитопов.
Регуляция экспрессии GFAP Впервые последовательность мРНК, кодирующей мышиный GFAP, была определена в лаборатории N. Cowan в 1984 году [1]. Проводя скрининг кДНК библиотеки из мозга мыши, был обнаружен клон, содержащий вставку размером 2,5 тысяч пар нуклеотидов, кодирующий белок, имеющий более 97% гомологии с аминокислотной последовательнеостью GFAP. 3"-конец данной кДНК содержал фрагмент нетранслируемой области размером 1,4 т.п.н. Картирование гена GFAP мыши было выполнено группой Bernier [143] в 1988 году. Для определения соответствующего локуса на хромосоме использовали метод гибридизации с кДНК GFAP. Далее был осуществлен анализ поли 12 морфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ) и показано, что GFAP кодируется одним локусом, расположенным на 11 хромосоме. Данный ген находится в непосредственной близости от генов, кодирующих р53 и мие-лопероксидазу. Методом блот-гибридизации по Саузерну группа Bongcam-Rudloff [144] в 1991 году картировала ген GFAP у человека в положении 17q21. Эти данные подтверждены группой Brownell [145] методом гибридизации. Ген состоит из девяти экзонов длиной около 10 т.п.н., с которых транскрибируются матричные РНК размером около трех тысяч нуклеотидов.
Регуляторные последовательности были проанализированы в экспериментах in vitro на астроглиальных клеточных линиях и экспериментах in vivo на трансгенных мышах. Для мышиного GFAP были определены промотор и сайт инициации транскрипции [7]. В этих исследованиях использовали ген люцифе-разы под контролем мутантных промоторных последовательностей GFAP, содержащих случайные делеции. Было установлено, что последовательности, отвечающие за тканеспецифичную экспрессию, находятся в пределах 256 п.н. от сайта инициации транскрипции гена GFAP. Используя метод ДНК футпринтин-га ("DNase footprinting"), были охарактеризованы 3 сайта связывания транскрипционных факторов - GFI (-104 - -82), GFII (-124 - -104) и GFIII (-163 - -140).
Полимеразная цепная реакция
Во втором раунде двухцепочечную ДНК, состоящую из исходной и ново-синтезированной («длинная матрица») цепей, опять подвергают денатурации, а затем отжигают с праймерами. Во время синтеза в этом раунде вновь синтезируются «длинные матрицы», а также некоторое количество цепей с праймером на одном конце и с последовательностью, комплементарной второму праймеру, на другом («короткие матрицы»). Во время третьего раунда все гетеродуплек-сы, образовавшиеся ранее, одновременно подвергаются денатурации и отжигу с праймерами, а затем реплицируются. В последующих раундах «коротких матриц» становится все больше, и к 30-му раунду их число уже в 106 раз превышает число исходных цепей или «длинных» матриц.
Метод ПНР получил широкое распространение. С появлением ПЦР отпала необходимость в выделении и очистке ДНК-мишени; для анализа можно использовать очень небольшое количество неочищенного материала. Для синтеза праймеров, специфичных в отношении исключительно ДНК-мишени, нужно знать нуклеотидную последовательность интересующей ДНК. В этом случае в ходе ПЦР будет амплицицироватъся только фрагмент ДНК, длина которого равна суммарной длине двух праймеров и фрагмента ДНК между ними. ПЦР -высокочувствительный метод, поэтому при наличии в исследуемом образце даже ничтожного количества ДНК, случайно попавшей из одной реакционной смеси в другую, могут быть получены ложноположительные результаты. Это заставляет тщательно контролировать все используемые для ПЦР растворы и посуду.
Метод ПЦР применяется также для выявления спонтанных мутаций, внесения специфических мутаций in vitro, сборки полноразмерных генов из синтетических олигонуклеотидов, секвенирования ДНК. Во многих случаях возникает необходимость в клонировании ПЦР-продукта. Однако, прямое клонирование с помощью лигирования по тупым концам затруднено, поскольку полиме-раза Taq присоединяет к 3 -концу синтезируемой цепи лишний адениннуклео-тид, что снижает эффективность лигирования. В тоже время, если вектор для клонирования обработать рестрицирующей нуклеазой с образованием новых тупых концов и затем проинкубировать с полимеразой Taq в присутствии dTTP, то к обоим З -концам фрагментов добавится по одному тимидиннуклеотиду. Взаимной комплементарности концевых участков вектора и ПЦР-продукта протяженностью в один-единственный нуклеотид оказывается достаточно для спаривания молекул и их последующего лигирования.
Способность синтезировать ДНК на матрице РНК в определенных условиях была продемонстрирована для термостабильной ДНК- полимеразы Thermus thermophiliis . Это позволяет использовать ее для прямого обнаружения специфических РНК в биологических образцах методом ПЦР. Современные модификации такого подхода дают возможность в одной реакционной смеси (в пробирке) синтезировать в реакции обратной транскрипции небольшое число копий амплифицируемого фрагмента ДНК на матрице РНК, которые сразу же используются тем же ферментом в качестве матрицы в обычной ПЦР (one tube PCR).
С помощью ПЦР можно получать комплементарные ДНК (кДНК), отвечающие У- или 5 -концевым участкам специфических информационных РНК (мРНК). Для обозначения этого метода используется сокращение RACE - от англ. Rapid amplification of cDNA ends (быстрая амплификация концов кДНК). Обозначения 3 RACE и 5 RACE относятся к амплификации кДНК, отвечающих соответствующим концам мРНК. В обоих случаях для проведения ПЦР-амплификации нужно знать нуклеотидную последовательность кодирующей области мРНК-мишени, чтобы синтезировать генспецифичный праймер (GSP). В случае 3 RACE праймером для синтеза первой цепи кДНК служит oligo(dT) с присоединенным к нему вторым праймером. Oligo(dT) спаривается с poly(A)-хвостом мРНК, и обратная транскриптаза синтезирует цепь, комплементарную мРНК. Вторая цепь кДНК синтезируется на первой при участии GSP, комплементарного кодирующей области данной мРНК, с помощью полимеразы Taq. По завершении нескольких раундов ПЦР, в которых использовались указанные выше праймеры, добавляют вторую пару праймеров, которые связываются по соседству с двумя первыми. Такие, тесно расположенные праймеры называются внутренними. Вторая пара праймеров необходима, поскольку без них нельзя амплифицировать полноразмерную молекулу-мишень. Конечным ПЦР-продуктом является кДНК, соответствующая 3 -концу искомой мРНК.
В случае 5 RACE праймером для синтеза первой цепи кДНК служит GSP. Новосинтезированную цепь обрабатывают концевой дезоксинуклеотидил-трансферазой в присутствии dATP. Этот фермент случайным образом присоединяет дезосирибонуклеотиды к З -концу цепи. Поскольку в данном случае в реакционной смеси присутствует только dATP, на этом конце появляется цепочка аде-ниновых остатков - ро1у(А)-хвост. С ним спаривается праймер p-oligo(dT), инициирующий синтез второй цепи. Проводят ограниченное число раундов ПЦР с указанными праймерами, затем добавляют вторые праймеры и амплифицируют кДНК, отвечающую 5 -концу мРНК.
RACE-метод широко применяется по ряду причин. Обычно бывает очень трудно обнаружить кДНК, соответствующую мРНК, которая присутствует в данной ткани в маленькой концентрации. С помощью RACE-метода можно быстро получить кДНК, отвечающие концевым участкам этой мРНК, и при необходимости использовать их в качестве зондов для скрининга кДНК и геномных библиотек. Кроме того, поскольку неполноразмерные З -концевые фрагменты кДНК значительно преобладают над полноразмерными, 5 RACE может восполнить недостающие 5 -концевые сегменты.
Получение генов с помощью ПЦР - гораздо более быстрый и экономичный метод, чем тот, который основан на отжиге олигонуклеотидов с перекрывающимися концами, заполнении брешей с помощью ДНК-полимеразы и сшивании разрывов ДНК-лигазой. В одной из методик конструирование гена начинается с отжига двух перекрывающихся олигонуклеотидов (А и В), отвечающих центральной части гена (рис. 5.24) [154]. После отжига образуется дуплекс с заглубленными З -гидроксильными группами, служащими точками инициации синтеза комплементарных цепей при ПЦР. Затем в реакционную смесь добавляют еще два олигонуклеотида, С и D. З -конец олигонуклеотида С идентичен 5 -концу олигонуклеотида А, а сам этот олигонуклеотид отвечает участку конструируемого гена, непосредственно примыкающему к его центральной части слева. Аналогично, З -конец олигонуклеотида D идентичен 5 -концу олигонуклеотида В и отвечает участку гена, примыкающему к его центральной части справа. После денатурации смеси и отжига образуются дуплексы с протяженными выступающими одноцепочечными сегментами, достраивающимися с З -концов. В ходе последующих раундов ПЦР образуется двухцепочечный продукт, состоящий из указанных выше сегментов, расположенных в порядке CABD. Молекула ДНК с заглубленными 5 -концамине достраивается.
. Метод иммуноблот анализа
Иммуноблоттинг (Western blot) сочетает в себе иммуноферментный анализ с переносом белков после проведения электрофореза на нитроцеллюлозную мембрану. Он был изобретен в 1979 г. H.Towbin и соавт. и в дальнейшем модифицирован R.Aebersolds и соавт., предложившими перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану с помощью электрического поля [158], [159]. Иммуиоб-лот-анализ включает в себя несколько стадий. На первой стадии проводится диск-электрофорез в полиакриламидном геле с до децил сульфатом; при этом происходит разделение белков по молекулярной массе. Затем методом блоттинга антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы. На следующем этапе на ту же мембрану с перенесенными на нее белками наносится раствор специфических антител, в нашем случае анти-GF/VP антител. После инкубации (для образования комплекса антиген-антитело) реакцию проявляют по принципу иммуноферментного анализа - нанесением вторичных антител, специфичных к первым антителам и конъюгированных с ферментом-проявителем. После образования вторичного иммунного комплекса и отмывки избытка всех несвязавшихся антител мембрана погружается в раствор субстрата, и связанный фермент-проявитель превращает его в окрашенный продукт.
Мы применяли иммуноблоттинг для сопоставления полученного GFAP с коммерческим нативным антигеном, а также для идентификации полученных нами моноклональных и поликлональных антител со стандартным препаратом GFAP, полученных коммерческим путем или нашим рекомбинантным антигеном.
Диск-электрофорез анализируемого белка при иммуноблоттинге проводили в плоском полиакриламидном геле с до децил сульфатом. Затем на верхний и нижний электроды системы электропереноса накладывали несколько слоев фильтровальной бумаги, смоченной в электродном буфере (41 мМ Трис, 40 мМ борная кислота, рН 8,3), между ними (с анодной стороны) прокладывали нит-роцеллюлозную мембрану с аккуратно уложенной на ней пластиной геля (с катодной стороны). Перенос осуществляли при напряженности поля 0,8-1 мА/см2 от 8 до 14 часов. Для выявления белковых полос, перенесенных на нитроцсл-люлозную мембрану, ее предварительно окрашивали 0,1% раствором Ponso С в 5% уксусной кислоте, затем 12 часов отмывали рабочим буфером (0,05 М Na-фосфат, 0,02 NaCl, рН 7,4) и один час инкубировали со специфическими анти-GFAP антителами. После повторной отмывки от несвязавшихся белков мембрану два часа инкубировали со вторыми антителами, входящими в состав набора для хемилюминисцентного проявления иммуноблота (Biorad). Далее мембрану экспонировали 1-2 минуты на рентгеновской пленке в темной комнате.
Смысл методов иммуноморфологического анализа заключается в использовании специфических к антигену моно- или поликлональныз антител для выявления локализации антигена в культурах клеток и на срезах органов. Метод представляет собой последовательную фиксацию, отмывку, инкубацию с первичными анти-белок интереса антителами, анти-видоспецифичными (в зависимости от источника первых антител) вторичными антителами. Вторичные ант и-тела могут быть либо конъюгированы с флуоресцентной меткой, и тогда результат анализируется методами флуоресцентной микроскопии, либо являться конъгогатом с пероксидазои, тогда проявление осуществляется с помощью хромогенных субстратов. В последнее время все активнее используется конъю-гат вторичных антител с биотином, тогда появлется дополнительный этап инкубирования: с авидин-пероксидазным комплексом.
Иммуногистохимический анализ клеток или срезов тканей является рутиной процедурой в современной лаборатории. Различают два вида такого анал и-за: иммунофлуоресцентный и иммунопероксидазный. Иммунопероксидазный анализ. Иммунопероксидазный анализ проводили с использованием высокочувствительной иммунопероксидазной системы «ABC-Vectastain» (Vector Lab., USA). При окрашивании применяли модифицированный протокол фирмы-изготовителя. Тестирование проводили на фиксированных культурах астроци-тов.
Культуру клеток отмывали от сыворотки и фиксировали ледяным метанолом в течение 10 минут при -20С. Для проведения иммунопероксидазного анализа проводили семикратную отмывку от метанола в рабочем буфере (0,05 М фосфатно-солевой буфер, рН 7,4). Для блокирования эндогенной пероксидазной активности выдерживали срезы в 3 % растворе Н2О2 на рабочем буфере в течение 5 мин. Затем инкубировали в 10 % растворе нормальной сыворотке лошади на рабочем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре на роторной мешалке. После трехкратной отмывки рабочим буфером от нормальной сыворотки лошади, фиксированную культуру инкубировали с первичными моноклональными антителами при температуре +4 С в течение 12 часов. Растворы моноклональных антител (рабочее разведение 1 : 1000) готовили на рабочем буфере с добавлением 1% нормальной сыворотки лошади.
После этого проводили трехкратную отмывку срезов в рабочем буфере и вносили биотинилированные анти-мышиные IgG лошади, предварительно адсорбированные 2 % раствором нормальной сывороткой крови крысы (в рабочем буфере с добавлением 1 % нормальной сыворотки лошади) (Vector Labs., USA). Инкубацию проводили в течение 2 часов при комнатной температуре на роторной мешалке. После трехкратной отмывки от биотинилированных антител, проводили инкубацию с препаратом комплекса авидин-биотин-пероксидаза (ABC-kit Vectstain) в течение 30 минут при комнатной температуре на роторной мешалке.
Получение и иммунохимическая характеристика моно- и поликлональных антител, полученных путем иммунизации рекомбинантным препаратом GFAP
Для получения моноклональных антител проводили иммунизацию мышей породы BALBVC, возраст 3-6 месяцев, 9. Иммунизацию осуществляли 20 мкг препарата рекомбинантного GFAP человека в 50 мкл PBS, эмульгированного в полном\неполном адъюванте Фрейнда. Иммунизацию проводили раз в 2 недели, эффективность иммунизации оценивали методом иммунодиффузии и прямого иммуноферментного анализа. Препарат вводили подкожно в основание хвоста, в район шейных лимфоузлов, вдоль брюшной цепочки лимфоузлов и в подушечки лап. Забор селезенки осуществляли на пике выработки антител, а процедуру слияния - сразу после забора селезенки.
Для получения гибридных клеток, синтезирующих моноклональные ант п-GFAP-AT, мы использовали методику Milstein С. в незначительной нашей модификации [18], [19]. Процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы: иммунизация животных; подготовка клеток миеломной линии Sp2/0 к слиянию; проведение процедуры слияния клеток миеломной линии Sp2/0 и В-лимфоцитов селезенки иммунизированной мыши; проведение процедуры селекции на среде HAT; отбор индуцирующих специфические антитела клонов; клонирование и реклонирование; массовая наработка гибридомных клеток; получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела; выделение антител. Для получения гибридом используют миеломные клеточные линии, дефектные по ферменту гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе (ГГФР1), в результате такие клетки не способны к синтезу ДНК при культивировании их в среде с гипоксантином (Н), тимидином (Т) и аминоптерином (А) (среда HAT). В результате слияния с родительскими клетками этот дефект устраняется. Только гибридные клетки способны длительно расти в среде HAT.
Перед слиянием миеломные клетки культивируют в среде с добавлением аминоптерина для удаления клеток, содержащих «нормальный» уровень ГГФРТ и которые, подобно гибридным, способны расти в среде HAT. В своей работе мы использовали миеломные клетки линии Sp2/0-Agl4. После проведения селекционного удаления ревертантных клеток, мы наращивали клетки Sp2/0 в среде RPMI-1640 («Gibco», USA) с добавлением 10 % бычьей фетальной сыворотки (FCS). Концентрация клеток в стационарной жидкой культуре составляла 105 - 106 в 1 мл.
Проведение процедуры слияния осуществляли в стерильных условиях. Иммунизированную мышь забивали путем декапитации, и выделяли селезенку, которую затем помещали в чашку Петри с охлажденной культуральной средой RPMI-1640. Селезенку измельчали скальпелем на кусочки размером 2-3 мм, гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе со средой RPMI-1640. Образовавшийся гомогенат центрифугировали (1000 g, 4 минуты), осажденные клетки ресуспендировали в 5 мл холодной среды RPMI-1640. После этого клетки осаждали центрифугированием, определяли их количество и оценивали жизнеспособность.Клетки Sp2/0-Agl4 центрифугировали (1000 g, 4 минуты) и двукратно отмывали в среде RPMI-1640.
Подготовленные таким образом плазмоцитомные клетки смешивали с клетками селезенки (соотношение клетки линии Sp2/0-Agl4 : клетки селезенки составляло 2:1, соответственно). Полученную смесь однократно отмывали в ростовой среде RPMI-1640 и осуществляли процедуру слияния.
К смеси клеток при постоянном перемешивании в течение 60 секунд по каплям добавляли 1,0 мл раствора «PEG/DMSO Hybri-Max», («Sigma», USA). После чего клетки инкубировали в течение 90 секунд. К полученной суспензии в течение 5 минут по каплям добавляли 10 мл среды DMEM без сыворотки, затем в течение 2 минут - 10 мл этой же среды, затем по каплям доводили общий объем до 50,0 мл этой же средой. Клетки осаждали центрифугированием и ре-суспендировали в 30 мл ростовой среды DMEM с добавлением 20 % FCS. Суспендированные таким образом клетки высевали в лунки культураль-ных планшетов ("Costar", USA) по 50 мкл в каждую лунку и помещали в СОг-инкубатор. Через 12 часов в каждую лунку добавляли по 50 мкл гибридомной среды HAT, приготовленной на основе коммерческой ростовой среды DMEM с добавлением тимидина (16 мМ), гипоксантина (ОД мМ), аминоптерина (0,8 мкМ), а также содержащей 20 % FCS. Такая среда является селективной по отношению к гибридным клеткам. Находясь в ней, образовавшиеся гибридомы сохраняют жизнеспособность в силу особенностей метаболизма, обусловленных родительскими предшественниками. Не слившиеся клетки такими свойствами не обладают, в результате чего происходит их массовая гибель.
